利用羊膜上皮干细胞抑制皮肤增生性瘢痕形成研究（可编辑）

利用羊膜上皮干细胞抑制皮肤增生性瘢痕形成研究（可编辑） 利用羊膜上皮干细胞抑制皮肤增生性瘢痕形成研究 分类号 密级 国际十 进分 类号 (UDC ) 第四军医大学 硕士学位利用羊膜上皮干细胞抑制皮肤增生性 瘢痕形成的研究江 兰 学历研究生 培 养 类 别 申请学位类型 学术学位 皮肤病与性病学 学科领域专业 余春艳 教授(主任医师) 指导教 师 指导教师单位 唐都医院皮肤科 二 O一二年五月 独 创 性 声 明 独 创 性 声 明 秉承学校严谨的学风与优 良的科学道德,本人声明所呈交的论文是我 个人在导师指导下进行的研 究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了文 中特别加以标注和致谢的地 方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过 的研究成果,不包含本人或 他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与 我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示了致谢。 申请学位论文与资料若有不实之处 ,本人承担一切相关责任。论文作者签名: 日期: 保 护 知 识 产 权 声 明 保 护 知 识 产 权 声 明本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定,即:研究生在 校攻读学位期间论文工作的 知识产权单位属第四军医大学。本人保证毕业 离校后,发表论文或使用论 文工作成果时署名单位仍然为第四军医大学。 学校可以公布论文的全部或部分内容 (含电子版, 保密内容除外) ,可以采 用影印, 缩印或其他复制手段保存论文 。 学 校有权允许论文被查阅和借阅, 并在校园网上提供论文内容 的浏览和下载服务。同意学校将论文加入《中 国优秀博硕士学位论文全文数据库》 和编入 《中国知识资源总库》 ,同意按 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库 出版章程》规定享受相关权益。 论文作者签名:导师签名: 日期: 利用羊膜上皮干细胞抑制皮肤增生性 瘢痕形成的研究 研 究 生:江 兰 学科专业:皮肤病与性病学 所在单位:第四军医大学唐都医院皮肤科 导 师:余春艳 教授(主任医师) 辅导教师:金岩教授 资助基金项目:“863 ” 组织皮肤重大专项资助项目 关键词: 羊膜 羊膜上皮细胞 皮肤 增生性瘢痕 瘢痕成纤维细胞中国人民 解放军第四军医大学 二 O一二年四月第四军医大学硕士学位论文 目 录 缩略语表 1 中文摘要 3 前 言. 11 文献回顾. 12 正 文. 16 实验一 羊膜上皮细胞的分离、培养及鉴定 16 1 .16 2 .17 2.1 羊膜上皮细胞的分离与培养17 2.2 羊膜上皮细胞的鉴定17 3 .结果19 3.1 细胞增殖 MTT 及 光学显微镜下细胞形态结果19 3.2 流式细胞术分析. 20 3.3 免疫荧光染色20 3.4 成脂、成骨诱导分化21 4. 讨论 22 实验二 瘢痕成纤维细胞的分离、培养24 1. 材料 24 2. 方法 24 3. 结果 25 4. 讨论 25 第四军医大学硕士学位论文 实验三 羊膜上皮细胞与瘢痕 成纤维细胞的共培养及鉴定 27 1. 材料 27 2. 方法 28 2.1 HS 成 纤维细胞与 hAEC 共培养 28 2.2 细胞周期、凋亡28 2.3 RT -PCR. 29 3. 结果 30 3.1 细胞周期的结果. 30 3.2 细胞凋亡的结果. 32 3.3 PCR 检测的结果32 4. 讨论 34 实验四 利用动物模型检测羊膜上皮 细胞在瘢痕防治中的作用. 36 1. 材料 36 2. 方法 36 2.1 增生性瘢痕模型的构建. 36 2.2 组织切片观察37 2.3 激光共聚焦检测 hAEC 在瘢痕组织的存活情况 37 3. 结果 37 4. 讨论 39 小 结. 40 参考文献. 41 个人简历和研究成果. 47 致 谢. 48 第四军医大学硕士学位论文 缩略语表 缩略词 英文全称 中文全称 碱性成纤维细胞生 bFGF Basic fibroblast growth factor 长因子 DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM 培养液 DMSO Dimethyl sulfoxide 二甲基亚砜 ECM Extracellular matrix 细胞外基质 EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid 乙二胺四乙酸 EGF Epidermal growth factor 表皮生长因子 ESCs Epidermal stem cells 表皮干细胞 Fb Fibroblast 成纤维细胞 Fetal bovine serum FBS 胎牛血清 FCM Flow cytometer 流式细胞仪 hAECs Human amniotic epithelial cells 人羊膜上皮细胞 hAMCs Human