乌珠穆沁羊生长过程中肌纤维结构特性变化的研究（可编辑）

乌珠穆沁羊生长过程中肌纤维结构特性变化的研究（可编辑） 乌珠穆沁羊生长过程中肌纤维结构特性变化的研究 分类号 TS251 学校代码 10129 U D C 577.1 学 号 2009209043 乌珠穆沁羊生长过程中肌纤维结构特性变化研究 Study on Changes of Structural Characteristics of muscle fiber during development of Wuzhumuqin sheep 申 请 人:王水清 学科门类:工 学 学科专业:农产品加工及贮藏工程 研究方向:肉品生物技术 指导教师:格日勒图 教授 论文提交日期:二?一二年四月 摘 要 肌肉的基本组成单位是肌纤维，肌纤维的组织学特性直接影响肌肉的品质。本论 文选用1 至18 月龄自然放牧条件下的乌珠穆沁羊为研究对象，利用组织学染色法， 即肌纤维结构HE 染色法和结缔组织EVG 染色法，观察随月龄增加肌纤维直径以及结 缔组织中肌内膜和肌束膜厚度的变化。利用ATPase 法区分骨骼肌中肌纤维类型并分 析其随月龄增加的变化规律。利用SDS-PAGE 分离肌球蛋白重锁 MyCH 异构体。结 果明: 随月龄的增加骨骼肌中肌纤维直径均有所增大。其中背最长肌 LD 肌纤维直径增 大幅度最缓，整体上，在9 月龄时肌纤维直径总体达到最佳阶段。 骨骼肌肌内结缔组织中肌内膜厚度不断增厚，而肌束膜厚度在三角肌 DAO 和背 最长肌中随月龄的增加而不断增厚，而肱三头肌 TB 、半腱肌 ST 和股二头肌 BF 中 肌束膜厚度在9,12 月龄之间下降，之后又开始上升。 整体上，乌珠穆沁羊骨骼肌中?型、?a 型肌纤维 红肌 含量相对较高，其中LD 中绝大部分是红肌，后腿部位半腱肌 ST 在12 月龄和股二头肌 BF 在18 月龄时白肌 含量较高，影响肉质，不利于屠宰生产。 本研究对1 至18 月龄不同生长阶段乌珠穆沁羊的肌肉结 缔组织以及肌纤维的变 化特征进行研究。旨在掌握随月龄的增加不同部位肌肉结缔组织 以及肌纤维类型的变 化规律，为指导畜牧业生产和肉制品加工提供可靠的参考数据。 关键词:骨骼肌;肌内膜;肌束膜;肌纤维类型;肌球蛋白 Structural Characteristics Changes in the Skeletal Muscle Fibers During development of Wuzhumuqin Sheep Abstract Muscle fibers were the basic composition of skeletal muscle. The histology characteristics of muscle fibers directly influenced the muscle quality. The natural grazing Wuzhumuqin sheeps, from 1 to 18 mo. of age, were employed in the study. And used the histochemical methods, HE and EVG, to analysis the changes of intramuscular connective tissue during the growth of Wuzhumuqin sheep. The changes of the muscle fiber types were determined by method of ATPase. The method of SDS-PAGE was employed to separated myosin heavy chain isoforms MyCH . There are main conclusions as follow: The diameter of skeletal muscle fibers were increasing during the growth of Wuzhumuqin sheep . The diameter of LD was increased slowly. In general, the diameter of skeletal muscle fibers achieved a best stage in 9 month-age. The thickness of endomysium was increasing during the growth of Wuzhumuqin sheep. The thickness of perimysium in DAO and LD were increasing with growth of Wuzhumuqin sheep. But The thickness of perimysium of TB、 ST and BF were decreasing during 9 momth-age to 12momth-age,and then increasing. On the whole, the content of type ?and type ?a red muscle in skeletal muscle was relatively abundant. Particularly, in LD, the vast majority of muscle was red. the content of type ?a in ST was up to 64.13%. So this stage is the best time to promote muscle growth. This study explains the features of connective tissue and muscle fibers in skeletal muscle of Wuzhumuqin sheeps during growth of sheep. Based on our study, we can provide a reliable reference data to guide livestock product ion and meat processing. Key Words: Skeletal muscle; Endomysium; Perimysium; Muscle fiber type; Myosin Directed by:Prof. BORJIGIN Gerelt Applicant for Doctor degree:Wangshuiqing Food science College of food science and engineering, Inner Mongolia Agricultural University, Huhhot 010018, China 目 录 1 引 言 ................................................................ 