细脚拟青霉代谢产物清除自由基和抑制单胺氧化酶活性的研究

细脚拟青霉代谢产物清除自由基和抑制单胺氧化酶活性的研究 细脚拟青霉代谢产物清除自由基和抑制单 胺氧化酶活性的研究 菌物25(1):63-69,2006 Mycosystema 细脚拟青霉代谢产物清除自由基和 抑制单胺氧化酶活性的研究 杨成胡丰林倪健桂琳万水霞李婉珍樊美珍 (安徽省微生物防治重点实验室.安徽农业大学.合肥230036) 摘要:用二苯代苦味肼基自由基(DPPH).TLC法和酶标仪法对一株细脚拟青霉RCEF0394发酵液甲醇 提取物的清除自由基活性进行了定性和定量测定,发现该提取物具有较强的清除自由基活性,在浓度为 5.0mg/mL,于37"C下保温10min时,它对0.4mg/mL的DPPH自由基的清除率可达75.4%.以大鼠肝脏 线粒体单胺氧化酶为靶标的体外实验发现供试细脚拟青霉发酵液有较强的抑制单胺氧化酶活性,且其活性 和浓度呈量效关系.该发酵液冻干品对单胺氧化酶的半数抑制浓度IC50为118.1g/mL.其三氯甲烷提取 物对单胺氧化酶的抑制活性明显强于发酵液冻干品,明该抑制剂可能为极性较低的化合物.进一步的分 型试验表明该三氯甲烷提取物对A型单胺氧化酶呈混合抑制,对B型呈竞争性抑制,其Kin值分别为 0.44mg/L,0.34mg/L. 关键词:虫生真菌,发酵液,次生代谢产物 中图分类号:Q939.93文献标识码:A文章编号:1672-6472(2006)01.0063.0069 Studyonscavengingandmonoamineoxidaseinhibitoryactivitiesof themetaboliteofPaecilomycestenuipes YANGChengHUFeng-LinNIJianGUILinWANShui.XiaLIWan.Zhen Mei.Zhen* (AnhuiProvincialKeyLaboratoryofMicrobialPestControl,AnhuiAgriculturalUniversity230036J Abstmct:ADPPH?TLCandDPPH— mcroplateassayweremadetodeterminethefreeradicalscavengingac~vity ofmethanolextractfromfermentationbrothofPaecilomycestenuipeRCEF0394.Theresultsrevealedthatthe extracthasstrongfreeradicalscavengingactivity.Attheconcentrationof5.0mg,mLitcandecrease75.4 percent0.4rag/mEDPPHradicalsafterincubatedat37? for10minutes.Aratlivermonoamineoxidaseassay showedthatthedriedfermentationbrothofPaecilomycestenuipeshasalsostrongMAOinhibitoryactivity. Ithas adose— dependentmannerwithICsoof118.1~g/mL.Thechloroformextractofthedriedfermentationbroth exhibitedstrongerMAOinhibitoryactivity.ThisindicatedthatthepolarityoftheinhibitormightbenotSOhigh. FurthertestsrevealthattheinhibitorytypeofthechloroformextractsonMAO.AwasmixedandOilMAO.B competitive,andtheKinvalueswere0.44mg/Land0.34mg/Lrespectively. Keywords:Entomogenousfungi,fermentationbroth,secondarymembolite 基金项目:国家自然科学基金项目(30570189)安徽省自然科学基金项目(00042425) 资助 ?