精液处理方法对精子染色体非整倍体率的影响

精液处理方法对精子染色体非整倍体率的影响 精液处理方法对精子染色体非整倍体率的 影响 532TianjinMedJ,Jul2009,Vol37No7 精液处理方法对精子染色体非整倍体率的影响 张云山罗海宁杨清秀糜若然 摘要目的:分析不同精液处理方法对精子染色体非整倍体率是否有影响.方法:随机抽取1O 例接受卵胞浆内 单精子注射(ICSI)治疗的轻度少弱精子症患者,分别采用上游法(A组)和Sperm—Grad双层 密度梯度离心法(B组)处 理其中5例患者精液,另外随机抽取于门诊就诊的5例轻度少弱精子症患者精液,不做处理, 设为对照组.用CEPX/ CEPY,CEP18探针对这15例患者各1000个精子进行荧光原位杂交实验.比较3组精子中染 色体非整倍体精子的比 例.结果:性染色体非整倍体率,对照组,A组,B组分别为(4.21+_2.49)%,(3.24~1.49)%和 (2.62~0.89)%;18号染色体非 整倍体率,对照组,A组,B组分别为(3.00~1.22)%,(2.00~1.22)%和(2.00~I.22)%,3组差异均无 统计学意义(F分别为 1.065和1.III,P>0.05).结论:上游法和Sperm—Grad双层密度梯度离心法对精子的优选仅 限于活力,畸形率等方面, 而在精子染色体方面并无确定的优选作用. 关键词原位杂交,荧光精子离心法,梯密度非整倍性染色体 InfluenceofSemenProcessingonProportionofAneuploidSperm ZHANGYunshan,LUOHaining,YANGQingxiu,MIRuoran DepartmentofObstetricsandGynecology,TheGeneralHospitalofTianjinMedicalUniversity,Tianjin300052,China AbstractObjective:Toanalyzetheinfluenceofsemenprocessingmethodsontheproportionoftheaneuploidspermby detectingthesperm’SchromosomeX,Y,18usingfluorescenceinsituhybridization.Methods:Tenpatientswithmildoligo— asthenosperia,whowerereceivedICSItreatment,wereincludedinthisstudy.Fivesemensamplesofthepatientswererandom— lyselectedtodetectusingSwim-upmethod(Agroup)and5usingsperm-graddouble-densityeentrifugationmethod(Bgroup). Another5patientswithmildoligo-asthenosperiawereascontrol(Cgroup).TheCEPX/YandCEP18probewasusedtodetect thespermofthese15patientsbyfluorescenceinsituhybridization.Theproportionofaneuploidspermwascomparedinthree groups.Results:Thesexchromosomeaneuploidrateswere(4.21~2.49)%,(3.24~1.49)%and(2.62~0.8 9)%incontrol,Aand Bgroups.Theratesofaneuploidchromosome18were(3.00~1I22)%,(2.00~1.22)%and(2.00~1.22)%i ncontrol,AandB groups.Therewerenosignificantdifferencesinthreegroups>0.05).Conclusion:Theresultsshowed thatthemethodsof Swim—upandSperm—Graddouble—densitygradientcentrifugationcouldselectspermsinmotilityp otentialandteratospermia, butnotinnormalchromosomesperms. Keywordsinsituhybridization,fluorescencespermatozoacentrifugation,densitygradientaneuploidy chromosomes 目前,精液处理技术主要为上游法,双层密度 梯度离心法,血清白蛋白过滤法等.其中上游法和 双层密度梯度离心法是目前研究较多,使用较广泛 的2种方法【l_2】.但这2种方法对精子的优选参考指 标主要为精子活动率,A级精子百分率和精子畸形 率等,这2种方法是否可以从遗传学角度优选染色 体正常精子目前较少报道.荧光原位杂交 fluorescenceinsituhybridization,FISH)技术目前已 广泛应用于对配子及胚胎的染色体.