1 1.1 骨骼肌肌纤维组织学特 性 ........................................... 1 1.1.1 肌纤维组织宏观结 构 ............................................. 1 1.1.2 肌纤维组织微观结 构 .............................................2 1.1.3 肌内结缔组织结 构 ...............................................3 1.1.4 肌纤维结构特性对肉品质的影 响 ...................................4 1.2 肌纤维类型概 述 ...................................................5 1.2.1 肌球蛋白简 述 ...................................................5 1.2.2 肌纤维的分 类 ...................................................6 1.2.3 肌纤维类型对肉品质的影 响 .......................................7 1.3 乌珠穆沁羊概 述 ...................................................7 1.4 研究的主要内 容 ...................................................7 1.5 研究的目的和意 义 .................................................8 2 试验材料与仪 器 ......................................................8 2.1 试验原材 料 .......................................................8 2.2 试验试 剂 .........................................................8 2.3 试验仪器与设 备 ...................................................9 3 实验内容及方 法 ..................................................... 10 3.1 样品冷冻切片预处 理 .............................................. 10 3.2 骨骼肌肌纤维组织的观 察........................................... 10 3.2.1 染液配 置 ...................................................... 10 3.2.2 染色过 程 ...................................................... 10 3.3 骨骼肌结缔组织的观 察 ............................................ 11 3.2.1 主要染液配 置 .................................................. 11 3.2.2 染色过 程 ...................................................... 11 3.4 骨骼肌肌纤维类型的观 察 .......................................... 11 3.2.1 主要染 液 ...................................................... 11 3.2.2 染色过 程 ...................................................... 11 3.5 肌球蛋白的提 取 .................................................. 12 3.5.1 主要试 剂 ...................................................... 12 3.5.2 肌球蛋白提取过 程 .............................................. 12 3.6 利用SDS-PAGE 电泳分离骨骼肌中肌球蛋白重锁异构 体 ................. 12 3.6.1 试验试 剂 ...................................................... 12 3.6.2 分离胶与浓缩胶的配 制 .......................................... 13 3.6.4 肌球蛋白电泳样品的配 置 ........................................ 13 3.6.3 加 样 .......................................................... 14 3.6.4 SDS-PAGE 电 泳.................................................. 14 3.6.5 染色和脱 色 .................................................... 14 4 结果与分 析 ......................................................... 14 4.1 骨骼肌肌纤维直径的变 化 .......................................... 