通讯作者:mzfan@ahau.edu.cn 收原稿日期:2005—09.19,收修改稿日期:2005.11.02 菌物25卷 细脚拟青霉Paecilomycestenuipes(Peck)Samson是一种世界性分布的虫生真菌,在国 内常见寄生于南方森林中鳞翅目昆虫的蛹和幼虫,被认为是虫草的无性阶段(蒲蛰龙和李 增智,1996;梁宗琦,2001).由于虫生菌与昆虫的长期协同进化关系,近年来虫生菌被认 为是最有可能从中发现新型生物活性物质的类群,有关研究受到世界各国的广泛关注(Hu eta1.,2002).目前对细脚拟青霉的研究主要有如下几方面:一,单纯的生物活性研究,如 苏银法等(1996)曾对该菌株的孢梗束水提物进行了对小鼠中枢神经和免疫器官的影响试 验,发现细脚拟青霉具有明显的镇静和镇痛作用;金丽琴等(1997,2002)曾对细脚拟青霉 菌丝体水煎品对大鼠脂质过氧化物和还原型谷光甘肽水平影响进行试验,结果表明能减少 脂质过氧化物的生成,维持还原型谷光甘肽的含量;同时发现细脚拟青霉总多糖对大鼠有 非特异性免疫调节作用.此外,还有其水提物治疗糖尿病的报道以及抗菌,抗疟,杀虫和 细胞毒的报道(Nameta1.,2001;Kikuchieta1.,2004).二,单纯的成分研究,如陈祝安和 徐珊(1989)和陈召南(1992)曾分别对细脚拟青霉的固体培养物与天然冬虫夏草的氨基 酸,甾醇类,糖醇和生物碱等成分进行过比较;Kikuchi等(2004)报道了一种单端 孢烷和烯类骨架的新化合物TenuipesineA和SpirotenuipesineA和B.三,活性成分的鉴 定.泰国学者Nilanonta等(2002)曾通过特殊培养方式从中发现了具抗菌,杀虫活性 的 BeauveficinA和B,AllobeauvencinA,B和C;另外,Nam等(2001)还报道了两种细 胞毒成分:Acetoxyscripenediol和一种麦角甾醇过氧化物. 虽然对细脚拟青霉的相关研究已有较多的报道,但还未见其清除二苯代苦味肼基自由 基(1,l—diphenyl一2一picryhydrazyl,DPPH)及抑制单胺氧化酶活性研究的详细报道.大量的 现代医学研究表明,人体内很多疾病都与机体内的自由基有着密切的关系,对自由基方面 的研究已经成为医药学界研究热点(Hueta1.,2002陈祝安和徐珊,1989).另外,单胺 氧化酶(monoamineoxidase,MAO)在机体内是参与胺类物质代谢的主要酶类之一,具有 十分重要的生理功能,当其活性过强时不仅能直接造成胺类神经递质不足,同时过多的氧 化脱胺而产生自由基会进一步损伤神经组织,导致相关病征的出现,如目前发病率逐年升 高的抑郁症和帕金森综合症等就与单胺氧化酶活性过强有关,因此,对单胺氧化酶抑制剂 和自由基清除剂的研究已成为寻找有关治疗药物的热点(吴伟利和徐艳华,2002;顾牛范 和李华芳,2002).本实验室在一次大规模的生物活性物质筛选中发现一株细脚拟青霉 RCEF0275的发酵物具有一定的抑制单胺氧化酶活性(Schmidteta1.,2003).进一步对多 株细脚拟青霉进行活性研究发现一株细脚拟青霉RCEF0394的发酵物同时具有较强的抑制 单胺氧化酶活性和清除自由基活性.为了进一步确定该株细脚拟青霉发酵液提取物的清除 自由基和抑制单胺氧化酶活性,本研究将分别对摇瓶发酵液或提取物进行清除 DPPH自由 基和抑制A型和B型单胺氧化酶的详细研究,为进一步的结构研究和相关药物的开发提供 理论依据. 1材料与方法 1.1菌株及其来源 细脚拟青霉RCEF0394由安徽农业大学,安徽微生物防治重点实验室提供. 1.2培养基 固体斜面培养基:蛋白胨10g,L,葡萄糖40g,L,酵母粉10g/L,琼脂20g/L,蒸馏 水1000mL. 1期杨成等:细脚拟青霉代谢产物清除自由基和抑制单胺氧化酶活性的研究65 液体摇瓶培养基:蛋白胨10g/L,葡萄糖40g/L,酵母粉浸出粉10g/L,蒸馏水1000mL. 1.3试剂和仪器 试剂:二苯代苦味肼基自由基(DPPH),kynuraminedihydrobrornide均为Sigma公司 产品;吗氯贝胺,购于济南路遥化工有限公司;盐酸司来吉兰,购于珠海市拱北医药有限 公司;二甲基亚砜(DMSo),95乙醇,甲醇,三氯甲烷均为国产分析纯. 