【word】 RNAi基因沉默技术及其在植物抗病性改良中应用的策略

【word】 RNAi基因沉默技术及其在植物抗病性改良中应用的策略 RNAi基因沉默技术及其在植物抗病性改良 中应用的策略 勉扬保2011.37(6):55—58PlantProtection RNAi基因沉默技术及其在植物抗病 性改良中应用的策略 陈华民,何晨阳 (中国农业科学院植物保护研究所,植物病虫害生物学国家重点实验室,北京100193) 摘要RNAi(RNAinterference)是一种由dsRNA参与,对靶基因表达进行干扰或沉默的现象.由此发展起来的 RNAi基因沉默技术已成为当今植物基因功能研究和遗传改良的一个重要手段.该技术已经在靶向病原物(真菌, 细菌,病毒和线虫)基因沉默方面得到了广泛的应用,并且产生了一批抗病性增强的转基因植物.人工设计和合成 的amiRNAs和ata-siRNAs的成功研发加快了RNAi技术的应用.本文对RNAi基因沉默机制,RNAi技术研发进 展及其在植物抗病性遗传改良中的应用进行综述,并对其应用策略进行探讨. 关键词RNAi;基因沉默;抗病性;遗传改良 中图分类号:Q789文献标识 码:ADOI:10.3969~.issrL0529—1542.2011.06.009 StrategicuseofRNAi—mediatedgenesilencingtechnologyfor engineeringplantswithimproveddiseaseresistance ChenHuamin,HeChenyang (StateKeyLaboratoryforBiologyD,PlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection, ChineseAcademyofAgriculturalSciences,BeOing100193,China) AbstractRNAinterference(RNAi)isaRNAhomology-dependentgenesilencingtechnologythatinvolvesdoub- le-strandedRNA(dsRNA)directedagainstatargetgeneoritspromoterregion.RNAiisnowwidelyusedasa usefultoolfordiscoveringorvalidatinggenefunctions,andasaquickwayforengineeringplantswithimproved agronomictraits,suchasfungal,bacterial,viralandnematodediseaseresistance.TheuseofRNAi-mediatedgene silencingtechnologyinplantscienceshasbeenspeededupwiththeincreasingsuccessofartificialdesign,biosyn— thesisandutilizationofmiRNAsandta-siRNAs.ThemechanismsandprogressofRNAitechnologyanditsstrate? gicuseinengineeringplantswithimproveddiseaseresistancewereherereviewedanddiscussed. KeywordsRNAinterference;genesilencing;diseaseresistance;engineering forimprovement 1RNAi基因沉默机制 RNAi基因沉默(RNAinterference-mediated genesilencing)是由双链RNA(dsRNA)产生的小 RNA(sRNAs)(siRNA,ta-siRNA,ra-siRNAs,nat— siRNA和miRNA)引起的[1],其共同过程是作为 RNAi激发子的dsRNA被Dicer酶识别后,切割成 21~25个核苷酸的小干扰RNA(siRNA)片段;siR— NA与靶基因mRNA的相应序列在RNA诱导基因 沉默复合体(RISC)上进行结合,然后这些短的dsR— NAs中的反义链特异性地识别互补mRNA的靶序 列,从而在其中间部位进行切割或翻译抑制,从而实 现对靶基因转录后或翻译后调控.植物细胞质,核 中均可发生RNAi基因沉默_2]. RNAi基因沉默机制主要包括:(1)sRNAs通过 与靶标序列结合,在识别的特异位点对序列进行剪 切,形成转录后的基因沉默[3;(2)sRNAs通过与靶 标序列结合,造成蛋白翻译起始障碍,形成蛋白质翻 译的沉默_4;(3)通过将与sRNA同源的DNA区域 中的胞嘧啶甲基化,形成了sRNA介导的DNA甲 收稿日期:2011—09—08 基金项目:转基因生物新品种培育科技重大专项 (20O8zxO8OO1—002,2009ZX08009—044B,2009ZX08012—016B) *通信作者Tel:010—62894147,E-mail:cyhe@caas.net.cn ? 