14 4.1.1 骨骼肌肌纤维HE 染色 图 ......................................... 14 4.1.2 骨骼肌肌纤维直径测 量 .......................................... 16 4.2 骨骼肌肌内结缔组织的变 化 ........................................ 17 4.2.1 骨骼肌肌内结缔组织染色 图 ...................................... 17 4.2.2 骨骼肌肌内膜和肌束膜厚度测 量 ..................................20 4.3 骨骼肌肌纤维类型变 化 ............................................22 4.3.1 骨骼肌肌纤维类型分 布 ..........................................22 4.3.2 骨骼肌肌纤维类型比例变 化 ......................................24 4.4 SDS-PAGE 凝胶电泳分离肌球蛋白重锁异构 体..........................28 5 讨 论 ...............................................................28 6 结 论 ...............................................................30 致 谢 ..............................................................31 参 考 文 献 ........................................................32 作 者 简 介 ........................................................37 插图和附表 1. 图1 骨骼肌肌纤维组成立体 图.............................................. 2 2. 图2 肌纤维微观结构立体 图................................................ 3 3. 图3 肌内结缔组织电镜扫描 图.............................................. 4 4. 图4 肌球蛋白分子结构 图.................................................. 6 5. 图5 不同月龄三角肌HE 染色图 10× 40 .................................... 15 6. 图6 不同月龄肱三头肌HE 染色图 10× 40 .................................. 15 7. 图7 不同月龄背最长肌HE 染色图 10× 40 .................................. 16 8. 图8 不同月龄半腱肌HE 染色图 10× 40 .................................... 16 9. 图9 不同月龄股二头肌HE 染色图 10× 40 .................................. 16 10. 图10 不同月龄三角肌EVG 染色图 10× 40 .................................. 18 11. 图11 不同月龄肱三头肌EVG 染色图 10× 40 ................................ 18 12. 图12 不同月龄背最长肌EVG 染色图 10× 40 ................................ 19 13. 图13 不同月龄半腱肌EVG 染色图 10× 40 .................................. 19 14. 图14 不同月龄股二头肌EVG 染色图 10× 40 ................................ 19 15. 图15 不同月龄三角肌ATPase 染色(10× 40)............................... 22 16 图16 不同月龄肱三头肌ATPase 染色(10× 40)............................. 23 17 图17 不同月龄背最长肌ATPase 染色(10× 40)............................. 23 18 图18 不同月龄半腱肌纤维类型ATPase 染色(10× 40)....................... 23 19 图19 不同月龄股二头肌纤维类型ATPase 染色(10× 40)..................... 24 20 图20 股二头肌肌球蛋白异构体SDS-PAGE 图................................. 28 21 表1 SDS-PAGE 电泳胶配 方................................................. 13 22 表2 染色液和脱色液的制 备............................................... 14 23 表3 1 至18 月龄乌珠穆沁羊骨骼肌肌纤维的直径 单位: μm .................. 17 24 表4 1 至18 月龄乌珠穆沁羊骨骼肌肌内膜的厚度 单位: μm .................. 20 25 表5 1 至18 月龄乌珠穆沁羊骨骼肌肌束膜的厚度 单位: μm .................. 21 26 表6 乌珠穆沁羊三角肌肌纤维类型平均比 例 ................................. 24 27 表7 乌珠穆沁羊肱三头肌肌纤维类型平均比 例 ............................... 25 28 表8 乌珠穆沁羊背最长肌肌纤维类型平均比 例 ............................... 25 29 表9 乌珠穆沁羊半腱肌肌纤维类型平均比 例 ................................. 