温和压力对酵母菌Saf细胞膜通透性的影响

温和压力对酵母菌Saf细胞膜通透性的影响 第28卷第2期 Vo1.28NO.2 农业科学研究 Journa1ofAgricuhura1Sciences 2007年6月 Jun.2007 0747(2007)02—0023—04 文章编号:1673— 温和压力对酵母菌Saf细胞膜通透性的影响 章中 (宁夏大学农学院,宁夏银川750021) 摘要:采用氮气为加压介质,以电导率,吸光度(OD2.,OD280)为试验指标,研究了温和压力(?2.5MPa)处理对 酵母茵Saf细胞膜通透性的影响.经配对t检验法分析发现,加压组样品的电导率,0D2e.,ODzso显着高于常压对照 组,这明温和压力处理能显着提高细胞膜的通透性.用扫描电子显微镜观察发现, 温和压力处理对微生物细胞形 态有显着影响. 关键词:压力;细胞膜通透性;酵母 中图分类号:TS201.3文献标志码:A 所有有生命的细胞都有一个表面膜与环境为界, 这个膜就是细胞膜.细胞膜是一种具有特殊结构和功 能的半透性膜,它最基本的性质是选择性通透能力, 能够控制各种不同性质的物质通过的量.细胞膜对不 同物质的通透性变化很大,气体十分容易通过细胞 膜,小分子比有相同性质的大分子容易通过,通常情 况下脂溶性较大的物质较易通过细胞膜,细胞膜对电 解质的通透性常低于非电解质.物质可能被动地通过 细胞膜扩散或可能需要消耗能量通过细胞膜. 细胞膜在细胞与环境之间的物质,能量交换及信 息传递中起着决定性作用.借助细胞膜,细胞可以根 据自身需要选择性地接受,排出某些物质.在发酵工 业中,许多酶或酶系均为胞内酶,因此人为地改变细 胞膜的通透性[1],可以加速胞外底物,营养物质的摄 入或胞内代谢产物的释放,改变细胞膜通透性是实现 胞内代谢调控,提高发酵生产率的重要手段[2]. 目前,工业实践中常用的改变细胞膜通透性的 方法有物理法和化学法[5].物理法包括空气干燥, 渗透压冲击,电处理,温度冲击,超声波处理[61和 pH扰动等.电处理法_8是近年来发展起来的一种 方法,是指在一定参数的电场作用下,在细胞膜脂双 层中形成孔洞的现象.化学法[5应用较为广泛,通 过在发酵过程中添加化学渗透剂或抗生素,改善生 产菌株的细胞膜通透性,促进产物释放. 在深层发酵中,微生物细胞总是处于0.1, 0.15MPa(罐压)下生长繁殖.啤酒发酵中,罐上层 啤酒酵母菌所受压力为0.15MPa,当考虑到液深的 影响,罐底部的酵母菌将承受0.25,0.35MPa的 压力,这说明微生物细胞能够承受一定压力的影响. 本试验对酵母菌Saf的细胞悬浮液进行了温和压力 处理,以细胞悬浮液的电导率,吸光度(ODz., OD..)的变化表征胞内电解液,核酸,蛋白质的外渗 情况,从而研究压力对细胞膜通透性的影响. 1与方法 1.1菌种 面包酵母Saf,宁夏大学生命科学学院实验室保藏. 1.2培养基 1.2.1YEPD种子培养基葡萄糖20g/L,酵母 膏10g/L,蛋白胨20g/L,pH一6.0. 1.2.2复合培养基葡萄糖40g/L,酵母膏10L, 蛋白胨20g/L,硫酸镁1.0g/L,硫酸二氢钾1.0g/L, pH=6.0. 1.3仪器 FDJK高压反应釜(300mL),天津海安县石油 科学研究仪器厂生产.752紫外光栅分光光度计,上 海精密科学仪器有限公司生产. DDS-11A型电导率仪,上海第二分析仪器厂生产. 扫描式电子显微镜,荷兰PHILIPS公司生产. 1.4菌体培养 从酵母保藏斜面上挑取2环菌体,接入YEPD 种子培养基,置于30?水浴摇床,120r/min,培养24h. 收稿日期:2006—12—28 作者简介:章中(1977一),男,江西玉山人,硕士,主要从事食品保藏学,食品营养学与 食品分析检测学研究. 24农业科学研究第28卷 种子培养基按1O的接种量接入复合培养基中, 3O?水浴摇床,120r/min,进行扩大培养24h. 1.5细胞悬浮液的制备 将发酵液4000r/min离心10min收集酵母细 胞,使用高纯水洗涤后称量湿重,制成质量比29,6的 细胞悬浮液备用. 1.6加压处理 取5OmL细胞悬浮液加入预热到3O?的高压 反应釜中,使用高纯氮气为加压介质,升压到所需压 力,保持一定时间后,取出样品待测.另取等量细胞 悬浮液常压处理,作为常压对照样. J.7样品测定 样品测定电导率后,4000r/min离心10min, 上清液在260am和280am处测定吸光度,将收集 到的酵母细胞用扫描电子显微镜观察. 1.8酵母菌存活率测定——美蓝染色法 取少许试样与0.19,6的美蓝染色液在试管中混合 染色60~90S,而后用吸管取1滴置于载玻片上,加盖 玻片后于显微镜下进行观察.有生理活性的酵母菌不 显蓝色,没有生理活性的酵母菌则被染上蓝色. 2结果与讨论 2.1加压处理时间对酵母Saf细胞膜通透性的影响 反应釜装液后即加压密封,搅拌转速为170r/min, 到预定试验时间后,卸压取样.常压对照菌悬液置于 3O?,170r/min的摇床中,用铝箔封口,以免空气 中的二氧化碳溶入菌悬液影响试验结果,取样后应 立即测定电导率,再测定0D.,0D试验所采用 的压力为1.0MPa,每隔20min取样测定电导率, 0D.和0D8.,共取样6次. 