amniotic mesenchymal cells 人羊膜间充质细胞 HE Hematoxylin-erosin 苏木素-伊红 HS Hypertrophic Scar 增生性瘢痕 K Keloid 瘢痕疙瘩 mRNA Messenger RNA 信使 RNA 1 第四军医大学硕士学位论文 3-4,5- 二甲基噻 3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyl MTT 唑2,5-二苯基四唑溴 tetrazolium bromide 盐 OD Optical density 光密度值 PBS Phosphate-buffered saline 磷酸盐缓冲液 rpm Round per minute 每分钟转速 Reverse transcription-polymerase chain 逆转录聚合酶链式 RT-PCR reaction 反应 TGF β1 Transforming growth factor-beta1 转化生长因子 β12 第四军 医大学硕士学位论文 利用羊膜上皮干细胞抑制皮肤增生性 瘢痕形成的研究 硕士研究生 :江 兰 导师 :余春艳 教授 第四军医大学唐都医院皮肤科,西安 710038 中文摘要 病理性瘢痕是皮肤创伤修复过程中异常 增生所致,主要包括增生性瘢 痕(Hypertrophic Scar ,HS ) 和 瘢痕疙瘩 (Keloid ,K ) 。 两 者组织学 特点都 是成纤维细胞增值, 细胞外基质过度分泌、胶原过 度沉积。临床表现为瘙 痒、疼痛、严重可导致关节 的功能障碍等。目前增生性瘢痕的发生机制尚 不明确,且临床治疗复杂及困难。所以对抑制皮肤瘢痕形成的研究就尤为 重要。 研究表明瘢痕的形成因素之一是多种炎 性因子参与的病理过程,使正 常的创面愈合结果变为瘢痕的形成。文献报道,Gordon 等利用小鼠伤口组 织, 采用腺病毒介导的 IL-10 转染的方法, 证实过表达的 IL-10 可以明 显的 抑制伤口炎症反应,从而减 少瘢痕的形成,进一步验证了抗炎症策略在防 止瘢痕的形成,以及治疗中具有重要作用。 羊膜是胎膜的一部分,包括来源于胚胎外胚层的上皮细胞(Human amniotic epithelial cells ,hAECs ) 和胚胎中胚层的间质细胞 (Human amniotic 3 第四军医大学硕士学位论文 mesenchymal cells,hAMCs ) , 羊 膜上皮细胞具有部分干细胞特性, 可分 化为 三个胚层不同类型的细胞。 现临床以成功的应用在眼科,利用羊膜上皮细 胞的干细胞特性,通过抑制炎症反应治 疗角膜溃疡和翼状胬肉等疾病。 本实验通过构建兔耳瘢痕模型,利用羊 膜上皮干细胞抑制炎症因子、 免疫源性极低等优点,在创 面周围定期注射羊膜上皮干细胞悬液,研究羊 膜上皮干细胞抑制瘢痕形成 中所起的作用。为增生性瘢痕的防治和治疗开 辟一条新的道路。 第一部分实验:羊膜上皮细胞的分离、培养及鉴定 1. 主要方法 从胎膜组织中分离羊膜组织,采用胰蛋白消化法、LG-DMEM 培养基 培养。取生长状态良好的羊 膜上皮细胞分别进行流式细胞术、免疫荧光染 色、成骨成脂多向分化等实验进 行干细胞特性的鉴定。 2. 主要结果 FCM 结果 显示不同程度的阳性表达 CD29 、 CD90 、 CD105 , CD34 、 CD45 为阴性。 其中阳性率昀高的是 CD29 , 说 明羊膜上皮细胞兼有间充质干细 胞 的表型特征。免疫荧光染色显示 SSEA-4 ,Oct-4 均有阳性表达。hAECs 成 功定向诱导成脂成骨。 3. 主要结论 羊膜上皮细胞具有一般干细胞的特性。 第二部分实验:瘢痕成纤维细胞的分离、培养 1. 主要方法 取外科手术中废弃的增生性瘢痕 组织, 采用组织快培养法、DMEM 培养 4 第四军医大学硕士学位论文 基培养。 2. 主要结果 原代培养时间较长, 大 约 1 周时间有少许细胞从组织块周围爬出, 生长 较快,镜下观察,细胞为长梭形 ,较正常皮肤成纤维细胞略短。 3. 主要结论 成功的培养出瘢痕的成纤维细胞。 第三部分实验: 羊膜上皮细胞与瘢痕成纤维细胞的共培养及 鉴定 1. 主要方法 将羊膜上皮细胞种于 6 孔板中,待完全贴壁时,3 个孔放入 Transwell, 另外 3 个孔为对照,将瘢痕成纤维细胞种于 Transwell 中, 加入 IL-6 炎 性因 子刺激下, 让两种细胞共同培养,分别在共培养的 1 、2 、3 天提取 RNA , 进行细胞周期、细胞凋亡及 PCR 检测。 2. 主要结果 细胞周期结果显示 1d ,3d 的实验组中瘢痕成纤维细胞增殖要低于对照 组,说明羊膜上皮细胞对瘢 痕成纤维细胞的增殖有抑制作用。细胞凋亡结 果显示 1d 、3d 实验组瘢痕成纤维细胞凋亡 的比对照组数值略高。PCR 检测 显示,实验组的 OCT-4 、 Ι 型胶原较对照组高,而 TIMP-1 低于对照组。 3. 主要结论 两种细胞共培养后, 羊 膜上皮细胞对瘢 痕成纤维细胞的增殖和凋亡有 作用,PCR 检测 TIMP-1 、OCT-4 、 Ι 型胶原等指标随着时间不同各自的表 达不同。 5 第四军医大学硕士学位论文 第四部分实验: 利用动物模型检测羊膜上皮细胞在瘢痕防治 中的作用 1. 