26 30 表10 乌珠穆沁羊股二头肌肌纤维类型平均比 例 .............................. 26 内蒙古农业大学硕士学位论文 1 1 引言 羊肉属于高蛋白、低脂肪、低胆固醇的营养食品，是主要肉 食品之一，能满足人 体健康的需要。很早以前我国医学界就对羊肉的医疗和保健作用 进行过深入研究，其 味甘性温，益气补虚，强壮筋骨，具有独特的保健作用，治虚劳寒冷、补中益气、安 心止惊，经常食用可以增强体质，使人精力充沛，延年益寿。特别是羔羊肉具有瘦肉 多、肌肉纤维细嫩、脂肪少、膻味轻、味美多汁、容易消化和富有保健作用等特点， 颇受广大人民的欢迎。 在人民生活水平不断提高的同时，人们对食品质量也有较高的要求，尤其是在食 肉品质方面。对羊肉品质评价，主要指肉的颜色，嫩度、失水性、氢离子浓度(pH )、 [1] 气味(膻味)和熟肉性等方面 。其中嫩度是对肉品质评价的一个重要指标。 1.1 骨骼肌肌纤维组织学特性 1.1.1 肌纤维组织宏观结构 动物肌肉在组织学上被分为三类:骨骼肌、平滑肌和心肌。与肉品生产加工相关 的主要是骨骼肌。骨骼肌 skeletal muscle 是由大量具有收缩能力的肌纤维 Muscle fiber 所组成，并且由结缔组织所覆盖和接合在一起。一条肌纤维就是一个肌细胞， [2] 20,300 个肌细胞聚集形成肌束，多条肌束聚集形成肌肉 ，肌纤维作为肌肉的基本 组成成分，故其组织学性质直接影响肌肉的品质。 肌纤维是肌肉块最基本的组成单位，肌纤维外被一层很薄的结缔组织膜包裹，此 膜为肌内膜 Endomysium 。大约50,150 条肌纤维聚集形成肌束，外面包裹较厚的结 缔组织膜称为肌周膜或肌束膜 Perimysium 。由多条肌束聚集在一起形成肌肉块，包 在肌肉块外面并以肌腱形式与其它肌肉和骨骼连在一起的结缔组织膜称为肌外膜 Epimysium [3]，如图1。一般在肌肉分割过程中肌外膜被除去，所以对肉质的影响不 大。肌内膜、肌束膜和肌外膜统称为骨骼肌结缔组织。肌内结缔组织主要指肌内膜和 肌束膜，其中肌束膜占总量的90%[4]。结缔组织膜对肌肉起着支持和保护作用，血管、 神经通过三层膜贯穿肌肉当中，伸入到肌纤维的表面，以提供营养和传递神经冲动。 除此之外，结缔组织中沉积大量脂肪，从而使肌肉断面呈大理石纹样。 2 乌珠穆沁羊生长过程中肌纤维结构特性变化研究 图1 骨骼肌肌纤维组成立体图 Fig.1 The structure of skeletal muscle fiber 1.1.2 肌纤维组织微观结构 骨骼肌在显微镜下观察有明暗相间的条纹，故又称为横纹肌。肌细胞是一种高度 分化的细胞，呈长线状，不分枝，两端逐渐尖细，称为肌纤维。肌纤维直径一般为 10,100μm，长度一般在1,40mm，最长可达100mm。骨骼肌肌纤维 Muscle Fiber 主要由肌细胞核，肌浆和肌原纤维，以及自身外层包裹的肌膜组成。骨骼肌纤维为多 核纤维，肌细胞核可多达上百个，位于肌纤维边缘部位，紧贴在肌纤维膜下，呈有规 则的分布。肌浆填充于肌原纤维间和核的周围，其间富含肌红蛋白、肌糖元及其代谢 产物等，而且肌浆内有发达的线粒体分布，说明骨骼肌代谢相对旺盛。而肌纤维的主 要成分是肌原纤维，肌原纤维在肌纤维固形成分中占60%-70%，主要与肌肉的伸缩性 能相关。肌原纤维是由可调节的粗肌丝 Thick-myofilament 和细肌丝 Thin-myofilament 组成。粗肌丝的主要成分是肌球蛋白，细肌丝的主要成分是肌动蛋白，辅以原肌球蛋 白和肌钙蛋白。粗肌丝和细肌丝有规律的相互并行整齐的排列并 在某一区域形成重 叠，在显微镜下观察就会看到明暗交替的条纹，即横纹。其中光线较暗的区域为暗带 A 带 、光线较亮的区域为明带 I 带 。I 带的中央有一条暗线，即Z 线，两条相邻Z 内蒙古农业大学硕士学位论文 3 线间的肌原纤维单位称为肌节 Sarcomere ，它包括一个完整的A 带和两个半I 带。肌 节是肌原纤维的重复结构单位，主要功能体现在肌肉的收缩、伸张性能方面。如图2。 图2 肌纤维微观结构立体图 Fig.2 The structure of skeletal muscle fiber 1.1.3 肌内结缔组织结构 肌内结缔组织主要是由细胞、丝状纤维和胶状基质组成。结缔组织中细胞种类很 多，但数量较少，其主要是成纤维细胞。丝状纤维由蛋白质分子聚合而成，可分胶原 纤维、弹性纤维和网状纤维三种。其中，胶原纤维的含量较多,它主要由胶原蛋白组 [5] 成，胶原蛋白对肉的嫩度影响较大 。弹性纤维由弹性蛋白构成，有弹性，在沸水、 弱酸或弱碱中不溶解。胶状基质的主要成分为蛋白多糖 Proteoglycan ，它对胶原纤维 [6,7] 起到连接的作用 。在扫描电子显微镜下可观察肌内膜和肌束膜 中胶原纤维的结构， 如图3，肌内膜呈蜂窝状结构，主要是由细微的、网状结构的胶原纤维构成。肌束膜 [8] 是平行排列的膜层结构，主要是由平行排列的、波浪状的胶原纤维构成 。 4 乌珠穆沁羊生长过程中肌纤维结构特性变化研究 图3 肌内结缔组织电镜扫描图 Fig.3 The structure of intramuscular connective tissue 1.1.4 肌纤维结构特性对肉品质的影响 [9] 国内外众多研究表明,肌纤维越细，肉质越嫩，肌纤维越粗，肉质越硬 。Cornforth [10] 等 1980 曾报道在个体成熟前，牛肉肌纤维横截面积的大小随着年龄的增加而增加 。 川井田博 1982 在研究猪肉肌纤维粗细与肉品质关系中指出肌纤维结构特性与肉品 质关系密切,肌肉中肌纤维直径和密度是影响嫩度和系水力的重要指标,肌纤维越细, [11] 密度越大的品种,其肌内脂肪的沉积量要多于肌纤维粗而密度低 的品种 。孙竹珑 1991 对藏山羊肌肉组织学特性的研究证明,藏山羊肌纤维直径小,肉质细嫩,品质良 [12] 好 。吴信生等 1998 对我国7 种地方鸡种的组织学特点以及与肉品质关系的研究表 明，肌纤维直径与嫩度 剪切力值 呈正相关，即肌纤维愈细，肌纤维密度愈大，肉质 [13] 越鲜嫩 。Hinder 等 1950 对牛肉嫩度在家畜生长过程中的变化研究中发现嫩度随着 [14] 家畜生长，其变化是有阶段性的 。Tuma 等 1962 认为，牛肉中肌纤维直径在24 月 龄达到最大，在这之前牛肉的嫩度主要由肌纤维的直径来决定，而在这之后嫩度的变 [15] 化还与其他因素有关 。动物的年龄、品种差异以及营养状况和运动量等都是影响肌 [16] 纤维粗细的主要因素 。还有研究表明个体日增重较快的,肌纤维直径增粗得也较快; [17] 随年龄的增大,肌纤维会增粗 。 