试验结果由图1,图2,图3可知,随着处理时间的延 长,加压组和常压对照组的电导率值,0?值,0?值都 不断增大,但加压组的电导率值,0?值,0?值总是大 于常压对照组,经统计分析表明(采用配对t检验法,a一 0.05):高压组的电导率值,0?值,OI值显着大于常 压对照组的电导率值,0?值,0?值,表明温和压力 可显着提高酵母菌Saf的细胞膜通透性.同时无论是加 压组还是常压对照组,其电导率值,0.值,0?值的 变化都不完全呈直线状态,这表明压力对细胞膜通透 性的影响是比较复杂的. 压力对细胞膜通透性的影响可能是因为压力改 变了细胞膜表面大分子的构像.从图4,图5的扫描 电子显微镜照片可以看出:常压对照组和高压处理 组酵母Saf细胞形态明显不同,常压对照组的酵母 细胞呈现正常的光滑圆润状态,而加压组的酵母细 胞的形态发生显着变化,细胞表面出现明显的皱折 和塌陷,与常压对照组相比,细胞的比表面积及与周 围环境的接触面积增大,并可能使得细胞膜的磷脂 双分子层变得更为疏松,从这个角度看,温和压力也 会提高细胞膜的通透性. 0 一 处理时间/rain ?一常压对照;ll--I.0SPa 图1加压时间对酵母菌Saf核酸渗出量的影响 Fig.1Effectofpressurizingtimeonpermeation ofnucleicacidofyeastSaf , g ? 瓣 曲 处理时间Imin ?一常压对照:一一1.0MPa 图2加压时间对酵母菌Saf蛋白渗出量的影响 Fig.2Effectofpressurizingtimeon permeationofproteinofyeastSaf 处理时间/rain ?一常压对照:一一1.0MPa 图3加压时间对酵母菌Saf悬浮液电导率的影响 Fig.3Effectofpressurizingtimeontheconductancerate ofthesuspensionliquidofyeastSaf 图41.0MPa处理后酵母菌Saf的形态 Fig.4MorphologyofyeastSafafter1.0MPatreatment ^黑凸0一 第2期章中:温和压力对酵母菌Saf细胞膜通透性的影响25 图5常压对照组酵母西Saf的形态 Fig.5MorphologyofyeastSafunder normalpressure 2.2不同压力对酵母Saf细胞膜通透性的影响 试验所采用压力为0.1MPa,0.5MPa,1.0MPa, 1.5MPa,2.0MPa和2.5MPa.每组试验的加压时 间均为30min.其中0.1MPa为常压对照样.试验所 用酵母来自同一批培养基.反应釜内搅拌转速为 170r/min,装液后即加压密封,到预定试验时间后, 卸压取样,常压对照菌悬液置于30?,170r/min的 摇床中,用铝箔封口,以免空气中二氧化碳溶入菌悬 液影响试验结果.取样后应立即测定电导率,再测定 0D2.,0D2..试验结果如图5. 分析表明,随着压力的增大,菌悬液的电导率, OD..,OD..显着增大,这表明温和压力显着地提高 了酵母Saf细胞膜的通透性,且压力越大对细胞膜 通透性的影响就越大,但压力的变化和酵母Saf高 纯水悬浮液的电导率,OD2OD2.的变化并不成线 性关系,这可能意味着压力大小对细胞膜通透性的 影响是多方面的. . g 鐾 褂 曲 - N ,E力/MPa ?一电导率;?—OD26o;?--OD2so 图6不同压力对酵母Saf细胞膜通透性的影响 Fig.6Effectofdifferentpressureonthe permeabilityofcellmembraneyeastSaf 2.3温和压力处理对酵母菌Saf存活率影响的研究 用美蓝染色法测定压力处理后酵母菌Saf的存活 率,用显微镜观察并拍摄照片如图7,图8.从照片可以 看到,温和压力对酵母菌Saf的存活率没有显着影响, 只有个别蓝色的死亡酵母细胞,而且这些死亡细胞均 是处于出芽繁殖期的细胞,这说明出芽繁殖期的细胞 比较容易受到压力的影响.总之,温和压力对酵母Saf 的存活率没有什么影响,而温和压力可显着提高细胞 膜的通透性,这对发酵过程显然是十分有利的. 图71.0MPa处理2h后的Saf细胞存活率 Fig7SurvivalrateofyeastSafafter1.0MPa pressuretreatmen 图82.5MPa处理0.5h后Saf细胞存活率 Fig.8SurvivalRateofyeastSafafter2.5MPa pressuretreatment 3结论 (1)温和压力能显着提高酵母Saf的细胞膜通 透性,压力越大,加压时间越长,细胞膜通透性越大. 但是压力大小和加压时间长短并不和电导率, OD2.,OD2.呈完全的线性关系.通过扫描式电子显 微镜观察发现:加压处理后的微生物细胞表面出现 明显的皱折和塌陷,失去了正常的光滑圆润形态,这 可能使得细胞膜的表面积增大并使细胞膜的磷脂双 分子层变得更为疏松. (2)温和压力处理对酵母菌Saf的存活率几乎 没有影响,温和压力处理后,酵母菌Saf的存活率几 乎为100.只有个别处于出芽繁殖期的酵母细胞 和芽体死亡. 总之,温和压力能提高酵母菌Saf细胞膜的通 透性,有利于发酵过程中底物被细胞吸收和产物释 放出细胞,从而提高发酵过程的效率和产率. 