大鼠臂丛神经放射性损伤后脊髓前角运动神经元及神经轴突的变化

大鼠臂丛神经放射性损伤后脊髓前角运动神经元及神经轴突的变化 论文分类号 R 322 单位代码 10183 密 级 限 定 研究生学号 2002732094 吉 林 大 学 硕 士 学 位 论 文 大鼠臂丛神经放射性损伤后脊髓前角运动 神经元及神经轴突的变化研究 Study on the changes of motor neurons in ventral horn and axons in spinal cord after radiation induced brachial plexus injury of rats 作者姓名孙 祖 林 专 业手 外 科 导师姓名 刘 志 刚 及 职 称教 授 学位类别临床医学硕士 论文起止年月2003年5月至2005年4月 吉林大学硕士学位论文原创性声明 本人郑重声明所呈交的硕士学位论文是本人在指导教师的指导下独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外本论文不包括任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名 日期 年 月 日 《中国优秀博硕士学位论文数据库》投稿声明 研究生院 本人同意《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》出版章程的内容愿意将本人的学位论文委托研究生院向中国学术期刊光盘版电子杂志社的《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》投稿希望《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》给予出版并同意在《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》和CNKI系列数据库中使用同意按章程规定享受相关权益。 论文级别? 硕士 ?博士 学科专业 论文目大鼠臂丛神经放射性损伤后脊髓前角运动神经元及神经 轴突的变化研究 作者签名 指导教师签名 年 月 日 作者联系地址邮编 作者联系电话 作者姓名 孙祖林 论文分类号 R 322 保密级别 限定 研究 医学硕士 授予学位单位吉林大学 专业名称 手足外生学号 2002732094 学位类别 科 培养单位 第一临床医学院 研究方向 周围神经损伤与修复 学习时间 2002年9月 至2005年7月 论文中文题目 大鼠臂丛神经放射性损伤后脊髓前角运动神经元及神经轴突的变化研究 论文英文题目 Study on the changes of motor neurons in ventral horn and axons in spinal cord after radiation induced brachial plexus injury of rats 关键词 臂丛神经 放射性损伤 脊髓前角运动神经元 神经轴突c-fos基因 姓 名 刘志刚 职 称 教 授 导师情况 学历学位 博 士 工作单位 吉林大学第一临床医学院 论文提交日期 2005年5月10日答辩日期 2005年 月 日 是否基金资助项目 否 基金类别及编号 如已出版请填写以下内容 出版地城市名、省名 出版者机构名称 出版日期 出版者地址包括邮编 借此论文首页谨向三年来给予我殷切教诲和细心指导的刘志刚教授致以崇高的敬意和衷心的感谢 您渊博的学识敏锐的思维严谨的治学态度忘我的敬业精神和孜孜以求的工作作风使我受益匪浅并将永远激励和鞭策我在科研道路上不断前进。 提 要 随着肿瘤放射治疗的广泛应用辐射引起的周围神经损伤明显增多。臂丛神经作为周围神经的组成也是放疗常见并发症。