结缔组织在肌肉中的含量增高，则肌肉的硬度增加，会降低肉的食用价值。结缔 组织在体内的含量，因品种、育肥程度、年龄以及性别的不同而 有差别。肌内结缔组 织的变化及其分布也与肉品质有密切关系,曾勇庆等 1998 在对莱芜猪肌肉组织学特 性与肉质关系的研究中提到肌内结缔组织含量越高,肌肉的持水能力越强，从而影响 [18] 肌肉嫩度的变化 。随着动物的生长，肌内结缔组织中的胶原纤维会越来越粗，并且 内蒙古农业大学硕士学位论文 5 排列更有规则性，从而使肌束膜、肌内膜中的胶原蛋白分子的交联更加稳固，导致肌 [19] 肉嫩度下降 。Nishimura 等 1996 对日本黑牛背最长肌进行研 究发现，在育肥过程中， 背最长肌中脂肪组织的沉积破坏了肌内结缔组织的结构，从而形成大理石花纹,对牛 [20] 肉起到嫩化的作用 。Brooks 等 2004 对牛全身14 个分割部位的骨骼肌肌肉嫩度和 肌束膜的厚度进行了研究，发现牛肉的嫩度受肌束膜的厚度影响，其中半腱肌的肌束 [21] 膜最厚，嫩度最差，腰大肌的肌束膜最薄，嫩度最佳 。Purslow 2005 的研究表明， 随着动物的生长，肌内结缔组织中胶原纤维增粗从而使结缔组织增厚，导致肉嫩度下 [22] 降 。 1.2 肌纤维类型概述 1.2.1 肌球蛋白简述 肌球蛋白 myosin 是动物肌肉中的一种重要的大分子蛋白质，分子量约为 470KDa ，主要存在于胶原纤维粗丝中，具有ATP 酶活性，与肌动蛋白共同参与肌肉 的收缩运动。肌球蛋白分子含有两条重锁 MyHC 大亚基，分子量约为200KDa 和四 条轻锁 小亚基，分子量约为15KDa~30KDa 。肌球蛋白可经胰蛋白酶裂解为重酶解 肌球蛋白 heavy meromyosin, HMM 和轻酶解肌球蛋白 light meromyosin,LMM 。轻酶 解肌球蛋白也可形成粗丝，但不具有ATP 酶活性，不与肌动蛋白结合。图4 是肌球 蛋白分子结构图，重酶解肌球蛋白经木瓜蛋白酶水解后，会形成三个亚片段，两个形 同的球状亚片段S-1 和一个棒状亚片段S-2 。S-1 含有催化域和调节域，催化域可结 合肌动蛋白和ATP ，轻链一般结合于调节域即杆臂，调节域与催化域被称为肌球蛋白 [23] 质的马达功能区 。 肌球蛋白占肌肉总蛋白的1/3，是主要的收缩蛋白。参与收缩功能的主要是肌球 蛋白重链，每条重链中都含有大量异构体，这些异构体的多样性主要是由位于MyHC 2+ [24] 顶端的特异性肌动蛋白和Ca 激活的ATPase 决 定的 。不同的MyHC 异构体组成的 [25] 肌纤维表现出不同的的收缩性和ATPase 活性 。 6 乌珠穆沁羊生长过程中肌纤维结构特性变 化研究 图4 肌球蛋白分子结构图 Fig.4 Molecular structure of myosin 注: LMM―轻链肌球蛋白;HMM―重链肌球蛋白;S-1―亚基;S-2― 亚基 1.2.2 肌纤维的分类 早在1673 年，就有学者对肌纤维类型展开过研究，Loranvier 发现骨骼肌肌纤维 有两红、白两种颜色，并且发现不同颜色肌纤维对动物的运动能力有一定影响。1873 年法国人Ranvier 利用电刺激法将骨骼肌分为红肌和白肌两种类型，并证明红肌纤维 收缩速度较慢，不易疲劳，而白肌纤维收缩速度快，易疲劳。因此之后的研究中很多 学者利用不同的组织学分类，又将将肌纤维分成快肌和慢肌。 1955 年Padykula 建立了肌原纤维ATPase 的组织化学染色法并对骨骼肌肌纤维进 [26] [27] 行 ，之后1962 年Engel 在碱性条件下将肌纤维 分为?型和?型 。1970 年 Brooks 和Kaiser 提出肌球蛋白ATP 酶组化分类法,根据肌球蛋白中ATP 酶对酸碱的稳 定性不同，将肌纤维分为?、?a、?b 三种主要类型，也称作为α、β、αβ三种类型。 1973 年Peter JB 在对骨骼肌组织化学多变性的研究中，对肌纤维收缩性以及与其相关 的氧化酶和磷酸化酶含量进行对比，进一步将肌纤维类型分为慢收缩强氧化型(SO)、 [28] 快收缩强氧化酵解型(FOG )以及快收缩强酵解型(FG ) 。 不同类型的肌纤维具有不用的性质，不同的肌纤维类型构成的肌肉也具有不同的 功能，这种多样性还主要取决各种肌纤维型内存在的特殊的肌球蛋白异构体。 Schiaffino 等 1985 依据肌纤维中肌球蛋白重链异构体分子的抗原特异性差异，利用单 [29] 克隆抗体技术将肌纤维分为?型和2A 、2B 以及2X 四种类型 。之后Klitgeard 等根 据肌球蛋白分子重链 MyHC 的电泳迁移率不同,将MyHC 划分为?型和?a、?b 、? [30] x 型 。随着科学技术的快速发展，很多学者开始利用分子技术对肌纤维进行分类， Chang 等 2003 在猪骨骼肌纤维类型分子表达方面研究发现，猪骨骼肌肌纤维中含有 四种肌球蛋白重链(MyHC )的异构体，并依据异构体不同特性 的表达将肌纤维分为 [31] MyHC ?、MyHC ?、MyHC ?和MyHC ?四种类型 。这种建立在 分子水平上得分 类方法更加准确可靠，并在科研中广泛应用。 内蒙古农业大学硕士学位论文 7 1.2.3 肌纤维类型对肉品质的影响 Dildey 等研究发现PSE 色淡、质软、渗水 劣质肉的发生 与肌肉中不同类型肌纤 [32] 维含量有关,指出红肌纤维含量多的肌肉不易发生PSE 现象 。陈宽维等对7 种不同 遗传背景鸡进行研究,发现白肌纤维直径大于红肌纤维和中间型纤维直径,其所占比 例与肉质呈负相关,即白肌纤维比例愈高,肉质愈差。鸡肉中红肌纤维含量最高约占 [33] 50%以上,白肌纤维约占40%,中间型纤维约占10% 。同样有研究表明,白肌纤维比例 [34] 与肉质呈显著负相关,而红肌纤维含量与肌肉嫩度呈正相关 。Essen 等对猪骨骼肌特 [35] 性与肉质关系的研究中提出酵解型肌纤维比例高，肉质较差 。有关研究表明，2b [36] 型纤维含量高，肉质相对较差，是因2b 型纤维中含肌红蛋白和血红蛋白较少所致 。 在鲜肉褪色过程中，肌纤维类型含量差异起主要作用，在低温储藏鲜肉96 小时后， 腰大肌的腿色程度要远远大于背最长肌，因为腰大肌中氧化型纤维含量高，而背最长 [37] 肌中酵解型纤维含量相对较高造成 。肌纤维类型与肌肉 pH 值也有一定相关性， Larzul 等的研究表明，猪背最长肌酵解型肌纤维比例增加会减 慢宰后pH 值降低的速 [38] 度和程度，从而导致肌肉颜色的下降以及失水率的增加 。 总体上说，肌纤维类型与肌肉品质有着密切的相关性，肌肉中肌纤维类型的组成 直接肌肉的生长以及肌肉品质的好坏。