本研究正 是利用FISH技术检测精子的x,Y,l8号染色体, 分析上游法和Sperm—Grad双层密度梯度离心法处 理精液是否对染色体非整倍体的精子有筛选作用. l对象与方法 1.1研究对象2007年10月一2o08年2月在天津市中心 妇产科医院生殖医学中心进行卵胞浆内单精子注射 (intracytoplasmlcsperminjection,ICSI)的患者中随机抽取了 10例轻度少弱精子症患者.其中5例患者精液采用上游法 处理(A组),另外5例患者精液采用Sperm—Grad双层密度 梯度离心法处理(B组).其ICSI后剩余的精子作为FISH研 究对象.同时期在本中一bl’q诊就诊的不育症男性患者中随机 抽取5例轻度少弱精子症患者(对照组),精液未经处理,直 接用于FISH实验.男性正常精液实验室参考值执行WHO }天津市科技发展项目(项目编号:05YFGZGX09900) 作者单位:300052天津医科大学总医院妇产科(张云山,糜若 然);天津市中心妇产科医院生殖医学中心(罗海宁,杨清秀) 天津医药2009年7月第37卷第7期 标准. 1.2方法 1.2.1探针美国Vysis公司生产的荧光素直接标记的 CEPX/CEPY探针,CEP18探针.CEPX探针为绿色荧光信号, 杂交至人x染色体的着丝粒处(Xpl1.2一ql1.1,位点DZY1), CEPY为红色(Red)荧光信号,杂交至人Y染色体的着丝粒 处(Ypl1.2-ql1.1,位点DZY3),CEP18为蓝绿色(Aqua)荧光 信号,杂交至人18号染色体的着丝粒处. 1.2.2处理方法上游法:轻轻反复吹打混匀G—Sperm培养 液和精液,1500r/min离心5min弃去上清液,吸取G—Fert 培养液和精子沉淀混匀,制成精子悬浮液,置于培养箱中 30,45min,轻轻吸取含精子的上游液,置于试管中备用. Sperm—Grad双层密度梯度离心法处理:预先配制90%和 45%Sperm—Grad液体,使用时吸取2mL90%Sperm—Grad液 体,缓缓地加入到含2mL45%Sperm—Grad离心管的底部, 随后在2mL处可看到分层.男性患者手淫法取精,并收集精 液于无菌取精杯中,室温下待精液完全液化后,用巴氏管吸 取已液化的精液转移至离心管中,轻轻地加在刚才的45%一 90%Sperm—Grad液体的最上层,2000r/min离心20min,然 后弃掉每一层,最后留取精子沉淀,转移到新的离心管内,加 3mLG—Fert液吹打混匀,1500r/min离心5min,弃上清液, 将底部沉淀重新悬浮,对处理后的精液进行分析并:密 度,活率,活力,畸形率及圆形细胞.处理后的精液2-3h后 用于ICSI.注射后剩余的废弃精液,经患者夫妇同意,捐赠用 于本研究. 1.2.3标本的制备将处理过的精液用约2mLPBS充分混 匀,对照组精液加等体积的PBS,750g离心10min,弃去上 清液.如此反复洗涤3次.吸除PBS,将沉淀下的精子放入 3:1的甲醇:冰醋酸固定液中,轻轻地吹吸数次使精子在固定 液中分布均匀.然后将混有精子的固定液滴在准备好的载玻 片上,在显微镜下观察其分布,用金刚石记号笔划定标记圈. 自然风干后一2O?贮存或直接用于杂交实验. 1.2.4精子x,Y,18号染色体荧光原位杂交一20.c取出固 定有精子的标本载玻片,复温.将1mol/LNaOH滴在标本 载玻片上作用5min.70%,85%,100%乙醇梯度脱水,室温 风干.同时将CEPX/CEPY,CEP18探针复温,将1IxLH2O,7 Lbuffer,1IxLCEPX/CEPY探针,1txLCEPI8探针震荡混匀, 离心备用.取3.0探针混合液加到玻片标记区域,盖上盖玻 片,RubberCement封口.将玻片放人$500—24型原位杂交仪 中75oC1min,42?过夜杂交.杂交后取出玻片,移除盖玻 片,浸入已在73?水浴锅中平衡30min以上的0.4×SSC,n3% NP--40中洗脱2min.取出载玻片,浸入室温下2×SSC/0.1% NP-40中洗脱560s.取出载玻片,室温下自然风干.加入3 DAPI复染液(美国Vysis公司),盖上盖玻片,荧光显微镜 下观察.应用装有CCD摄相系统的NIKONECLIPSE80i荧 光显微镜(日本尼康公司)分别于SpectrumAqua,Spectrum Red和SpectrumGreen,DAPI滤光片下行原始荧光图像采 集,用Spec~aVysionCytovision染色体分析软件(英国 533 AppliedImaging公司)进行荧光图像分析(以上试剂均购自 瑞典vitr0life公司). 1.2.5荧光信号计数标准在滤光块下观察到1个绿色信 号即认为是1个”x”信号,观察到两个绿色信号即认为是 “XX”信号,以此类推;在RED滤光块下观察到1个红色信 号即认为是1个”Y”信号,观察到两个红色信号即认为是 “YY”信号,以此类推;在AQUA滤光块下观察到1个蓝绿色 信号即认为是1个”18号染色体”信号,观察到2个蓝绿色 信号即认为是”18号染色体”两倍体信号,以此类推.