主要仪器:TUMENTL—l5高速离心机,图门离心机厂;FREEZONE12冻干机,美国 LABCONCO公司;梅特勒AE200型电子天平,上海分析仪器厂;SENCOR-502B型旋转 蒸发器,上海申胜生物技术公司;SpectraM2酶标仪,美国MolecularDevices公司;高效硅 胶板GF254,青岛海洋化工厂分厂;HZQ—F160全温振荡培养箱,哈尔滨市东联电子技术开 发有限公司;KH5200DB型数控超声波清器,昆山禾创超声仪器有限公司. 2材料和方法 2.1菌株的培养及样品的准备 用上述液体培养基(pH=5.6),以8的接种量接入一级液体种子,后置于160r/min, 25?摇床上培养7d后抽滤,将滤液低温减压浓缩至原体积的1/4,然后加入95%乙醇沉 淀,使其终浓度为75%,放置过夜后离心,弃沉淀,将上清液在4o?条件下浓缩冻干.准 确称取10mg冻干品,加入1mL的甲醇配成10mg/mL于超声波振荡器中在100Hz条件 下振荡浸提30min,然后1000r/rain离心5min取上清液,分别再稀释成相当于原冻干品 0.5mg/mL,1mg/mL,4mg/mL,6mg/mL的溶液,作为供试样品I. 另发现其冻干品的氯仿提取相在相同的测试浓度下活性较强.称取两份冻干样品20o mg,向其中加入1mL的三氯甲烷,于100Hz超声波中提取30rain.离心吸取上清液并吹 干称重,溶于DMSO溶液,分别稀释成0.25mg/mL,0.5mg/mL,lmg/mL,2mg/mL,4mg/mL: 同时称取一定量冻干样品直接用DMSO溶液溶解,并稀释成上述的浓度梯度作为供试样品 II. 2.2研究方法 2.2.1细脚拟青霉RCEF0394发酵液冻干品甲醇浸提物清除自由基活性定性:取浓度 为10mg/mL上述提取物的甲醇溶液进行DPPH自由基薄层试验,以1.0mg/mL的抗坏血 酸甲醇溶液为阳性对照.点样量为4L,展开剂为氯仿:甲醇:水=60:355.等流动相到达 距上沿lcm的地方,取出让展开剂自然挥去,然后喷浓度为1mg/mL的DPPH自由基95 %乙醇溶液进行显色反应,并用铅笔轻轻的划下活性斑点. 2.2.2细脚拟青霉RCEF0394发酵液冻干品甲醇浸提物清除自由基活性的定量测 定:参考 胡丰林等(胡丰林和陆瑞利,2004)的DPPH自由基酶标仪法.加各浓度样品I100~tL和 事先用95%乙醇配好的0.4mg/mL的DPPH自由基试剂100~tL于96孔酶标板中,每个浓 度样品设三个重复.样品加入后将96孔酶标板置于酶标仪中振动30s,在37?和517hill 波长下测定其吸光值(Ap);37?保温10min后再测定一次.同时测定不加DPPH自由基 试剂的样品空白吸光值(Ac)和加DPPH自由基试剂但不加样品(100~tL80%甲醇代替样 品)的吸光值(Amax).最后按下述计算: 相对清除率(%)=[卜(Ap—Ac)/Amax]×100 2.2.3样品的DMSO溶液对单胺氧化酶抑制的活性测定 2.2.3.1单胺氧化酶精酶的制备:参考Holt等(Holteta1.,1997)方法,制备摹胺氯化酶精 菌物25卷 酶. 2.2.3.2单胺氧化酶抑制剂活性的测定:参考Weissbach等(1960)和Schmidt等(2003) 方法改进,用上述制备精酶液751aL先和51aL各浓度供试样品?于96孔酶标板于37.C条 件下保温10min,结束后向其中加入浓度为1.5×10-mol/mL的底物20|lL混匀30s,使 DMSO溶剂的最终含量为5.在360nm波长下,测定开始时底物和酶样品混合液的吸光 值(A1),37.C保温15min再测其吸光值(A2);空白对照的吸光值(/Xho)是以5|lL的DMSO 溶剂代替待测样品.最后按下述公式计算: 相对抑制率(%)=1一[(Al—A2)/?]×100% 3结果与分析 3.1细脚拟青霉RCEF0394发酵液提取物清除自由基活性的定性测定 按上述方法进行点样和展开,喷DPPH自由基试剂,5min后的薄层扫描图谱见图1. 图1提取物DPPH试验谱图 1.细脚拟青霉培养液的甲醇提取物: 2.抗坏血酸 Fig.1DPPH-TLCassayofextract 1.Methanolextraetoftenuipes; 2.Aseorbinacid 从图中可见样品点和阳性对照均有黄色斑点 呈现(黑白图片中为白色),说明供试样品中具有 清除自由基的活性的成分.