肌肉肥大主要由肌纤维增大引起的，在动物生 长过程中，各类型肌纤维因具有不同的特性，这将影响肌肉的各项组织学特性发生变 化。在对羊生长养殖以及肉品质控制方面，肌纤维类型作为辅助指标被应用与此类研 究中。 1.3 乌珠穆沁羊概述 乌珠穆沁羊产于内蒙古自治区锡林郭勒盟乌珠穆沁地区，故以此而得名，现主要 [39] 分布在东、西乌珠穆沁旗以及毗邻的锡林浩特市、阿巴嘎旗部分地区 。在经过长期 的自然和人工选择繁育成蒙古羊系中的一个优良品种。乌珠穆沁羊属草原放牧肥育型 [40] 粗毛羊，但它有很多方面不同于其他蒙古羊品种 。乌珠穆沁羊体格大、尾大、肉质 结实、肉脂多、低水分，富含多种矿物质等。乌珠穆沁羊具有较强的生活力、耐粗耐 寒、宜于牧养等特点，适于终年放牧饲养，此外还有抓膘快、脂肪蓄积能力强、高产 肉率、性成熟早、羔羊成活率较高等特性，2000 被农业部确定为国家级畜禽资源保 护品种。乌珠穆沁羊以其独特的生长特点，以及肉质特征，深受国内外养殖业与消费 者的青睐。 1.4 研究的主要内容 目前国内对乌珠穆沁羊的研究也有不少，重点都在育种遗传和育肥养殖以及宰后 羊肉成熟条件与肉嫩度的关系等方面。对于乌珠穆沁羊生长过程中肌纤维结构变化以 8 乌珠穆沁羊生长过程中肌纤维结构特性变化研究 及肌内结缔组织的变化，以及肌纤维类型变化规律等方面的研究几乎没有。本研究分 别取1、3、6、9、12 和18 月龄乌珠穆沁羊为研究对象。每只羊在屠宰后从前腿部位 处取三角肌 deltoid muscle,DAO 和肱三头肌 triceps brachii muscle,TB ，背部取背最长 肌 longissimus dorsi muscle,LD 以及后腿部位处取半腱肌 semitendinosus muscle,ST 和股二头肌 biceps femoris muscle,BF 。采用组织化学染色法观察研究，随着月龄的增 加，乌珠穆沁羊肌纤维直径以及肌内结缔组织中肌内膜和肌束膜厚度的变化规律;并 进行ATPase 染色，对肌纤维进行分类并计算各类型肌纤维的构成比率随月龄增加的 变化规律;最后利用SDS-PAGE 分离股二头肌中肌球蛋白重锁异构体。 1.5 研究的目的和意义 本研究主要是对乌珠穆沁羊生长过程中肌纤维直径变化、肌内结缔组织中肌内 膜、肌束膜的厚度的变化以及肌纤维类型的变化进行观察测量，探索家畜随着月龄的 增加，肌纤维直径、肌内结缔组织中肌内膜和肌束膜厚度以及肌纤维类型的变化规律， 掌握地方优良品种羊肉的肌纤维结构特点，为肉质的提高和改善做相应的数据支持， 对于我国畜牧业生产和畜产品加工具有重要意义。另外，本研究从理论上对草原自然 生态环境下放牧的乌珠穆沁羊的最适育肥月龄提供可靠的理论依据。 2 试验材料与仪器 2.1 试验原材料 选取内蒙古锡林郭勒盟白音锡勒牧场自然放牧条件下的 1~ 18 月龄的乌珠穆沁 羊。采用的肉羊是同一个羊群中选择6 个不同年龄段的去势公羊。屠宰后在前腿部位 处取三角肌和肱三头肌，背部取背最长肌以及后腿部位处取半腱肌和股二头肌，共五 个部位的肌肉。将样品直接投入液氮中冷冻，放-80?保存，待用。 2.2 试验试剂 伊红 Amresco Certifiable Grade 苏木精 Amresco,Em 苦味酸 广东汕头市西陇 化工厂 高锰酸钾 北京化工厂 间苯二酚 天津市博迪化工有限公司 碱性品红 北京市化学试剂研究所 酸性品红 北京化工厂 草酸 天津市科盟化工工贸有限公司 冰乙酸 天津市科盟化工工贸有限公司 内蒙古农业大学硕士学位论文 9 乙酸钠 天津市科盟化工 工贸有限公司 蔗糖 天津市科盟化工工贸有限公司 巴比妥钠 Germany 氯化钴 天津市光复科技发展有限公司 硫化铵 天津市登科化学试剂有限公司 多聚甲醛 天津市福晨化学试剂厂 二甲苯 天津市福晨化学试剂厂 氯化钙 天津市化学试剂三厂(,,) 无水乙醇 天津市化学试剂三厂(,,) 磷酸二氢钠 天津市化学试剂三厂(,,) 磷酸氢二钠 天津市化学试剂三厂(,,) 氢氧化钠 天津市化学试剂三厂(,,) 氯化钠 天津市化学试剂三厂 盐酸 天津市翔宇化工工贸有限责任公司 甘油 天津市科盟化工工贸有限公司 Tris 南京博尔迪生物科 技有限公司 十二烷基硫酸钠(SDS ) 南京博尔 迪生物科技有限公司 巯基乙醇(β-巯基乙醇) Sigma M-6250 四甲基乙二胺(TEMED ) SigmaT8138 过硫酸铵(APS ) Sigma A 6761 溴酚蓝 Sigma B-0126 考马斯亮蓝G-250 Sigma B-1131 甘氨酸 NOVON ZZ 2782 乙二胺四乙酸二钠(EDTA ) BIO BASIC INC. EB0185-500g 苯基甲烷磺酰氟化钠(PMSF ) BIO BASIC INC. PB0425-5g 考马斯亮蓝R-250 BIO BASIC INC. CB0037-25g 2.3 试验仪器与设备 Arium 61316 超纯水器 德国赛多利斯 仪器厂 CX31 光学显微镜 OLMYPUS MEV 落地式半自动冷冻切片机 德国SLEE 公司 XB130 制冰机 日本三洋公司 85-2 型磁力搅拌器 国华公司 pB-10 型pH 计 北京赛多利斯科 学仪器有限公司 10 乌珠穆沁羊生长过程中肌纤维结构特性变 化研究 通风柜 北京世安科兴科技开发有限责任公司 XHF-D 型组织捣碎机 宁波心芝生物公司 H2500R-2 型冷冻高速离心机 湘仪 SIGMA3-18K 型台式离心机 Sartorius BG-power 600 型稳流恒压电泳仪 北京百晶生物技术有限公司 电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司 LRH-250 生化培养箱 上海一恒科技有限公司 TY-805 摇床 南京大学南达生物技术开发公司 TU-1810 紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司 3 实验内容及方法 3.1 样品冷冻切片预处理 将肌肉从-80?冰箱取出，修成1×1×1cm 的小块，放在恒温冷冻切片机(MEV 德国产)-25 ?进行切片，切片厚度10μm，直接粘贴于载玻片上，室温干燥即可进行 组织化学染色。 3.2 骨骼肌肌纤维组织的观察 3.2.1 染液配置 1. 固定液:多聚甲醛 4g ，蔗糖7.5g，0.1mol 磷酸缓冲液(pH7.4 )100mL。 2. Harry 氏苏木精:苏木精1g，无水乙醇 100mL，蒸馏水 100mL，硫酸铝钾 60g， 冰醋酸 10mL。 