本研究模拟乳癌放疗探讨了臂丛神经受大剂量X线照射后总剂量30 Gy肱二头肌、臂丛神经上干及脊髓前角运动神经元细胞损伤的形态组织学变化、电生理改变及凋亡相关c-fos 基因的表达。 我们应用X线照射对大鼠局部照射成功地制备了大鼠臂丛神经损伤模型。实验组大鼠的照射侧表现出典型的臂丛神经损伤特征。实验结果显示臂丛神经损伤后大鼠上臂肱二头肌发生萎缩双侧臂围差明显增加肌湿重明显减少。肌电图显示照射侧肌电潜伏期显著延长肌电动作电位显著降低。同时照射侧脊髓前角运动神经元存活数目随时间延长而明显减少可见神经元皱缩细胞核溶解等细胞死亡征象肌皮神经周边部分轴索呈严重变性。免疫组化结果显示与神经元凋亡有关的c-fos基因在照射后3周实验组呈高阳性率在损伤晚期低表达。实验所显示的病理改变在照射后3周 之前进展明显在照射停止3周后减慢甚至轻微改善。 本实验揭示了大剂量电离辐射作用下放射性臂丛神经损伤的产生及发展规律对放疗引起周围神经损伤的预防、诊断和治疗具有重要的理论和实际意义。 关键词臂丛神经放射性损伤脊髓前角运动神经元神经轴突c-fos基因 目 录 文献综 述???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????1 引 言???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????6 材料与方法????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????8 实验结 果???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????15 讨 论???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????36 结 论???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????40 参考文献???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????41 中文摘要???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????1 英文摘 要???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????3 致 谢 导师及作者简介 大 学 硕 士 学 位 论 文 ??1??文献综述 1、放射性疾病的定义 放射性疾吉 林 病是指电离辐射所致损伤或疾病的总称。电离辐射可诱发全身性疾病及各组织器官的损伤。体内细胞群体放射敏感性不同体内细胞群体依其更新速率不同分为三大类。第一类是不断分裂更新的细胞群对电离辐射的敏感性较高。包括造血淋巴组织细胞、胃肠黏膜上皮细胞和生殖上皮细胞等。第二类是不分裂的细胞群体对电离辐射有相对的抗性从形态损伤角度衡量。包括神经细胞、肌肉细胞、成熟粒细胞、红细胞等均为高分化的终末细胞。从形态上看对辐射抵抗力很强但并不是说它对辐射不发生反应。第三类细胞在一般状态下基本不分裂或分裂速率很低因而对辐射相对不敏感但在受刺激可迅速分裂其放射敏感性随之增高典型的有再生肝。Berognie和Tribondeau提出一条定律即组织放射敏感性与其细胞分裂活动成正比而与其分化程度成反比4。 2. 臂丛神经损伤 2.1 臂丛的组成 臂丛由C5678和T1神经根组成。分为根、干、股、束、支五部分终末形成腋、肌皮、桡、正中、尺神经。在根、干、束部有神经分支发出这些分支对臂丛损伤的定位诊断有重要意义。C5神经根主要形成腋神经支配三角肌C6神经根主要形成肌皮神经支配肱二头肌C7神经根主要形成桡神经支配上肢伸肌群C8神经根主要形成正中神经支配指屈肌群T1神经根主要形成尺神经支配手内部肌群。 