主要方法 手术切除双侧兔耳内侧面,形成直径为 1×1cm 的 4 个方形全层皮肤缺 损;在右耳创面周围注射羊膜上 皮细胞悬液,左耳创面周围注射 PBS 缓冲 液。每周注射一次,定期观察。4 周后实验组创面完全上皮化,肿块较小。 对照组肿块明显。取瘢痕组织进行 HE 染色 及激光共聚焦观察2. 主要结果 HE 染色结果显示实验组上皮化完全 、 略 显增生状态, 基底层细胞排列 明显,其下的真皮组织中未 见炎性细胞分布,成纤维细胞分布与对照组相 比较为分散。 共聚焦可观察 到移植的羊膜上皮细胞。 对照组 HE 染色显示成 纤维细胞分布集中,增生 明显。共聚焦未见羊膜上皮细胞。 3. 主要结论 通过肉眼观察、HE 染色及共聚焦检测, 说明羊膜上皮干细胞有效的抑 制瘢痕的形成。 综上所述,本实验利用羊膜上皮细胞的 干细胞特性抑制增生性瘢痕形 成为目的,通 过抑制炎症反应, 减少创面愈合时间为切入点,分别在体内和 体外实验中证明这一推测的 可靠性。为此,羊膜上皮干细胞的应用有可能 成为瘢痕预防和治疗的新手段和切入点。 关键词 : 羊膜 羊膜上皮细胞 皮肤 增生性瘢痕 瘢痕成纤维细胞 6 第四军医大学硕士学位论文 Use human amniotic epithelial cells to inhibit the ormation of hypertrophic scars Candidate for master :Jiang Lan Supervisor:Yu ChunYan Department of Dermatology, Tangdu hospital, Fourth Military Medical University, Xi’an 710038,ChinaAbstract Scar is caused by abnormal hypertrophic during the skin wound healing process, including hypertrophic scar and keloid. The common histological characteristics of scar are fibroblasts proliferation, extracellular matrix excessively secrete, collagen excessive depositThe clinical manifestations of scar are itching, pain and even joint functional disorderCurrently, the mechanism of hypertrophic scar is still unclear, while the clinical treatment is difficult. It is crucial to study how can suppress the formation of hypertrophic scarResearch shows there are many inflammatory factors involved in the formation of scar which turn the normal wound healing into scar formationGordon reported that over expression of IL-10 significantly inhibit the wound inflammation so that reduced scar formation by Adenovirus mediated IL 7 第四军医大学硕士学位论文 - 10 carrying protocol, which further verified anti-inflammatory strategy play an important role in the prevention and treatment of scar Amniotic membrane is one part of embryolemma, including human amniotic epithelial cells hAECs and human amniotic mesenchymal cells hAMCs. Amniotic epithelial cells have partial characteristics of stem cells which can differentiat into three different types of cellsNow days, amniotic epithelial cells had successful application in ophthalmology which deal with corneal ulceration and pterygium by inhibition of inflammatory responseThe study made the rabbit ears scar model, took the advantage of amniotic epithelial cells which inhibit