不能确 定是否为1个信号时,参照Munnet’~准:荧光信号亮度很低 的信号不予计数,因其多为非特异性杂交信号;以1个信号 的直径为1个域,2个同色信号相距在1个域以内时为1个 信号,因其多为1条染色体的DNA复制形成的姐妹染色单 体或信号分裂.当2个信号相距2个域以上时,则认为它们 是2个不同的信号. 1.3统计学分析数据用均数?标准差(?s)表示,应用 SPSS10.0统计软件进行方差分析. 2结果 2.1镜下表现在荧光显微镜下可见精子头部经 DAPI复染后呈蓝色,圆形,饱满,边缘清楚.红色, 绿色,蓝绿色荧光信号强度强,背景清晰. 2.2非整倍体率3组每例精子均计数200个,共 计数精子3000个.其中有信号的精子为l998个, 杂交率为99.9%.3组性染色体非整倍体率和18号 染色体非整倍体率差别均无统计学意义(P>0.05), 几尢表1. 表13组染色体非整倍体率比较(%) 均P>0.05 3讨论 目前在辅助生殖技术中应用FISH技术可直接 优选卵子和胚胎:对卵子的极体进行染色体检测后 该卵子可继续用于受精;对胚胎单卵裂球进行植入 前遗传学诊断(preimplantationgeneticdiagnosis, PGD)后对该胚胎的生长发育并无不良影响嘲.虽然 在精子的性染色体和染色体非整倍体检测方面, FISH是目前最有效和可靠的方法[61,但FISH技术 应用于精子的染色体检测后,该精子却不能继续用 于使卵子受精,即FISH不能直接优选染色体正常 的精子.而目前最常用的优选精子的方法是上游法 534 和双层密度梯度离心法【7J.但其优选作用主要在精 子密度,总活精子数,A级精子百分率等方面.本研 究结果提示经上游法和Sperm—Grad双层密度梯度 离心法处理过的精液中精子染色体非整倍体率较 对照组有所降低,但这种差别并无统计学意义. Samura等ts]研究表明,percoll密度梯度离心法对于 携x染色体精子与携Y染色体精子的比例有影响, 但处理过的精液精子与未处理过的精液精子在性 染色体非整倍体率方面差别无统计学意义.本实验 的结论与之一致.此外,分析对实验组和对照组精 子性染色体,18号染色体非整倍率差异的统计学结 果的影响因素时,要注意两个方面:首先是本研究 样本量仍较小,计数精子数较少,可能会对3组精 子染色体非整倍体率的差异造成影响;其次,实验 组精子是ICSI后剩余精子,自离体至固定时间较对 照组长.而这段时间越长,产生的活性氧(reactive oxygenspecials,ROS)等引起人类精子DNA损伤的 物质就会越多,从而导致精子DNA链的断裂甚至 消失.若损伤的位置为探针结合处,可能导致探针 与DNA碎片或杂质结合,或使探针无处结合,造成 假阳性和假阴性I101,可能会影响对实验组精子染色 体非整倍体率检测的准确性. 总之,本研究的结果显示经上游法和Sperm— Grad双层密度梯度离心法处理过的精子非整倍体 的比例与对照组比较差异无统计学意义,还需要更 多科学数据及大样本量的实验研究,为精子有染色 体缺陷的不育症男性患者提供更好的辅助生殖治 疗. TianjinMedJ,Jul2009,Vol37No7 参考文献 …HenkelRR,SchillWB.SpermpreparationforART[J1.ReprodBiol Endocrino1.2003,14(1):108—113. [2]SoderlundB,LundinK.Theuseofsilanecoatedsilicaparticlesfor densitygradienteentrifugationininvitrofertilization.Hum Reprod,2000,15(4):857—860. 【3】世界卫生组织编.谷翊群,陈振文,于和鸣,等译.人类精液及精 子,宫颈粘液相互作用实验室检验手册[M】.北京:人民卫生出 版社,2001:17—19. 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(2008—10—31收稿2008—12—25修回) (本文编辑李淑杰) 消息 参考文献着录须知 根据国家有关条例,本刊对参考文献着录格式做如下修订,即日起来稿请切实遵照执行. 1.中,外文文献,包括期刊,书和重要学术会议会议录的论文,作者署名3名以内者,全部列出, 多于3名者只列 前3名,注明”,等.”或”,eta1.” 2.中,外文期刊文献着录格式:作者.文题fJ】.杂志名称,出版年,卷(期):起页一止页. 3.中,外文书的着录格式:作(编)者.书名『M】.版次.出版地:出版社,年:起页一止页. 如果着录章节作者,其着录格式为:章节作者.文题【.见:编者编着.书名.版次.出版地:出版社, 年:起页一止页. 例:LachmannB.TheroleofpulmonarysurfactantinthepathogenesisandtherapyofARDS[M].In:Vincen t儿ed.Update inintensivecareandemergencymedicine.BedimSpringer,1987:123—124. 4.会议录(汇编):引用必须严格,只限引用中华医学会,卫生部或国际学术组织主办的国际性, 全国性学术会议 的汇编论文.格式:作者.文题Ic1.会议名称.开会地点:主办单位,年. 《天津医药》编辑部