3. 1盐酸酒精:1mL 浓盐酸，蒸馏水定容至100mL，密封保存。 4. 0.5 伊红:0.5g 伊红，蒸馏水定容至100mL，密封保存。 5. 3.2.2 染色过程 采用组织学Hematoxylin & Eosin H.E. [41]染色方法。 1. 将干燥的冷冻切片直接放入固定液中，5min 。 2. 经蒸馏水充分冲洗后，放入苏木精染液中深染，15min。 3. 蒸馏水洗去多余染液后，入1盐酸酒精中分色数秒，蒸馏 水冲洗干净。 4. 入0.5 伊红中染色，3min 。 5. 常规梯度酒精脱水(70%、80%、90%、无水?、无水?)各2min 。 6. 二甲苯?，二甲苯?透明各2min 。 7. 中性树胶封片，用CX31 光学显微镜观察。 内蒙古农业大学硕士学位论文 11 3.3 骨骼肌结缔组织的观察 3.2.1 主要染液配置 1. 酸化高锰酸钾:0.5%高锰酸钾 50mL，0.5%硫酸溶液50mL。 2. Weigert 弹性纤维染液:碱性品红 1g，间苯二酚 2g ，蒸馏水 200mL，30%FeCl3 12.5mL，浓盐酸 2mL 。 3. Van Gieson 染液:1%酸性品红水溶液10mL，苦味酸饱和水溶液 90mL 。 3.2.2 染色过程 采用组织学Elastica van Gieson E.V.G. [42]染色方法。 1. 将干燥的切片放固定液中10min。 2. 入酸化高锰酸钾中酸化，将切片上的杂质颜色氧化。 3. 经蒸馏水洗去多余染液，再经1草酸中漂白至无色，去除切片上的杂色物质， 蒸馏水冲洗干净。 4. 入weigert 弹性纤维染液中过夜，时间约为16~18h 为宜。 5. 95 酒精分化，蒸馏水充分洗净。 6. 入van Gieson 染液进行对比染色 1min,蒸馏水充分冲洗。 7. 常规梯度酒精脱水(70%、80%、90%、无水?、无水?)各2min ， 8. 二甲苯?，二甲苯?透明各2min 。 9. 中性树胶封片，用CX31 光学显微镜观察。 3.4 骨骼肌肌纤维类型的观察 3.2.1 主要染液 1. 酸预孵育液(pH 值4.3 ):0.2mol/L 乙酸钠 50mL，用冰乙酸调pH 值至4.3 。 2. 碱预孵育液(pH 值10.4):0.18mol/LCaCl :0.1mol/L 巴比妥钠:H O 1:1:3，调 2 2 pH 值至10.4。 3. ATP 孵育液(pH 值9.4 ):0.18mol/LCaCl :0.1mol/L 巴 比妥钠:H O 2:1:7，加 2 2 25mgATP ，调pH 值至9.4 。 4. 1CaCl :称取10gCaCl 用蒸馏水定容至1000mL。 2 2 5. 2 CoCl :称取2gCoCl 用蒸馏水定容至100mL (现用 现配)。 2 2 6. 1 NH4 S:量取1mL NH S 用蒸馏水定容至100mL (现用现配)。 2 4 2 3.2.2 染色过程 ATPase 组织化学染色参照Peinado [43]和Brooke[44]的方法并稍加改动。 1. 将干燥的冰冻切片放入酸预孵育液(pH 值4.3 )5min 。 12 乌珠穆沁羊生长过程中肌纤维结构特性变化研究 2. 入碱预孵育液(pH 值10.4)中15min。 3. 直接放入ATP 孵育液(pH 值9.4 )中37?孵育45min 。 4. 用1CaCl2 流动冲洗约10min。 5. 然后放入2 CoCl2 中染3min 。 6. 洗去多余CoCl 后，入1 NH S 中反应，反应会生成黑色物质。 2 4 2 7. 自来水充分冲洗后蒸馏水冲洗干净，时间约10min。 8. 常规梯度酒精脱水(70%、80%、90%、无水?、无水?)各2min 。 9. 二甲苯?，二甲苯?透明各2min 。 10. 中性树胶封片，用CX31 光学显微镜观察。 3.5 肌球蛋白的提取 3.5.1 主要试剂 1. 改良G-S 匀浆液:0.3mol/L KCl，1mmol/L MgCl ，0.01mol/L 焦磷酸钠，20mmol/L 2 EDTA，0.09mol/L KH PO ，0.06mol/L K HPO ，1mmol/L ATP，调pH 值6.5 。 2 4 2 4 2. 肌球蛋白溶解液:0.3mol/L KCl，1mmol/L EDTA，1mmol/L MgCl ，调pH 值 2 6.5 。 3.5.2 肌球蛋白提取过程 肌球蛋白的提取参考Huxley[45]以及Nguyen [46]等人的方 法加以改进。 以下过程都在4 ?下完成。 1. 取2g 去掉脂肪和较粗的结缔组织的肌肉，切碎。 2. 加入50mL 改良后的G-S 溶液进行匀浆处理。 3. 将匀浆液置于磁力搅拌器上，搅拌90min 。 4. 匀浆液在12000r/min 的转速下，高速离心60min。 5. 弃沉淀，上清液中加入10 倍冷超水，调pH 值6.5，4 ?下静置过夜。 6. 溶液分层后，虹吸出上清液，余液在10000r/min 的转速下，高速离心20min 。. 7. 收集沉淀，溶于肌球蛋白溶解液中。 3.6 利用SDS-PAGE 电泳分离骨骼肌中肌球蛋白重锁异构体 SDS-PAGE 电泳参考Leammli 1970 [47]的方法对骨骼肌中肌球蛋白重锁异构体进 行分离鉴定。 3.6.1 试验试剂 1. 分离胶缓冲液:1.5M Tris-HCl 缓冲溶液pH8.8,取Tris 18.17g ，用蒸馏水溶解后 内蒙古农业大学硕士学位论文 13 定容至100mL。 2. 浓缩胶缓冲液:0.5MTris-HCl 缓冲溶液pH6.8, 取Tris 6.0g ，用蒸馏水溶解后 定容至100mL。 3. 电泳缓冲液:称取Tris 3.04g, 甘氨酸14.42g, SDS 1g,用蒸馏水溶解后定容至 100mL。 4. 30%Acr-Bis 贮存液:29gAcr ，1gBis,用蒸馏水溶解后定 容至100mL。 5. TEMED ;10%过硫酸铵(现用现配);甲醇溶液;5%溴酚蓝溶液;冰乙酸溶液。 3.6.2 分离胶与浓缩胶的配制 按表1 中的配比配制分离胶和浓缩胶。先配10%的分离胶，将溶液混匀(避免气 泡)迅速注入垂直的凝胶模具中至3/4 处，然后在胶面上轻铺一层蒸馏水(避免移动 模具)，室温下静置约1h 见分离胶与水之间有一条清晰的界面时，吸干上面的水。再 配5%的浓缩胶，轻轻灌注在分离胶上面(避免有气泡)直至离胶板顶部约1mm 处， 然插入电泳梳子，室温下凝聚30min 。轻轻拔出梳子，切勿将加样孔撕裂。 