inflammatory factors and have rarely immunogenicity, injected the amniotic epithelial cells surround the wound to investigate the role of amniotic epithelial cells in the inhibition of scar formation, providing a new way for hypertrophic scar prevention and treatmentPart 1 isolation, culture and identification of the amniotic epithelial cells1. Amnion tissues were isolated from the term placentas digested with trypsin and then cultured in LG-DMEM medium. The pluripotent characteristics of well growing hAECs was identified by flow cytometry, immunofluorescence and osteogenic and adipogenic differentiation2. The results of flow cytometry showed that CD29 、CD90 and CD105 were expressed differently extent, while CD34 and CD45 were negative. The highest positive rate was CD29 which suggested hAECs have some phenotypic properties of mesenchymal stem cells. Immunofluorescence stain showed that both SSEA-4 and Oct-4 were expressed. The hAECs successful induced 8 第四军医大学硕士学位论文 differentiation into osteoblasts and adipocytes3. The hAECs have some general properties of stem cellsPart 2 Isolation and culture of scar fibroblasts 1. The fibroblasts were taken from surgical abandoned hypertropic scar tissue and cultured in DMEM medium by tissue cultivation2. It was a long time for primary culture, some cells crawled from the edge of scar tissue after one week which grew more rapidly with long spindle shape and shorter than normal skin fibroblasts3. The scar fibroblasts were successful culturedPart 3 Co-cultivation and identification of hAECs and scar fibroblasts 1. The hAECs were planted at 6-well plate, after adhered completely, one half of the plate were in Transwell and the other for comparison. The scar fibroblasts were planted at Transwell together with IL-6 co-cultured with hAECsThe RNA was extracted in the co-cultivation of 1,2,3day, respectively, and then took cell cycle, apoptosis and PCR detection 2. The results of cell cycle showed that the number of scar fibroblasts in 1d and 3d group were significantly smaller than the control group which suggested the hAECs could suppress the proliferation of scar fibroblasts. The results of apoptosis test showed that the apoptosis of scar fibroblasts in 1d and 3d group were slightly