2、caspase-3 mRNA水平表达与大脑皮质及纹状体区炎性细胞浸润

2、caspase-3 mRNA水平表达与大脑皮质及纹状体区炎性细胞浸润 2、caspase-3 mRNA水平表达与大脑皮质及 纹状体区炎性细胞浸润 ? 428? 对照增高,且随病程延长AR活性增加.继续延长大鼠饲养时 间,AR活性的增加可能会有统计学意义,提示临床上随着糖尿 病患者病程的延长,并发症的出现,AR活性也可能会逐步增 高;AR活性的动态观察,有可能作为糖尿病并发症发展进程的 监测指标之一. 4参考文献 1DentMT,TebbsSE,GonzalezAM.Neutrophilaldosereduetaseactivity anditsassociationwithestablisheddiabetiemierovaseularcomplications (J].DiabetMed,1991;8:439-42. 2HamadaY,KitohR,RaskinP.Crueialroleofaldosereduetaseactivity andplasmaglucoselevelinsorbitolaccumulationinerythrocytesfromdi- 中国老年学杂志2005年2月第25卷 abetiepatients[J].Diabetes,1991;40:1233-40. 3LowryOH,RobertsNR,KapphahnJ1.Thefluommetrie,measurementof pyridinenueleotides[J].JBiolChem,1957;224:1047-64. 4LowryOH.CarterJG.Stabilizingthealkali-generatedfluorescentderiva' tivesofNADandNADP[J].AnalBioehem,1974;59:639-42. 5DufraneSP,MalaisseWJ,SenerA.Amicmmethodfortheassayofaldose reduetase.itsapplicationtopancreaticislets[J].BiochemMed,1984; 32:99-105. 6沈守祥,董砚虎,孟祥风,等.红细胞醛糖还原酶荧光法的建立及意 义[J].潍坊医学院,1997;19:24_4. [2004.12.26收稿2005-01.20修回] (编辑牛铁兵) 脑缺血再灌注后bcl一2,caspase一3mRNA水平表达与大脑皮质及 纹状体区炎性细胞浸润 刘广义解建波宋金明(青岛大学医学院附属医院脑血管病研究所,山东青岛266003) (摘要]目的探讨大鼠脑缺血再灌注后bcl-2蛋白,easpase一3mRNA的表达及炎性细胞浸润与神经细胞凋亡的关系.方法将54只Wistar 大鼠随机分为二组:假手术组,缺血再灌注组.采用原位末端标记(TUNEL),免疫组化和原位杂交技术分别观察脑缺血再灌注后不同时间点神经细 胞凋亡及损伤的变化与bc1.2,easpase-3mRNA表达.结果bc1.2表达于缺血再灌注l2,24h达高峰,再灌注2—4d呈下降趋势,至16d略高于假 手术组;easpase.3mRNA于缺血再灌注l2—24h达高峰,2—4d呈降低趋势,至16d略高于假手术组.结论脑缺血再灌注后细胞凋亡介导神经细 胞损伤,坏死是一个渐进的动态演变过程.bcl-2蛋白,easpase.3mRNA表达在抑制细胞凋亡和介导神经细胞损伤等方面起非常重要的作用. (关键词]缺血再灌注;细胞凋亡;炎性细胞浸润;bc1-2;easpase一3mRNA (中图分类号]R338.8(文献标识码]A(文章编号]1005-9202(2005l04-0428-03 脑缺血再灌注后细胞凋亡引起脑组织炎症性介质,介导神 经细胞损伤,坏死,导致炎性细胞浸润,目前已引起高度重视. 