56?勉扬铱2011 基化(RdDM),即表观遗传效应_51].植物RNAi基 因沉默通常是通过剪切靶标mRNA,使其不能作为 蛋白质翻译的,从而抑制基因的表达. 2RNAi基因沉默技术研发新策略 2.1基因沉默效果的时空调控 由于靶基因表达需要受到精确的调控,RNAi 基因沉默也需要进行时空调控.植物体内RNAi基 因沉默/抑制通常是系统发生的[8,但在实际需要 中仅沉默部分组织中特定基因,这会引起其他组织 中靶基因表达的抑制.所以有必要研发和利用组织 特异性启动子,来调控基因的沉默效果.此外,基因 沉默需要在时间和强度上的进行调控.通过筛选不 同强度的启动子来控制dsRNA的表达,或利用不 同的同源序列来抑制靶基因,可以达到调控抑制程 度的目的. 2.2dsRNA的靶定效应 RNAi基因沉默需要dsRNA与靶基因序列结 合.如何使dsRNA有效地到达靶序列所在的部位 是RNAi技术的关键问题.通过沉默与癌症,病毒 侵染和自身免疫紊乱等疾病相关基因的表达,RNAi 技术已成为一种有效的疾病治疗新策略.在医学和 动物疾病(尤其病毒病)的研究中发现,dsRNAs可 以到达癌变特异部位[1卜],而目前在植物中尚未见 任何类似的报道. 2.3sRNA的人工设计 病毒抑制子可以与sRNA结合抑制后者的基因 沉默功能口.对抑制子特异结合位点进行修饰,使 其不能与sRNA进行正常结合,可以提高后者的沉 默效率,如RHBV病毒抑制子NS3_】.因此,研究 和利用病毒抑制子结合位点,可以有效地提高基因 沉默效率. miRNAs通过与反向互补的mRNAs序列结 合,在RISC中进行剪切或翻译后抑制.研究 miRNAs可能比dsRNAs更为重要.可以适当修饰 miRNA序列,特异性地沉默靶基因,而沉默效果不 受影响. 人工设计和合成amiRNAs和ana-siRNAs可 以解决RNAi脱靶效应(非靶标基因沉默).与传统 RNAi技术相比,amiRNAs特异性更高,可以更精 确地预测对潜在的非特异靶标的影响.传统RNAi 技术的siRNAs前体可以形成多个5一和3一序列不 同的小RNA,而miRNAs前体只能形成一个特定序 列的高效sRNA.因此,amiRNAs技术在更大程度 上规避了对相似序列的非靶标基因的影响.此外, amiRNAs基因沉默效果不仅依赖于自身特性,而且 依赖于靶标基因mRNAs的局部结构_1.因此,人 工设计和合成amiRNAs时,需要特别考虑靶基因序 列的结构. ta-siRNAs是一类内源的sRNAs,产生于非编 码TAS基因介导转录的4个家族,负责转录后的基 因调控_1.ta-siRNAs的形成涉及21nt的siRNAs 和miRNAs指导的切割,以miRNAs和siRNAs的 序列为模板,聚合形成的次级RNA小片段.尽管 amiRNAs载体的可预测性高,不易脱靶,但ata—siR— NAs方法更为实用,因为它更易于多个功能小 RNAs序列融合进一个载体中,从而可以创建具有 多抗功能的转基因植物_1. 2.4amiRNAs和ata-siRNAs的应用 amiRNAs对病毒抑制子的沉默.与hp,RNA 产生的沉默效果相比,靶向CMV抑制子2b的 amiRNA方法在瞬时表达,稳定转化方面效果更 好?】.靶向株系特异序列或不同株系间保守序列 的转基因植株表现对CMV广谱抗性口.拟南芥 miR159通过修饰拟南芥miR159的前体来靶向两 个病毒抑制子序列(P69,HC-Pro).amiRNA- P69坫.和amiRNA-HC-Pro.转基因植株分别具有 对TYMV和TuMV的抗性,而表达两者的植株表 达对两个病毒都具有很强的抗性[2. ata-siRNAs对报告基因FAD2的沉默.FAD2 是拟南芥基因沉默分析的报告基因,单拷贝,表型易 定量分析[2.用ata-siRNAs序列沉默FAD2 基因,发现转基因植株FAD2活性水平与突 变体一样,达到了基因沉默效果【2. 3R2~Ai技术在植物抗病性遗传改良中的 应用 RNAi技术已经在病原物(真菌,细菌,病毒和 线虫)基因沉默方面得到了广泛应用,产生了一批抗 病性增强的转基因植物. 3.1植物真菌病害的抗性改良 通过表达白粉病菌致病因子Avral0的RNA 同源序列,转基因植物表现出对白粉病的抗性[z3]. 其机制是植物dsRNA分子可能进入了病原真菌体 37卷第6期陈华民等:RNAi基因沉默技术及其在植物抗病性改良中 应用的策略?57? 内,从而导致了真菌基因的沉默(HIGS).这一结果 提供了一个基于RNAi的植物抗真菌病害遗传改良 新策略. 3.2植物细菌病害的抗性改良 根癌农杆菌iaaM和ipt基因沉默后,转基因植 物对冠瘿瘤形成具有较高的抗性_2.iaaM编码色 氨酸单加氧酶,将色氨酸转变成生长素前体吲哚乙 酰胺l_2;ipt编码产物促成AMP和异戊烯基焦磷酸 盐的浓缩,并形成细胞分裂素(玉米素)l_2.