higher than the control group. The PCR detection displayed that OCT-4 and collogen Ιin the experimental group were higher than the control group, while TIMP-1 is lower than the control3. In co-cultivation of hAECs and scar fibroblasts, the former could impact the proliferation and apoptosis of scar fibroblasts. The expression of 9 第四军医大学硕士学位论文 TIMP-1,OCT-4 and collogen Ιwere varied in different moment detected by PCRPart 4 The role of hAECs in prevention and treatment of scar in animal model 1. Four diameter of 1×1cm square full-thickness skin defect in medial rabbit ears bilateral were made by surgical resection. The cell suspension of hAECs was injected in the right wounded ear one time each week, while the left with phosphate buffer PBS as control. After 4 weeks, the wounds of experiment group epithelization completely, while the control group with obvious bump. HE stain and confocal laser were used for scar tissue observation2. The results of HE stain showed that the experimental group epithelization completely, slightly proliferative state, basal cells organized regular and no inflammatory cell was found in the dermis tissue, the fibroblasts distribution relative scatter compare with control group. The fibroblasts of control group central distribution and proliferation obvious3. The transplanted hAECs can be found in the experiment group by confocal laser, while there was no hAECs in the control group All macroscopic observation, HE stain and confocal laser detection certified hAECs could suppress the formation of scar effectively. To sum up, the study aim to prove hAECs could inhibit the formation of scar in vitro and vivo experiments, respectively. Therefore, the application of hAECs may be the new method for scar prevention and treatment Key words: amnion, human amniotic epithelium cellshAECs, skin, hypertrophic scar, scar fibroblasts 10 第四军医大学硕士学位论文 前 言 增生性瘢痕常发生在外科 手术、烧伤、外伤后,是临床上常见疾病。 其发生机制尚不明确,研究 表明增生性瘢痕的发生与部位、种族、遗传等 有密切关系,且临床治疗复杂及困难。国内外报道,瘢痕的形成因素之一 是多种炎性因子参与的病理 过程,使正常的创面愈合结果变为增生性瘢痕 的形成。 Gordon 等利用小鼠伤口组织, 采用腺病毒介导的 IL-10 转染 的 方 法, 证实过表达的 IL-10 可以明显的抑制伤口炎症反应, 从而减少瘢痕的 形 成, 进一步验证了抗炎症策略在防止瘢 痕的形成以及治疗中具有重要作 用。 羊膜是从细胞滋养层演化而来的 ,是胎膜的一部分,羊膜细胞包括来 源于胚胎外胚层的上皮细胞(Human amniotic epithelial cells ,hAECs ) 和胚 胎中胚层的间质细胞 (Human amniotic mesenchymal cells,hAMCs ) ,羊膜 上 皮细胞具有部分干细胞表面抗原 标志和特定的转录因子, 如: SSEA-4 、 Oct-4 等。