对抑凋亡蛋白bcl一2的实验研究已得到肯定,而且促凋亡基因 caspase-3也已是目前的研究热点.据Buemi等研究证实,脑 缺血时存在着缺血性再灌注损伤,并与炎症密切相关.许多研 究者表明,bcl4及caspase-3mRNA被认为分别具有抑制和促 进细胞凋亡的作用.本研究采用大脑中动脉阻塞法(MCAO) 制备脑缺血再灌注动物模型,采用原位末端标记(TUNEL),免 疫组化和原位杂交技术探讨bcl-2,caspase-3mRNA水平表达及 炎性细胞浸润与神经细胞凋亡关系的影响. 1与方法 1.1动物模型的建立选用成年健康Wistar大鼠54只,体重 在200,240g,由青岛市药物检验所动物中心提供,随机分为 缺血lh再灌注后2,6,12,24h及2,4,8,10d,假手术组,每组 6只.参照Longa等的颈外动脉线栓法建立MCAO动物模 型.假手术组除不插线外其余同实验组. 1.2标本采集实验组动物在规定时间点取材,使用4%多 1临沂市人民医院神经内科 作者简介:刘广义(1958一),男,实验师,主要从事脑血管病及细胞生物 学研究. 聚甲醛(4?)经心脏灌流固定,断头取脑备用.假手术组缺血 再灌注24h取材.取材范围为额极6mE处,连续冠状切片, 切片厚度5m,间隔100Ixm,取8张.置于4%多聚甲醛(含 DEPC,1/50oo)后固定2h,酒精脱水,二甲苯透明,浸蜡,包埋; 分别进行HE染色,TUNEL染色检测,bcl一2免疫组化及 caspase一3mRNA原位杂交染色. 1.3实验方法 1.3.1细胞凋亡检测细胞凋亡检测试剂盒,DAB显色试剂 盒,均由武汉博士德生物有限公司提供.按试剂盒说明进 行操作,DAB显色,苏木精轻度复染,细胞核中有棕黄色颗粒者 为TUNEL阳性细胞,即凋亡细胞. 1.3.2bc1-2免疫组化染色浓缩型SABC免疫组化染色试剂 盒与bcl-2单克隆抗体均购自武汉博士德生物有限公司,实验 步骤按试剂盒说明进行,DAB显色.细胞浆出现棕黄色颗粒, 也有部分胞膜着色为阳性细胞. 1.3.3caspase-3mRNA原位杂交染色caspase一3mRNA原位 杂交试剂盒,DAB显色试剂盒均由武汉博士德生物有限公司提 供.实验步骤按试剂盒说明进行,DAB显色.在高倍光镜下观 察细胞浆染色呈棕黄为阳性细胞. 1.4统计学处理应用VIDAS一21系统,在高倍镜下测定光密 度OD值,结果以?s表示,各相邻时间点相同区域间的比较, 缺血周围区与缺血中心区间的比较,均采用t检验. 血 2结果 2.1TUNEL细胞凋亡检测结果假手术组可见少数TUNEL 阳性细胞.在缺血再灌注周围区,再灌注2h即出现凋亡细胞, 随着再灌注时间的延长逐渐增多,阳性细胞核呈棕黄色颗粒, 至24h达高峰,2d开始下降,至16d时仍高于假手术组,各相 邻时间点比较差异显着.缺血中心区凋亡细胞数量较少,其变 化规律与缺血周围区相似,除再灌注2h,8,8,16d外,其余各 时间点无显着性差异.同一时问点相比较,除2h,8,16d外, 缺血周围区凋亡细胞数均显着高于缺血中心区(表1). 表1脑缺血再灌注后凋亡细胞在不同时间点及 不同区域的定量观察(个/视野,Jl=6,-t-S) 相邻时间点比较:1)P<0.05;与同一时间点周围区比较:2)P<0.05 2.2bcl-2蛋白表达结果假手术组脑组织仅见bc12微弱表 区炎性细胞浸润第4?429? 达;缺血周围区再灌注2h可见bcl一2开始表达,再灌注12,24 h,表达达高峰,再灌注2d表达逐渐下降,至16d,bcl一2仍有表 达,略高于假手术组.各相邻时间点间的比较差异显着;缺血 中心区细胞阳性率明显低于缺血周围区,其变化规律与缺血周 围区相似,除再灌注2,8,16d外其余各组相邻时间点无显着差 异(表2). 