从反应情况看,黄色斑 点中第一个可能为主要的活性成分,且该活性成分 的极性较低,因为DPPH自由基为一稳定的有机自 由基,它能够强烈地吸收517nm的光而呈紫色, 当它与自由基清除剂反应时,其孤电子被配对,此 时其吸收光发生蓝移而呈现黄色. 3.2细脚拟青霉RCEF0394发酵液提取物清除自 由基活性的定量测定 为了进一步确定样品的活性大小,分别按上述 配制的样品浓度进行定量测试.根据DPPH自由基 的特性,选择波长517nnl作为测试波长,根据吸 光值变化大小来确定样品的抗氧化能力大小.实验 结果如表1. 表1不同浓度提取物对DPPH的相对清除率 Table1DPPH'scavengingactivitiesofextractsatdifferentconcentrations 样品反应浓度(mg,mI.)自由基相对清除率(%)Scavengingratcs Reactionconcentrationoftheextracts 0(rain)10(min) 从表1可得出,不同样品浓度对DPPH自由基清除能力不同;随着样品浓度的递增其 自由基清除活性增强.当样品的浓度一定时,随保温时间延长其智幽夔||f魍皂增强." 1期杨成等:细脚拟青霉代谢产物清除自由基和抑制单睦氧酶适壅鱼1 3.3细脚拟青霉RCEF0394发酵液冻干品的DMSO溶液对MAO活性的抑制效果 按照上述讲述的过程进行加入供试样品?,并进行抑制单胺氧化酶活性测试,每个浓 度样品设三个重复.结果见表2. 表2不同浓度发酵液及提取物对单胺氧化酶的相对抑制率 Table2MAOinhibitionratesoftimfermentationbrothandextractofdifferentconcentrations 从表中可看到,细脚拟青霉RCEF0394发酵液对大鼠肝脏线粒体单胺氧化酶的相对抑 其抑制率增大.在供试的样品浓度范围内,制率呈量效关系,随着样品浓度的增加, 供试 样品浓度与其对酶的相对抑制率极显着相关,相关系数都在0.95以上.经计算,该发酵液 冻干品的DMSO溶液对单胺氧化酶的半数抑制浓度ICso为118.1lag/mL.其氯仿提取物的 半数抑制浓度IC50为56.71ag/mL. 3.4细脚拟青霉三氯甲烷提取物对单胺氧化酶A型和B型的抑制动力学特性 根据一般酶动力学研究方法,用上述的反应体系,对系列最终测试样品浓度50~g/mL, 1001~g/mL,200.g/mL和空白对照进行测试.对A型活性测定时,用500nmol~的盐酸司 来吉兰DMSO溶液先与原酶液于37oC混合10mill;测定B型活性时,用500nmol/L吗氯 贝胺DMSO溶液与原酶液于37oC混合10lain.酶液经加标准品抑制处理后用同上的方法 测试.由I/[S]对l,,,作图求得反应的Km值,结果如图2和图3.从图可见.细脚拟青霉 RCEFo934发酵液氯仿提取物对MAO-A呈混合抑制,对MAO-B呈竞争性抑制,其Km值 分别为0.44mg/L,0.34mg/L 4结论与讨论 从上述分析可知细脚拟青霉RCEF0394菌株的发酵液甲醇提取物具有较强的清除自由 基活性,在浓度为5.0me/mE,于37?下保温10rain后,它对0.4me/mE的DPPH自由基 的清除率可达75.4%.单胺氧化酶试验结果显示菌株RCEF0394的发酵液(经简单的醇沉 处理后的冻干品)具有较强的抑制单胺氧化酶活性,它对单胺氧化酶的半数抑制浓度IC5o 为ll8.1ug/mL.该冻干品的三氯甲烷提取物显示有更强的抑制单胺氧化酶活性,其对单 胺氧化酶的半数抑制浓度ICso为56.7ug/mL,表明该抑制剂可能为极性较低的一类化合物. 进一步的分型试验表明该三氯甲烷提取物对A型单胺氧化酶呈混合抑制,对B型呈竞争性 抑制,其Km值分别为0.44ml;,L,0.34mg/L.从抑制类型上可知该抑制剂具有一定的特 异性和选择性,如果能将它们分离纯化成单体,将有可能得到高效的A型和B型单胺氧化 酶抑制剂,开发出分别对抑郁症和帕金森综合症有疗效的药物(吴伟利和徐艳华,2002; 顾牛范和李华芳,2002).