2.2 病因 臂丛神经损伤并不少见上肢的过度牵拉、锁骨和第一肋骨骨折、肩关吉 林 大 学 硕 士 学 位 论 文 ??2??节脱位、锁骨上窝外伤、刀刺伤、颈部手术等均可引起臂丛神经的全部或部分损伤。据国内统计臂丛损伤的主要病因依次为牵拉伤、压砸伤、切割伤、医源性损伤产伤、手术伤、药物性损伤、火器伤、放射性损伤等。 2.3损伤的类型和表现 根据损伤的部位可分为根性损伤、干性损伤、束性损伤和全臂丛损伤四类5。 1神经根损伤可分为上臂丛神经损伤和下臂丛神经损伤。?上臂丛神经损伤C5-7包括腋、肌皮、肩胛上下神经、肩胛背神经、胸长神经麻痹桡神经和正中神经部分麻痹。主要表现为肩不能上举肘不能屈曲而能伸屈腕力减弱上肢伸面感觉大部分缺失。三角肌和肱二头肌萎缩明显前臂旋前亦有障碍手指活动尚正常。?下臂丛神经损伤C8-T1包括前臂及臂内侧皮神经、尺神经麻痹正中神经和桡神经部分麻痹。表现为手功能丧失或严重障碍肩肘腕关节活动尚好。常出现患侧Horner征。检查时可见手内部肌全部萎缩尤以骨间肌为甚有爪形手、扁平手畸形。前臂及手尺侧感觉缺失。 2神经干损伤可分为神经上干 C56、中干C7、和下干C8T1损伤。?上干损伤出现腋神经、肌皮神经、肩胛上神经麻痹桡神经和正中神经部分麻痹临床表现与上臂丛损失相似。?中干独立损伤在临床上少见除了短期内伸肌群肌力有影响外无明显的临床症状和体征。?下干损伤出现尺神经、正中神经内侧根、上臂和前臂内侧皮伸肌麻痹表现与下臂丛损伤相似即手功能全部丧失。 3神经束损伤神经束损伤后所产生的症状体征十分规则根据臂丛结构就可明确诊断。?外侧束损伤出现肌皮、正中神经外侧根、胸前神经麻痹。?内侧束损伤出现尺、正中神经内侧根、胸前内侧神经麻痹。?后束损伤肩胛下神经、胸背神经、腋神经、桡神经麻痹。 吉 林 大 学 硕 士 学 位 论 文 ??3?? 4全臂丛神经损伤全臂丛损伤的后果严重在损伤早期整个上肢呈弛缓性麻痹各关节不能主动运动。由于斜方肌功能存在有耸肩运动。上肢感觉除了臂内侧尚有部分区域存在外其余全部丧失。上肢腱反射全部消失。肢体远端肿胀并出现Horner综合征。 3、放射性臂丛神经损伤 外周神经对辐射耐受性较高但在放射过程中剂量过高亦会发生损伤称为放射性周围神经损伤。臂丛神经作为周围神经的组成也是常规放疗常见的并发症。常规放疗3040 Gy可引起神经丛损伤。如放射治疗乳腺癌及头颈部恶性肿瘤常引起放射性臂丛神经损伤。该病常以患肢感觉、运动障碍及疼痛为主要表现伴有严重的夜间痛晚期会导致整个肢体的功能丧失严重影响病人的生存质量。随着恶性肿瘤治疗手段的改进和提高病人生存期的延长该病的发病率正在逐渐上升。目前尚无任何有效的治疗方法这是医学界的难题之一。 3.1 放射性臂丛神经损伤的临床表现 照射野区皮肤红肿、破溃患侧肢体麻木、酸胀感觉减退或消失运动障碍痛觉过敏或剧痛受损侧肢体温度降低指甲干燥肌肉进行性萎缩最后出现软瘫。 根据临床表现程度分为 1不完全损伤症状持续存在或随时间的推移而有所减轻、患肢功能减退或部分丧失 2完全损伤型症状急剧加重、患肢功能丧失最终发展为软瘫。 3.2 放射性臂丛神经损伤的临床特征与诊断 3.2.1 临床特征 该病具有迟发性的特点Fardin等6指出放射治疗引起的神经进行性退变其进展较缓慢而且几乎是持续恶化很少有治愈的可能。一般来说吉 林 大 学 硕 士 学 位 论 文 ??4??放射性臂丛神经损伤的无症状期短者数个月最长可达20年。Tairych等7认为放射性臂丛神经损伤是渐进性的过程其局部病变具有不可逆性。 3.2.2 临床诊断 放射性臂丛神经损伤在国内外至今尚无确切的诊断有些观点甚至相互矛盾制约了该病的早期诊断及治疗。我们认为在临床ぷ髦杏Σ握展擞穸 ?制定的臂丛神经损伤诊断标准结合患者的放射治疗史、无症状间歇期及临床特点可初步确定诊断。