2.3caspase一3mRNA表达结果假手术组仅见caspase一3mR— NA微量表达:缺血再灌注组caspase一3mRNA阳性神经细胞主 要位于缺血周围区,缺血再灌注2h表达逐渐增加,至24h达 高峰,再灌注2d逐渐减少,至16d仍有表达,略高于假手术 组,各组相邻时间点间比较差异显着.缺血中心区的阳性细胞 明显低于缺血周围区,其变化规律与缺血周围区相似,除再灌 注2,8,16d外其余各组相邻时间点无显着差异(表2). 2.4脑缺血再灌注后炎性区域白细胞浸润与细胞形态学变化 假手术组大鼠脑组织未见炎性细胞浸润与神经细胞凋亡;缺 血再灌注组,缺血周围区凋亡,损伤,坏死的神经细胞与炎性细 胞浸润高于缺血中心区,再灌注6,12h,在皮质区及纹状体区 可见少量凋亡的神经细胞;再灌注24h后,出现较多凋亡,损伤 的神经细胞,可见核深染的神经细胞出现;再灌注2d后,缺血 坏死区的界限明显,缺血性损伤较严重,神经细胞核出现严重 的坏死与核碎裂,炎性细胞浸润达高峰;再灌注4,16d,炎性 细胞浸润逐渐减低,坏死组织区逐渐扩大,以后形成斑痕组织 (见表3). 表2脑缺血再灌注各组bd-2和caspase-3mRNA表达的OD值比较(Jl--6,--.s) 各相邻组时间点比较:1)P<0.05;与同一时间点周围区比较:2)P<0.05 表3缺血再灌注后不同时间点白细胞浸润及 神经细胞损伤的变化 3讨论 3.1脑缺血再灌注损伤后,引起大脑皮质及纹状体区脑组织 的病理学变化,介导神经元细胞凋亡,进一步导致了细胞损伤, 坏死,引起炎性细胞浸润.由于缺血性再灌注性细胞损伤,使 白细胞浸润在炎性区域中发挥重要作用,可能会引起机体内原 性保护机制的触发,对缺血再灌注后细胞损伤的保护和修复起 一 定作用,并能有效地抵御细胞凋亡,损伤,坏死的进程.bcl-2 蛋白及caspase一3mRNA对抑制细胞凋亡和促进细胞损伤起重 要作用.本实验结果显示,缺血再灌注后凋亡细胞主要位于缺 血周围区,损伤,坏死细胞主要位于缺血中心区,随着缺血再灌 注时问的不断延长,缺血周围区细胞损伤,坏死逐渐加重,是一 个动态渐进的演变过程.缺血再灌注后细胞凋亡,损伤,坏死 由6h开始逐渐增加,至24h达到高峰,2d后逐渐减少.这与 Marlangue等报道'温和的脑缺血以细胞凋亡为主,严重的脑 - 43O- 缺血以坏死为主"的结论相一致.因此,在脑缺血的早期进行 抗凋亡治疗将会成为脑缺血治疗的主要.本文认为缺血 性脑神经细胞损伤与DNA损伤和蛋白质合成程序的启动以及 相关基因的表达有关.有关研究显示,脑缺血后引起的缺血 性脑损伤是一种损伤级联反应,这种级联反应涉及4个阶段: 兴奋性毒性,梗死周围的细胞去极化,炎症,程序性细胞死亡. 其中兴奋性毒性在损伤级联反应中起重要作用.本研究神经 细胞对缺血比较敏感,缺血周围区早期以细胞凋亡为主,如能 及时给予有效的治疗,凋亡细胞可能恢复正常,使损伤,坏死神 经细胞得以挽救和修复;反之,随时间的逐渐延长,凋亡神经细 胞未能得到有效的治疗而趋于死亡.据报道,在缺血再灌注 后产生的大量自由基,引起脂质过氧化瀑布效应,使蛋白质变 性失活,DNA多核苷酸主链断裂;兴奋性氨基酸与自由基可激 活磷脂酶A2,导致细胞膜降解,转运功能,屏障功能受影响,导 致细胞死亡. 3.2bcl一2蛋白,caSpaSe一3mRNA水平表达及炎性细胞浸润与 神经细胞凋亡的关系缺血再灌注后,炎症性脑组织损伤介导 神经细胞凋亡,引起细胞损伤,坏死,导致白细胞浸润.本实验 结果表明:假手术组bcl-2,caspase-3mRNA水平表达均呈微弱 表达;炎性细胞浸润分为I,V级,6,12h浸润为I级,在大 脑皮质及纹状体区可见少量凋亡的神经细胞,bcl一2,caspase一3 mRNA由轻度向增高表达;24h浸润为?