由于目前被称为都市流行感冒的抑郁症的发病率逐年升 高,而随 口的老龄化的加剧帕金森综合症作为一种常见的老龄病其发病人数也越来着人 越多,因此 1期杨成等:细脚拟青霉代谢产物清除自由基和抑制单胺氧化酶活性的研究69 KikuchiH.MiyagawaY.SahashiY.lnatomiS,HaganumaA.NakahataN.OshimaY.2004.Novelspirocycfictrichothecanes, spirotenuipesineAandB.isolatedfromentomopathogenicfungus,Paecilomycestenuipes.JOrgChum,69(2):352—356 Schmidtl 【.LiZZ.SchubertB,HuangB.StoyanovaS,HamburgerM.2003.ScreeningofentomopathogenicDeuteromycetesfor activitiesoiltargetsinvolvedindegenerativediseasesofthecentralllervoussystem.JournalofEthnophatmacology,gg:251-260 LiangZQ,2001.Cu_rr~tsituationandponderationofCordycepsFr.researchandexploitationinQIinActaEdulisFungi,8(2):53-62 (inChinese) NamKS,JoYS.KimYI-I,HyunJW,KimHW,2001.Cytotoxicactivitiesofacetoxyscripenediolandergosterolperoxidefrom Paecilomycestenuipes.LifeScience.69(2):229-237 NilanontaC,IsakaM.KittnkoopTrakulnaleamsaiS,TanficharoenM,ThebtaranonthY,2002.Precursor-dixectedbiosynthesisof beauvericinanalogsbytheinsectpathogenicfungusPaecilomycestenuipesBCC1614.Tetrahedron.58:3355-3360 PuZL,LiZZ(eds.),1996.InsectMycology.Hefei:AnhuiPubfishingHouseofScienceandTechnology,1-93(inChinese) SuYF,XuS,WuZL,1996.EffectsofPaecilomycestenuipesonCNSandweightofimmuneorgan.JournalofChineseMaterial Medica3:50-51.(inChinese) WuWL,XuYI-I,2002.Advancesonanfiparkinsonism.ForeignMedicalSciences(Geriatrlc s),23(9):236-238(inChinese) [附中文参考文献] 陈召南,1992.细脚拟青霉与冬虫夏草化学成分的初步比较.中成药,l9(2):36—37 陈祝安,徐珊.1989.细脚拟青霉培养性状和药理作用的初步研究.真菌,8(3):214—220 顾牛范,李华芳,2002.抑郁症药物治疗新进展.中国临床药学杂志,11(4):252-255 胡丰林.陆瑞利.2004.蔷薇科一些植物鲜叶提取物清除DPPH自由基活性的研究.植物学通报,2l(1):74_78 金丽琴,吕建新.胡云良,楼永良,1997.细脚拟青霉对大鼠脂质过氧化物和还原型谷光甘肽水平的影响.中国病理生理杂志, 13(4):379~382 金丽琴,吕建新,袁谦.2002.细脚拟青霉总多糖对大鼠非特异性免疫调节作用.科技通报,18(4):276-280 食用菌,8(2):53-62 粱宗琦,2001.我国虫草属真菌研究开发的现状及思考, 蒲蛰龙,李增智(主编),1996.昆虫真菌学.合肥:安徽科学技术出版社.1—93 苏银法,徐珊,吴真列.1996.细脚拟青霉对CNS和免疫器官重量的影响.中医药研究,3:50-51 吴伟利,徐艳华,2002.帕金森病治疗进展.国外医学(老年医学分册),23(9):236-238 0.