现临床以成功应用在眼 科,利用羊膜上皮细胞的干细胞特性,通过抑 制炎症反应,治疗角膜溃 疡和翼状胬肉等疾病。 本实验通过构建兔耳瘢痕模型,利用羊 膜上皮细胞的干细胞特性,抑 制炎症反应、免疫源性极低 等优点,在创面周围定期注射羊膜上皮细胞悬 液,初步研究羊膜上皮细胞 在抑制瘢痕形成过程中所起的作用。 为增生性 瘢痕的防治和治疗开辟一条新的道路。 11 第四军医大学硕士学位论文 文献回顾 1. 羊膜上皮细胞的研究进展 1.1 干细胞相关基因及标志分子 人羊膜组织主要由上皮细胞层、基底膜、致密层、纤维细胞层、海 绵层组成。羊膜上皮细胞来源于上皮细胞层。新分离的人羊膜上皮细 胞 (hAECs )具有干细胞表面抗原标志, 如 :SSEA-4 、SSEA-3 、SOX-2 、 [1,2] TRA-1-60 、TRA-1-81等,c-kit 和Thy-1 有部分hAECs 表达 。hAECs 还 可 以表达多潜能干细胞特 定的转录因子:如:Oct-4 和Nanog. 但是干细胞中 的端粒酶基因未表达,因此hAECs 不能无限的增殖,具有非致瘤性的优 [1] 点。 在细胞移植这一点 上要比胚胎干细胞更有优越性 。 研究 表明, hAECs 还表达间充质干细 胞的某些标志,如CD29 、CD90 、CD105 、CD44 等。 hAECs 具有多向分化潜能,可以检测到存在神经细胞、肺细胞的基因产 [3] 物如金属蛋白酶的表达 。 1.2 免疫学特性 [4] Sakuragawa 等通过流式细胞术、免疫过氧化物 酶染色证 实hAECs 表面MHC-II 类抗原阴性,MHC-I 类抗原弱阳性,证明hAECs 免疫源性极 [5] 低。Terada 等证明了hAECs 表面不表达HLA-A 、B 、C 和DR 抗原,移 植 [6] 后可防止免疫排斥的发生。Adinolfi 等通过免疫荧光实验技术证明了 hAECs 不表达HLA-A 、B 、C 和DR抗原。 此外有文献报道hAECs 可以分 泌 、 [7 8] 多种抗炎因子,可以抑制移植后的炎症反应 。 12 第四军医大学硕士学位论文 1.3 羊膜上皮细胞的临床应用研究 在基础领域上研究羊膜上皮细胞不仅具有干细胞特性,而且免疫源 性低,有效的抑制炎症反应的发生。在临床治疗某些疾病上的研究也 备 受关注,据文献报道,羊膜上皮细胞具有储存糖原和产生白蛋白的肝 细 [9] 胞典型功能 , 并且在含有胰岛素和地塞米松的培养基培养 的羊膜上皮细 胞, 可以向肝 细胞分化, 而 且表达 肝细胞基因, 如: α1- 抗胰 蛋白酶 和白蛋 [1] 白 。 利用羊 膜上皮细胞的移植通过减少炎症和诱导胶原降 解能有效地降 [10] 低肝纤维化 。另外,通过胎盘源性细胞的移植可以降低博莱霉素诱导 [11] [12] 的肺纤维化 。 Ilancheran 等也报道了人 羊膜上皮细胞具有神经细胞 的 [13] 特性。Kakishita 等 在帕金森鼠模型中证明了人羊膜上皮细胞移植存活 物,并且产生可扩散性因子,阻止因6- 羟多巴胺引起的黑质神经元的死 、 [14 15] 亡。hAECs 可诱导成脂肪细胞、成骨及成 软骨细胞等特点 。 综上所述,hAECs来源丰富,无 伦理学问 题,可分化不同类型细胞 , 具有干细胞的特性,并且免疫源性极低等优点。在组织再生医学和细 胞 代替治疗上开辟一条新的研究方向。 2. 增生性瘢痕的研究进展 皮肤的损伤修复是一 个多因素参与的复 杂过程, 是在多种生长因子、 、 [16 17] 细胞因子、成纤维细胞等共同参与完成的 。长 时间的创面愈合,可 引起周围的巨噬细胞、淋巴细胞、血管内皮细胞释放多种因子刺激成 纤 维细胞增殖,胶原的过度沉积,影响皮肤损伤创面的正常愈合,昀终 形 、 [18 19] 成瘢痕组织 。病理性瘢痕又分为增生性瘢痕 (Hypertrophic Scar , HS ) 和瘢痕疙瘩 (Keloid ,K) 两种。 增生性 瘢痕是一种皮肤的良性肿 瘤 , 也称为肥厚性瘢痕,是临床上一种常见疾病。在皮肤有较大损伤后长 时 13 第四军医大学硕士学位论文 间愈合而形成的。组织学特点胶原纤维呈扁平状,不规则排列,长短 不 [20] 一,界限不清楚,短纤维较多,并伴有漩涡状或结节状结构 。临床表 现为瘢痕明显高于周围的正常皮肤、 变硬 , 形 成的早期瘢痕表面呈红色, [21] 有痛、痒等症状。严重者可发生功能障碍 。其发病机制尚不明确,瘢 痕的效应细胞是成纤维细胞(Fb ) ,主 要产生胶原,大量增生,胶 原 、纤 维粘连蛋白、蛋白多糖过度沉积。正常情况,胞外基质(ECM)的合 成 [22] 和分解的动态平衡维持着胞外基质的相对稳定 。 但瘢痕成纤维细胞的 ECM 明显合 成增加和分解不足 ,研 究发现,瘢痕成纤维细 胞体外合成纤 维连接蛋白是正常成纤维细胞的 4 倍,胶原合成 量是正常的 3 倍。胶原 [23] 的降解减少导致其过度沉积是瘢痕形成的原因之一 。另外,炎症介质 的靶向作用是瘢痕形成的另一重要原因。