但必须排除肿瘤转移及压迫所致的臂丛神经损伤。通常放疗后所致的周围神经损伤其照射区软组织呈板样硬局部较平坦无局限性隆起或结节样肿物而癌肿所致的神经损伤在局部可触及进行性增大的肿物8。MRI、CT、核素扫描、B超检查、肿瘤相关因子的测定等均有一定的诊断价值尤其在排除肿瘤转移方面意义较大。另外神经电生理检查可以帮助确定神经损伤的程度与定位并对预后的估计有一定价值。 3.3 放射性臂丛神经损伤的发病机制 放射引起机体损伤的机理主要是通过电离辐射作用局部释放很大的能量引起作用物的电离和激发电离和激发产生高反应性、不稳定性特点的自由基自由基对DNA碱基损伤同时自由基能攻击生物膜中的不饱和脂肪酸引发链式反应导致细胞代谢和功能障碍。 放疗对臂丛的损伤并非射线对神经纤维的直接作用。Rubin等5认为放射性物质使臂丛神经的营养血管受到损害神经的微循环受到破坏神经处于缺血、缺氧状态致使神经轴突退变及脱髓鞘。而臂丛神经的周围软组织的水肿、坏死逐渐形成纤维 化、瘫痪化乃至组织挛缩亦会加重以上改变并可能对神经干造成直接压迫最后导致神经传导障碍。 以往的研究结果证实了1放射治疗1个月后血管壁发生炎性坏死及内皮细胞脱失。放射治疗半年后血管的改变以修复性增生为主造成管吉 林 大 学 硕 士 学 位 论 文 ??5??腔狭窄微小血栓形成从而导致神经缺血9 10?放射区臂丛神经的周围组织、神经束间及神经束内的纤维结缔组织及脂肪发生变性并逐渐形成广泛的纤维化、瘢痕化乃至组织挛缩。这可使臂丛神经广泛绞窄神经干、神经束及神经纤维受压。如果该变化持续作用于臂丛神经不仅使神经内外的微循环受到破坏还会导致神经顺应性下降神经内外微循环的变化与结缔组织的变化相互作用形成恶性循环使病情难以控制不易治愈。神经轴突内压的增高可诱发神经自发电位从而导致患肢产生自发性疼痛。3Johansson等11通过MRI检查发现1例声门上癌患者经放疗后臂丛神经损伤其中、小斜角肌过度紧张。他们认为神经损伤可能为肌肉紧张压迫所致。4乳腺癌及头颈部恶性肿瘤手术过程中使臂丛神经本身受到一定程度的牵拉神经顺应性下降血液循环也遭到一定程度的破坏9。同时术区的脂肪被大量切除也破坏了脂肪组织对神经的保护作用。但在何杰金氏淋巴瘤的病例中并未进行过手术治疗而出现了放射性神经损伤1213可见这一理论的科学依据并不很充分。 放射敏感性的遗传学差异及个体差异也是不容忽视的因素。个体间的放射敏感性差别是内在因素而放射剂量的增加、高能射线的使用、放射重叠区的出现是外在因素。有实验证实14加大放射剂量会使臂丛神经损伤的潜伏期变短症状更重预后更差。乳癌60Co放射治疗的安全剂量为1.8-2.5 Gy总剂量45-53 Gy。但由于乳癌的照射区域在锁骨上下区和腋区放射强度在安全剂量一般不会造成臂丛神经损伤但由于锁骨上和腋部照射时可能形成交叉重叠区而达到高剂量5。此外放射的最高剂量区由于从皮肤移至皮下乃至深层掩盖了大剂量照射对深部组织的损害稍不注意就会加重对神经及周围组织的损害6 12。 吉 林 大 学 硕 士 学 位 论 文 ??6??引 言 随着肿瘤发病率的增高放射治疗已成为治疗肿瘤的重要手段之一。临床采用放射治疗与手术治疗、化学药物及生物治疗联合应用的方法发挥其综合治疗效果提高患者治愈率。随着恶性肿瘤治疗手段的改进和提高病人生存期的延长该病的发病率正在逐渐上升放射引起的周围神经损伤明显增多。放射性臂丛神经损伤radiation induced injury/damage of brachial plexus已成为放射治疗乳腺癌及头颈部恶性肿瘤的严重并发症之一1。乳癌是女性发生的最普遍的一种肿瘤是继肺癌之后第二大肿瘤每年大约100万新增确诊病例乳癌术后放疗是常规治疗方法由此而引起的臂丛神经损伤明显增多2。且臂丛神经损伤多为迟发性渐进病变。