级,在炎症区可见核 深染凋亡,损伤的神经细胞,bc1-2,caspase-3mRNA达高峰;2d 浸润为?级,缺血坏死区的界限明显,缺血性损伤较严重,神经 细胞核出现严重的核坏死与核碎裂,白细胞浸润达到高峰, bcl-2,caspase-3mRNA表达逐渐降低;4,8d浸润为?极,坏死 组织区逐渐扩大,白细胞浸润的抗炎能力逐渐减弱:bcl一2, caspase-3mRNA表达明显降低;16d浸润为V级,坏死组织形成 斑痕组织,bcl一2,caspase一3mRNA仍有表达,均高于假手术组. 3.3bcl一2蛋白表达与神经细胞凋亡的关系bcl一2表达在细 胞凋亡调控过程中起重要作用.据相关报道…,脑缺血时存在 着缺血性与再灌注脑损伤.本文结果表明:在缺血1h与再灌 注2h后出现脑组织损伤.假手术组bcl-2蛋白微弱表达,在缺 血周围区,缺血1h与再灌注后2h可见bcl一2表达逐渐增高,再 灌注12,24h达高峰.再灌注2d表达逐渐下降,至16d仍有 表达,略高于假手术组,各组相邻时问点比较差异显着,缺血周 围区高于缺血中心区,除再灌注2h,8d,16d外其余各组相邻 时间点无显着差异.Chen等在大鼠局灶性脑缺血1,2h,再 灌注24h发现皮层有bc1-2表达,并在缺血2h神经细胞生存中 起主要作用,即在存活的神经细胞中bc1-2蛋白表达增高,与本 实验结果一致.Lawrence等发现过度表达bcl一2基因的转基 因小鼠中,bc1-2蛋白能降低大脑中动脉阻塞的缺血性脑损伤, 缩小梗死体积,证明bcl一2表达能够抑制神经元细胞损伤. 本研究表明,脑缺血再灌注后bcl一2蛋白表达早期增高明 显于后期,并随缺血再灌注时间延长表达逐渐呈下降趋势.提 示脑缺血再灌注随时问延迟,而bcl一2表达减弱.缺血早期既 有细胞凋亡,又有bcl一2高表达,其在维持缺血神经细胞存活方 面起主要作用.本文认为脑缺血再灌注后bc1-2蛋白可抑制细 胞凋亡,使濒临凋亡的细胞得以挽救和修复,使其免于死亡. 中国老年学杂志2005年2月第25卷 3.4caspase一3mRNA表达与细胞凋亡的关系据报道, caspase一3家族在细胞凋亡中具有中心效应,处于核心位置,凋 亡的最后实施通过caspase-3激活而实现,是凋亡促动剂.本研 究结果显示,假手术组微量表达,缺血再灌注2h表达逐渐增 加,至24h达高峰:再灌注2d表达逐渐减少,至16d仍有表 达,略高于假手术组.各组相邻时间点比较差异显着,缺血周 围区高于缺血中心区,除再灌注2h,8d,16d外其余各组相邻 时间点无显着差异.在短暂脑缺血后大脑皮质及纹状体区 caspase-3mRNA蛋白表达增高,进一步证实caspase一3基因在缺 血性神经元细胞损伤过程中起重要作用.N和Namura【1o3研 究发现,脑缺血后神经元细胞caspase-3mRNA蛋白表达增加, 酶的活性增强,均定位于TUNEL阳性的神经元内,与本文献报 道一致.据有关报道l,脑细胞缺血坏死与caSpaSe-3基因活 化有关.本实验结果证实,脑缺血再灌注损伤后,引起迟发性 神经细胞损伤,坏死有细胞凋亡因素存在,可通过抑制caspase一3 mRNA表达这一途径来抑制缺血性神经细胞凋亡,避免进一步 发生迟发性神经细胞的损伤和死亡.本研究认为bcl一2蛋白可 防止或减少脑缺血性损伤的发生,caspase-3mRNA过量表达可 促进脑缺血性损伤的发展,二者与细胞凋亡所引起的神经细胞 损伤,坏死具有潜在密切关系. 4参考文献 1BuemiM,AllegrA,AloisiC,eta1.Coldpressortestraisesserumconcert— trationsofICAM一1vCAM一1,andE—seletininnormotensiveandhyperten— sivepatients[J].Hypertension,1997;30:845. 