表 1 SDS-PAGE 电泳胶配方 Table 1 Formula of the SDS-PAGE 溶液(单位:mL ) 分离胶(10%) 浓缩胶(5%) 30%Acr-Bis 2.5 0.7 Tris-HCL (pH8.8 ) 2.0 ― Tris-HCL (pH6.8 ) ― 1.0 10%SDS 0.075 0.05 H O 3.0 2.7 2 10%APS 0.075 0.05 TEMED 0.005 0.004 3.6.4 肌球蛋白电泳样品的配置 [48] 样品溶解液 :0.5mol/LTris-HCl pH6.8 ，10%SDS，10% 甘油，5%β-巯基乙醇， 0.05%溴酚蓝。配好后-20 ?保存。 蛋白质样品的准备:样品溶液与蛋白质样品混合，使蛋白样 品浓度为0.8mg/ml 。 沸水中加热处理3min,10000r/min 离心5min,取上清液进行加 样。 14 乌珠穆沁羊生长过程中肌纤维结构特性变化研究 3.6.3 加样 将聚合的凝胶安置于电泳槽中，下槽注入电泳缓冲液，略倾斜放下上槽以除去凝 胶管底部的小气泡。上槽中注入电极缓冲液，没过加样孔，排除样孔里的气泡。用微 量取样器吸取已处理好的蛋白质样品25μL，按月龄顺序注入胶孔。 3.6.4 SDS-PAGE 电泳 将电极导线接好，黑的接于负极，红的接于正极，接通电源。选择合适的电压 (100V)，保持恒压，进行电泳，直至样品中的蓝色线移至离下 端1cm 时停止电泳， 关闭电源。 3.6.5 染色和脱色 小心取下分离胶，放入染色液过夜，然后放入脱色液，室温 下脱色，注意更换脱 色液直至蛋白质区带清晰为止。染色液和脱色液配制见表2 。 表 2 染色液和脱色液的制备 Table 2 Preparation of staining solution and destaining solution 溶液种类 染色液 脱色液 甲醇 150mL 50mL 冰乙酸 150mL 75mL 考马斯亮蓝R250 0.075g ― H2O 135mL 875mL 4 结果与分析 4.1 骨骼肌肌纤维直径的变化 4.1.1 骨骼肌肌纤维HE 染色图 本实验采用组织学HE 染色法对选取的五处骨骼肌进行冰冻 切片染色，在高倍显 微镜下对染色结果进行观察。 图5,图9 分别是五处骨骼肌1 月龄,18 月龄的HE 染色 效果图，所有图片都是 在同样放大倍数下进行观察。由图中可看出，细胞质呈现不同程度的红色或粉红色， 这主要与每次染色时的环境因素以及人为操作有关。细胞核呈现蓝紫色，游离在肌纤 维之间，紧贴肌纤维壁。但基本上可以看出，乌珠穆沁羊骨骼肌肌纤维大小均匀，有 规律排列。随月龄的增加，每个部位的肌纤维都不同程度增粗，只是增粗幅度不同。 随月龄的增加，肌纤维直径在不断增大，而肌纤维密度显著下降，此结果与Karlsson[9] 内蒙古农业大学硕士学位论文 15 的骨骼肌肌纤维与肉品质相关因素的报告中一致。随月龄的增加，肌纤维致密性较好 的是背最长肌。而三角肌在9 月龄和12 月龄时肌纤维致密性最好，肱三头肌在9 月 龄时致密性最好，股二头肌在12 月龄时较好，而半腱肌中肌纤维致密性略差。 A.1 月龄 B.3 月龄 C.6 月龄 D.9 月龄 E.12 月龄 F.18 月龄 图5 不同月龄三角肌HE 染色图 10×40 Fig.5 Hematoxylin & Eosin of deltoid muscle during growth of Wuzhumuqin sheeps 10 ×40 A.1 月龄 B.3 月龄 C.6 月龄 D.9 月龄 E.12 月龄 F.18 月龄 图6 不同月龄肱三头肌HE 染色图 10×40 Fig.6 Hematoxylin & Eosin of triceps brachii muscle during growth of Wuzhumuqin sheeps 10 ×40 16 乌珠穆沁羊生长过程中肌纤维结构特性变化研究 A.1 月龄 B.3 月龄 C.6 月龄 D.9 月龄 E.12 月龄 F.18 月龄 图7 不同月龄背最长肌HE 染色图 10×40 Fig.6 Hematoxylin & Eosin of longissimus dorsi muscle during growth of Wuzhumuqin sheeps 10 ×40 A.1 月龄 B.3 月龄 C.6 月龄 D.9 月龄 E.12 月龄 F.18 月龄 图8 不同月龄半腱肌HE 染色图 10 ×40 Fig.8 Hematoxylin & Eosin of semitendinosus muscle during growth of Wuzhumuqin sheeps 10 ×40 A.1 月龄 B.3 月龄 C.6 月龄 D.9 月龄 E.12 月龄 F.18 月龄 图9 不同月龄股二头肌HE 染色图 10 ×40 Fig.9 Hematoxylin & Eosin of biceps femoris during growth of Wuzhumuqin sheeps 10 ×40 4.1.2 骨骼肌肌纤维直径测量 根据以上五组HE 染色图，利用cellsens [ver,1.5]成像软件对五个部位不同月龄肌 内蒙古农业大学硕士学位论文 17 纤维直径进行测量统计分析。表3 表示1、3、6、9、12 和18 月龄乌珠穆沁羊骨骼肌 DAO 、TB、LD 、ST 和 BF 中肌纤维直径的平均值和差。 利用SAS 的ANOVA 方差分析对数据进行处理分析。结果显示，DAO 、TB 两处骨骼肌肌纤维直径随月龄 增加呈上升趋势。LD 、ST 和BF 三处骨骼肌肌纤维直径在 1 月龄到9 月龄之间肌纤 维直径呈上升趋势且差异均显著(P 0.05 )，9 月龄之后，肌纤维直径有所下降。LD 和 BF 在 12 月龄和 18 月龄之间差异不显著(P 0.05 )，而与其他月龄差异显著 (P 0.05 )。ST 在9 月龄和12 月龄之间差异不显著(P 0.05 )，而与其他月龄之间差 异均显著(P 0.05 )。各部位肌纤维生长不同，是由于不同部位的骨骼肌与动物运动 [49] 机能有关。沈元新等 研究发现,骨骼肌纤维越细,肌纤维密度越 大,肌肉脂肪含量高, [11] [18] [50] [51] 肉质细嫩,味美多汁。川井田博 、曾勇庆等 分别对猪、鸡 、牦 牛 肌肉纤维直径 进行研究,结果表明肌纤维直径随动物的成长不断增大，而肌纤 维密度不断下降，并 且肌纤维直径与肉品的柔嫩度密切相关。 表 3 1 至18 月龄乌珠穆沁羊骨骼肌肌纤 维的直径 单位:μm Table 3. The diameter of skeletal