神经损伤早期往往不是就诊的主要疾病常被忽视或误诊如出现严重上肢功能障碍多为臂丛神经不可逆性晚期损伤临床多种治疗方法都不能阻止病情的发展。随着患者生存期的延长及对生存质量要求的提高对该疾病的诊治有了更高的要求但是目前对其治疗尚无任何明显有效治疗方法寻找新的治疗途径是医学界急待解决的难题。 放射性臂丛神经损伤常以患肢感觉、运动障碍及疼痛为主要表现伴有严重的夜间疼痛晚期会导致整个肢体的功能丧失。其发病机制目前尚不十分清楚可能是由多种因素相互作用而产生的生物效应。Rubin等3认为该病是由放射性物质引起臂丛神经的营养血管受损所致神经的微循环受到破坏神经处于缺血、缺氧状态致使神经轴突退变和脱髓鞘。而臂丛神经的周围软组织的水肿、坏死逐渐形成纤维化、瘫痪化乃至组织挛缩亦会加重以上改变并可能对神经干造成直接压迫最后导致神经传导障碍。具体表现为血管直接损伤发生血管炎性坏死臂丛神经广泛绞窄神 经干、神经束及神经纤维受压等。 吉 林 大 学 硕 士 学 位 论 文 ??7?? 关于其它因素所致臂丛神经损伤的动物实验研究较多而对放射性臂丛神经损伤的实验研究目前未见相关报道多为临床病例回顾性分析。鉴于大鼠的臂丛神经在形态结构和功能解剖等方面都与人类极为相似我们模拟乳癌常规放疗方案采用分割照射方式建立了大鼠臂丛神经放射性损伤模型采用大体观察、组织形态学、神经电生理学及免疫组化技术等方法从整体、细胞和分子层次研究周围神经照射后脊髓前角运动神经元、周围神经及其支配肌肉损伤的变化以及损伤的发展规律进而为临床防治放疗并发症提供实验依据。 吉 林 大 学 硕 士 学 位 论 文 ??8??材料与方法 1 主要试剂与仪器 1.1 试剂 2.5的戊二醛锇酸甲苯氨蓝酒精丙酮氧化丙烯氯胺酮 10甲醛 罗克沙尔固蓝溶液luxol fast blue固蓝0.1 g95 酒精100 ml10 醋酸0.5 ml混合过滤。 0.05碳酸锂溶液碳酸锂0.5 mg蒸馏水 1000 ml 0.25甲酚固紫甲酚固紫0.25 mg10醋酸1.0 ml蒸馏水100.0 ml混合过滤。 曙红Y 1甲苯胺蓝染色液配制取甲苯胺蓝粉1S10醋酸液10ml 无水酒精4ml加蒸馏水86ml而成。 氨银液 将30 ml 20硝酸银溶液与20 ml无水 滴即可。用时新配乙醇混合然后逐滴加入氢氧化铵直至沉淀恰好溶解再加氢氧化铵5 置于棕色瓶中4度冰箱内保存备用。 5硫代硫酸钠 0.02氯化金 3H2O2甲醇 3正常羊血清 兔抗鼠c-fos多抗 生物素酰化羊抗兔IgG SP试剂盒购自如Santa Cruz Biotechnology公司 磷酸缓冲液0.1 mol/L、PH 7.4 PBS 吉 林 大 学 硕 士 学 位 论 文 ??9?? 1.2 仪器 深部X线照射机 Philips荷兰 光学显微镜 Olympus日本 双人 显微外科手术器械 宁波成和显微器械厂 石蜡双目镜手术显微镜 上海医疗器械厂 切片机 LEICA INSTRUMENTS GMBH 德国 显微器械 上海医用器械厂 Nicolet Viking?肌电测量仪 意大利百胜 图象分析仪 NNOVATIS德国 2 实验动物与分组 选用健康成年SD大鼠20只长春高新实验动物中心提供体重200300g雌性。随机分成臂丛神经损伤组实验组和正常对照组实验组又根据损伤后取材时间的不同分成损伤后3周、5周、7周和9周4个时间组每个时间组和对照组各4只大鼠。 3 动物模型的制备 实验组选取左侧为照射侧右侧为对照侧。模拟分割照射方案每日照射1次每次2.0 Gy深部X线照射每周5次达到总剂量30 Gy后分别于末次照射后3周、5周、7周和9周后取材。 照射点以上肢水平连线与左下颌角垂直线相交点为照射中心 照射面积1.54×1.54 CM 照射条件电压200 kV电流10 mA滤板0.5 mm Cu和1.0 mm Al。 计量率0.287 mGy/s管球距照射部位50 cm。 4 取.