严重的皮肤损伤,烧伤等使 创 面愈合炎症期延长, 促 使一些因子如碱性成纤维生长因子 (bFGF ) 、转化 生长因子(TGF- β ) 、血小板源性生长因子PDGF 、胰岛 素 样生 长因 子 [24] -1IGF-1 等表达增加,导致 HS 的形 成 。其中,TGF- β 被认为瘢痕形 成中昀关键的细胞因子, TGF- β 包括三个 亚型,TGF- β 与皮肤创面愈 合 1 [25] 及瘢痕形成有密切相关 。bFGF 在创面愈合中也是一个重 要成员, 能 够 、 [26 27] 促 进血管 内皮细胞的分裂 。 而 且刺激胶原酶的产生, 抑制?型胶原 [28 、29] 的合成与沉积, 起 到负调节作用 。 ,PDGF 在伤口愈合过程中由血小 板分泌的 α 颗粒释放。 创 伤时,PDGF 能够趋化成纤维细胞、 角 质细胞 及 、 [30 31] 血管平滑肌细胞分裂 增殖,参 与修复过程 。另外,临床上也采用一 些抗炎症因子如干扰素- α 、 β, 皮质激素, 抑 制 性细胞因子 , 甲 氨 喋呤等 [26] [27] 减少瘢痕的形成治疗 。 Ferguson 等利用一系列 实验证明 IL-10 在瘢痕 形成中的重要性,通过去 除 IL-10 的小鼠胎儿皮肤上明显出现炎性反应, 14 第四军医大学硕士学位论文 [28] 并且有瘢痕形成。 而对照组的小鼠则无此现象。Xue 等 发 现瘢痕疙瘩成 纤维中 IL-6mRNA 的表达较正常皮肤成纤维细胞高 。增生性 瘢痕的防 治 主要包括手术和非手术治疗方法,手术仍是主要的治疗手段,但复发 率 [29] 较高。2005 年 Judith 等采用组织工程皮肤的构建技术 ,为增生性瘢痕 [30] 的研究提供了新的研究手段。 。2005 年 Hohelfeld 在利用 胎儿的皮肤细 胞构建组织工程皮肤,移植给病人,发现修复后的皮肤瘢痕明显减少 , 减轻修复创面的收缩现象 。 上 皮细胞通过通路来促进纤维化 和瘢痕形 成, [31] 如:磷脂 肌醇-3- 激酶、Smad 、TGF- β 和结缔组织生长因子等 。在 瘢 痕 、 [32 33] 形 成期间 , 上 皮细胞刺激成纤维细胞的内部结构变化 。 并且在 活化 阶段成纤维细胞大量堆积,并参与一些细胞因子的自分泌循环、维持 纤 [32-34] [20] 维化 。2009 年我科 王新文博士 利用 组织工程皮肤研究表皮干细胞 在增生性瘢痕中的防治作用。通过一系类的体外和体内实验证明,表 皮 干细胞在抑制瘢痕的形成中有着重要作用,提示了干细胞在瘢痕防治 中 有着及其重要的作用。近年来国内外学者对干细胞研究层出不穷,是否研究 一种新的干细 胞来抑制瘢痕的形成?由此推测羊膜上皮细胞是否可以成为一颗新星 , 为皮肤瘢痕的防治提供新的研究方向 15 第四军医大学硕士学位论文 正 文 实验一 羊膜上皮细胞的分离、培养及鉴定 1.材料 A. 标本来源 无菌采集足月正常妊娠 产妇剖宫产术羊膜, 取于第四军医大学西京医院妇产科。 B. CO 培养箱 美国 Thermo 公司 2 C. SW-CJ-1B 型超净工作台 苏净集团 D. 倒置显微镜 OLYMPUSE. 低温冰箱Haier 公司 F. 低温高速离心机北京医用离心机厂 G. 一次性塑料培养瓶、培养板 NUNC 公司 H. 胎牛血清杭州四季青生物有限公司 I LG-DMEM 培养液 GIBCO 公司 J. 胰蛋白酶 SIGMA 公司 K. 非必需氨基酸 GIBCO 公司 L. 2 一巯基乙醇GIBCO 公司 M. 丙酮酸钠 GIBCO 公司 N. 表皮生长因子 SIGMA 公司 16 第四军医大学硕士学位论文 2.方法 2.1 羊膜上皮细胞的分离与培养A. 在无菌条件下取剖宫产术中的胎膜 组 织, 钝性分离胎盘脐带面的羊 膜组织, 约 7×10cm 大小, 用 PBS 缓冲液充分冲洗去除其细胞碎片、 血液。 B. 将羊膜组织切成两块分别装入 75ml 培养瓶,用含有 0.02 %EDTA 的 2.5g/L 胰蛋白酶溶液,37 ?消化 15min ,弃消化液。 C. 第二次消化方法同第一次, 37 ?消化 20min ,每 5min 均匀摇晃一 次, 通过不锈钢网过滤, 收集单细胞悬液, 加含 10 %胎牛血清的培 养基终止消化。相同方法再消化两次。 D. 合并 3 次收集的细胞悬液,800r/min 离心 5min , 弃上清, 收 获细胞 即为 hAECs 。 E. 用 LG-DMEM 培养基 含 10 %的胎牛血清、2mmol/L-谷氨酰胺、1 %非必需氨基酸、55?mol/L2- 巯基乙醇、1mmol/L 丙酮酸钠 重新悬 5 -1 浮细胞,以 2×10 ml 接种于 75 ml 培养瓶内 含 10mg/L 的表皮生 长因子 。 F. 将培养瓶置于 37 ?、饱和湿度、5 %CO 环 境下培养,48 ~72 h 细 2 胞贴壁伸展后, 更换培养液, 弃去未贴壁的细胞。 G. 根据细胞生长情况,每 3 ~4d 换液 1 次。待细胞达到 80% ~90% 融 合时 ,用 2.5g/L 的胰酶消化,按 1 :2 传代。取第一代细胞进行鉴定 2.2 羊膜上皮细胞的鉴定 2.2.1 细胞增殖能力观察 3 2 A. 取第一代羊膜上皮细胞,以 3×10 /m 的密度 接种于 96 孔板; -1 B. 培养 2d 后,取 4 孔加入 MTT5g?L 20ul, 继续培 养 12h ; C. 