参考文献: [1]KATOM,HAYASHIR,TSUDAT,eta1.HighPres— sure-InducedChangesofBiologicalMembraneI-J].EurJ Bioehem,2002,269(1):110-118. [2]罗杰.细胞膜通透性的改变及其应用[J].微生物, 魁 26农业科学研究第28卷 [3] [4] [53 2001(3):386—389. 张和春,范卫民,张元兴,等.调节细胞通透性促进天蓝 色链霉茵蓝色素生物合成[J].应用与环境生物, 2002,8(5):540—543. 刘晓艳,丘泰球,胡爱军,等.几种物理方法对细胞膜通 透性的影响[J].生物技术,2002(2):5-6. 刘晓艳,丘泰球,黄卓烈.不同方法对酵母细胞通透性 [63 [73 [83 的影响[J].华南农业大学,2004(1):74—76. 卢群,刘晓艳,丘泰球,等.超声对酵母细胞膜通透性的 影响[J].食品与发酵工业,2005(9):14—17. 刘晓艳,丘泰球,刘石生,等.超声对细胞膜通透性的影 响及应用[J].应用声学,2002(2):26—29. 彭勇.低强度瞬态电磁场导致细胞膜穿孔的研究[D]. 成都:四川大学生命科学学院,2001. EffectsofmildpressureonthepermeabilityofcellmembraneofyeastSaf ZhangZhong (SchoolofAgriculture,NingxiaUniversity,Yinchuan750021,China) Abstract:Takingconductancerate,ODz60andOD28oastheindexes,theeffectofmildpressure(?2.5 MPa)onthepermeabilityofcellmembraneofyeastSafwasstudiedbyusingN2aspressurizinggas.The resultshowedthattheconductancerate,OD26oandOD28oofpressurizedsamplesweresignificantlyhigher thanthoseofnormalpressure,whichindicatedthatmildpressuretreatmentcouldsignificantlyenhancethe permeabilityofcellmembrane.Withthehelpofscanningelectronicmicroscope,mildpressuretreatment hadobviouseffectonthemorphologyofyeastSaf. Keywords:pressure;permeabilityofcellmembrane;yeast (责任编辑,校对武晓兰) (上接第22页) Dailyvariationoftranspiringwaterconsumption Ailanthusaltissimaunderdifferentdrou ofseedlingof tstress SongLihua,SunWensheng (SchoolofAgriculture,NingxiaUniversity,Yinchuan750021,China) Abstract:Underpot—cultivationandgreenhousecondition, offourseedlingsofAilanthusaltissimawerestudiedby dailyvariationintranspiringwater—consumption usingPrecisionElectronicBalance.Theresult showedthatthepeakofdailywaterconsumptionoftheseedlingsoccurredduring12:00pmto16:00pm. ThevalueofdailywaterconsumptionoftheseedlingofFraxinusamericanaL.wasbiggestthanothers whichwas80gPerindividual,butthevalueofdailywaterconsumptionoftheseedlingofHenanBaofeng Drovenancewassmallestwhichwas50.8gperindividua1.Thedailywaterconsumptionwasreduced largelywhenthesoilwatercontentwasreduced,butthereducingofdailywaterconsumptionOtthe seedlingsofShandongLuzhongandHenanBaofengprovenanceweresmaller. Keywords:droughtstress;seedlingofAilanthusaltissima;transpiringwaterconsumption (责任编辑,校对郑国琴)