这两个 基因的表达是冠瘿瘤形成所必需的.用靶向iaaM 和ipt的RNAi载体转化拟南芥和番茄植株,转基 因植物肿瘤形成得到明显的抑制. 3.3植物病毒病害的抗性改良 水稻条纹叶枯病(RSV)CP,SP和CP/SP蛋白, 水稻矮缩病毒(RDV)Pnsl2蛋白,玉米矮花叶病毒 (MDMV)CP蛋白,菜豆金黄花叶病毒(BGMV)复 制起始因子AC1基因沉默/抑制后,转基因植株对 病毒病抗性明显提高[27-29]. 不同编码基因沉默导致的病毒抗性是有明显差 异的,靶基因的选择至关重要.例如RSV编码蛋白 pC3和运动蛋白pC4沉默转基因植株表现高抗,而 编码糖蛋白pC2和无结构蛋白p4的沉默对抗性没 有影响L.. 病毒诱导的基因沉默(VIGs)常受限于病毒的 寄主范围.因此,直接喷洒原核表达的siRNAs也 可诱导植物基因沉默,如在接种病毒前5d,喷洒辣 椒轻斑驳病毒(PMMoV)和李痘疱病毒(PPV)的 dsRNA,可成功诱导相关基因的沉默,产生对病毒 侵染的抗性?3. 3.4植物线虫病害的抗性改良 表达根结线虫基因dsRNA序列的烟草对根结 线虫的抗性高达95以上[船].表达线虫16D10基 因dsRNA序列的拟南芥抑制了线虫虫瘿的形成, 减少了虫卵产生;转基因植株对其他种线虫也具有 一 定的抗性[3. 4结束语 RNAi基因沉默技术因其特异性,高效性和遗 传可操作性,已经成为当今植物基因功能研究和作 物遗传改良的一个重要手段,正在迅速得到广泛的 应用.近年来,随着研发工作的不断深入,该技术得 到了极大的提高和完善.例如利用组织特异性和诱 导型启动子,将使基因沉默的时空调控能力得以提 高,从而使RNAi脱靶效应降至最小_3.本实验室 正在利用从水稻叶片中克隆到的,受病原细菌和信 号分子诱导的,维管束组织特异性表达的启动子 OsBTF3一P[j,驱动RNAi基因沉默载体(待发表). 挖掘更多组织特异性和诱导型启动子,将是加 快RNAi技术在作物遗传改良中应用的重要任务之 一 .amiRNAs和ata-siRNAs的研发也加快了 RNAi基因沉默技术的应用_1. 在与植物互作过程中,病原真菌可能通过吸器, 线虫通过口针刺吸,病毒通过RNA或DNA分子进 入,根癌农杆菌通过T_DNA整合,与寄主植物细胞 进行核酸类物质的分子交流.这些为进行RNAi基 因沉默提供了科学基础和依据.然而,至今尚不清 楚其他病原细菌与植物间是否存在核酸分子的交 流.对此需要进行深入的研究,为植物抗细菌病害 改良提出新的思路. RNAi技术需要不断地改进和完善才能得以充 分的利用.需要不断地鉴定和发掘病原物致病因子 基因,植物感病因子基因用作RNAi靶标;构建和设 计将多个基因定位在一个RNAi载体中,有效地降 低病原物变异造成的抗病性丧失的几率,解决作物 持久抗病性的改良问题. 参考文献 [1]SinhaSK.RNAiinducedgenesilencingincropimprovement EJ].PhysiolMolBiolPlants,2010,16:321—332. E23EamensAL,AgiusC,SmithNA,eta1.Efficientsilencingof endogenousmieroRNAsusingartificialmicroRNAsinArabi— dopsisthalianaEJ].MolPlant,2011,4:157—170. [3]MalloryAC,VaucheretH.FunctionsofmicroRNAsandre— latedsmallRNAsinplantsD].NatureGenetics,2006,38:s31 — 36. [4]BrodersenP,Sakvarelidze-AchardL,Bruun-RasmussenM,et a1.WidespreadtranslationalinhibitionbyplantmiRNAsand siRNAs[J].Science,2008,320:1185—1190. [5]AufsatzW,MetteMF,vanderWindenJ,eta1.RNA-direct— edDNAmethylationinArabidopsis[J].ProcNatlAcadSciU SA,2002,99(S4):16499—16506. [6]ListerR,O’MalleyRC,TonffFilippiniJ,eta1.Highlyinte— gratedsingle-baseresolutionmapsoftheepigenomeinArabi— dopsis[J].Cell,2008,133:523—536. [7]Zhan~XTheepigeneticlandscapeofplantsEJ].Science,2008, 320:489—492. 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