吸弃上清,加入 150ul DMSO 振荡 10min ; 17 第四军医大学硕士学位论文 D. 用酶联免疫检测仪测定 490nm 的 OD 值; E. 以后每天重复测量,取均值绘 制羊膜上皮细胞的生长曲线。 2.2.2 流式细胞术分析 6 A. 收集第一代培养的 hAECs ,调整细胞密度 1xl0 /mL,取 200 ?L 细 胞悬液; B. 将细胞悬液加入荧光标记单抗 CD29 、 CD90 、 CD105 、 CD34 和 CD45 各 3?L ,混匀,室温避光孵育 4 ?冰箱 1h ; C. 1h 后每管加 2mL 含 1g/L PBS 缓冲液, 混匀, 1000r /min 离心 5min , 弃上清,振荡悬浮细胞; D. 每管再加入 10g/L 多聚甲醛 300L ,混匀; E. 用流式细胞检测 CD29 、CD90 、CD105 、CD34 、CD45 的表达情况; 2.2.3 免疫荧光染色 A. 取对数生长第 2 代细胞, 将细胞接种到预先放置 1×1mm 盖玻片的 24 孔培养板中培养 1 天至 3 天; B. 取出盖玻片的 24 孔板浸入 PBS 缓冲液清洗 2 次,冷丙酮固定 10min ; C. 抗原修复液修复 1 分钟,以提高阳性显色; D. PBS 缓冲液 洗 3 次,每次 5min ; E. 分别加入按比例稀释的? 抗单克隆鼠抗人 SSEA-4 (Bio ),OCT-4 (Bio ) ,4 ?湿盒过夜,复温 1h ; F. PBS 振洗 3 次,每次 5min ; G. 滴加按比例稀释的二抗罗丹 明标记山羊抗小鼠荧光; H. PBS 振洗 3 次,每次 5min ; I. 然后用蒸馏水振洗 1 次; J. 用 500ml/L 无荧光缓冲甘油封片; K. 荧光显微镜下观察并选择适当视野照相。 18 第四军医大学硕士学位论文 2.2.4 hAECs 定向诱导成脂成骨分化能力 4 A. 取生长状态良好的第一代羊 膜上皮细胞,密度为 2 x10 个/ml 分别 接种于两个 6 孔板内; B. 24 小时后将培养液分别换用成 脂,成骨诱导液; C. 每 3 天换液一次,定期镜下观察细胞形态变化; D. 光学纤维镜下观察并照相。 3.结果 3.1 细胞增殖 MTT及光学显微镜下细胞形态结果 羊膜上皮细胞经胰酶消化培养,细胞活力大于 90% ,原代培养第 2 天 后有大量细胞贴壁, 第 3 天后细胞伸展, 形态圆形、 卵圆形和三角形。 第 4 天细胞汇合可达 90% , 呈 铺路石样紧密排列 ( 图-1 ) 。 传 代后细胞易于贴壁, 增殖速度较快,细胞形态好。第 5 代以后的 hAECs 增殖 速度缓慢,胞体较 大成扁平状,细胞成团状生长(图-2 ) 。 从生长曲线显示, 接种后的 1 ~2d 为 hAECs 生长潜伏期, 为贴壁时期, 第 3 ~5d 为 hAECs 的对数生长期, 细胞增殖活跃, 第 6 天后细胞增殖缓慢, 生长趋于稳定,为平台期 。图-1 原代培 养 的 hAECs图-2 第 5 代的 hAECs 19 第四军医大学硕士学位论文 3.2 流式细胞术分析 流式细胞术 (Flow cytometer ,FCM) 分 析显示, 原代 hAECs 不同 程度 的表达 CD29 、CD90 、CD105, 其中 CD29 阳性率昀高,可达 73% ,说明人 羊膜上皮细胞兼有间充质干细胞的表型特点 (图-4 ) 。CD90 、CD105 阳性率 较低(图-5、图-6 ) 。 图-4 hAECsCD29 的表达 图-5 hAECsCD90 的表达 图-6 hAECsCD105 的表 达 3.3 免疫荧光染色 免疫荧光结果显示,SSEA-4 ,OCT-4 均有阳性表达 ( 图-7、图-8 ) 。对 照组为阴性, 无 红色荧光 (图-9、图-10 ) 。 说明羊膜上皮细胞具有干细胞表 20 第四军医大学硕士学位论文 面抗原标志和干细胞的转录因子。 图-7 SSEA-4 阳性 ,为 红色荧 光染 色图-8 OCT-4 阳 性, 为为红 色荧 光染色图-9 SSEA-4 阴 性表达 图-10 OCT-4 阴性 表达 3.4 成脂、成骨诱导分化 成脂诱导液连续诱导 7d 后,羊膜上皮细胞增值速度 变慢,胞体变大, 胞浆内开始出现脂滴,随着 诱导时间延长,脂滴增多,互相融合,成葡萄 状, 连续诱导 21d 后, 大部分细胞出现了脂滴, 油红 O 染 色呈桔红色 图-11 。 对照组细胞增值速度和形态无明显变化、无脂滴出现 图-12 。成骨诱导液 培养细胞后,细胞增值速度 仍较快,细胞由长梭形变为短梭形,分泌大量 细胞外基质。诱导 14d 后在细胞密集区域出现钙 盐沉积,形成大小不等的 特征性的矿化结节,随着诱 导时间延长,细胞继续增长聚集,矿化结节增 21 第四军医大学硕士学位论文 多。诱导 4 周后,4% 多聚甲醛固定,茜素红染色,形成 的矿化结节呈深红 色 图-13 ,未诱导的细胞无矿化结节形成 图-14 。图-11 hAECs 成 脂诱导 3W,油红 O 染色图-12 未经 诱导 的细胞 内无 脂滴 出现 脂 滴呈桔红色图-13 hAECs 成骨诱导 4W,矿 化结节 图-14 未经 诱导 的细 胞无矿 化结 节形成 茜 素红 染色为 深红 色 4. 讨论 羊膜组织来源丰富、系产后废弃物 、无伦理学问题、