2LongaEL.Reversiblemiddlecerebralarteryocclusionwithoutcraniectomy inrats[J].Stroke,1998;20:84. 3MarlangueCC,MargaillI,RepresaA,eta1.Apoptosisandnecrosisafter reversiblefocalischemia:allinsituDNAfragmentationanalysis[J].J CerebBloodFlowMetab.1996;27(2):1861-91. 4BlockF.PetersM.Nolden—KochM.ExpressionoflL-6intheischemic pneumbra[J].NeurosciLett,1999:262:117. 5WechenbergerM,MendozaLH,YoukerKA.Cardiacmyocytesproducein— terleukin-6incultureandinviableborderzoneofrepeffusedinfarctions [J].Circulation,1999;99:427. 6ChenJ,SsterenH,GrahamT.eta1.Apoptosisrepressorgenesbcl-2and bcl—X—longareexpressedintheratbrainfollowingglobalischemia[J].J CerebBloodFlowMe1.ab,1997;17(1):2-9. 7LawrenceMS,HoDY,SunGH,eta.Overexpressionbcl-2withherpes simplexvirusvectorsprotectsCNSneuronsagainstneurologicalinsultsin vitroandvivo[J].Neuroscience,1996;6:394_8. 8SrinivasulaSM,Fernandes—AlnemriT,ZanlliJ,et口.Theced-3/inter- leukin1betaconvertingenzyme—likehomologMch6andthelamincleaving enzymeMch2alphaaresubstratesfortheapoptoticmediatorcpp32[J].J BiolChem,1996;271(43):27099—106. 9NiB.WuX,SuY,eta1.Transientglobalforebrainischemiainducesa prolongedexpressionofthecaspase-3mRNAinrathippocampalCA1PY— ramidalneurons(J].JCerebBloodFlowMetab,1998;18(3):248-56. 10NamuraS,ZhuJ,FinkK.eta.Activationandcleavageofcaspase-3in apoptosisinducedbyexperimentalcerebralischemia[J].Neuroscience, 1998;18(10):3659-68. 11ZhuC,WangX,HagbergNL,eta1.Correlationbetweencaspase-3acti— vationandthreedifferentmarkersofDNAdamageinneonatalcerebral hypoxia—ischemia[J].Neurochemistry,2000;75:819-29. [2004~8-30收稿2005~1修回] (编辑张慧)