【doc】嗜肺军团菌聚合酶链反应检测方法及其应用研究

【doc】嗜肺军团菌聚合酶链反应检测方法及其应用研究 嗜肺军团菌聚合酶链反应检测方法及其应 用研究 中华舌}c行寤学杂.1994年'月第l5卷第2端 1,f 嗜肺军团菌聚合酶链反应检测方法及其 应用研究 117 万赶群兰苤. ,'/ ^摘要根据嗜肺军尉菌基因组DNA的种特异性DKA片段序列.合成一对日【物进行聚合酶链反应 (PCRj.经琼脂糖凝胶电泳,EB染色结果表明-~8:cbp的核苷酸医带为嗜肺军团菌1,【4血清型菌株 所共有.'PCR检测水中军圈菌,其敏感性为.5.cfu/m1.而用同位素标记探针,斑点杂交法检涮,其敏 感性为43cfu/mI.PCR检测人工感染嗜胖军面菌柏豚鼠组织标本-阳性率为33?3啦-而细菌分离培养的 阳性率仅为26.B和.在现场调查中.用PCR法初步验证了一起由Lp1.引起的军团菌病爆发.上述结果 表明,PCR法能快逮.敏感,特异性检测暗肺军团苗感染- 关键调军团菌塞鱼壁星些军国乖干自,槿i虹1 军团菌引起呼吸遭疾病的主要症状是肺 炎.临床上.一般抗生素治疗无效的肺炎病人 之中,约95嘶为嗜啼军团菌所f起(Ij.由于 病原体分离困难.病人血清;;r抗军团菌抗体上 升较晚.常常造成误诊和误治,病死率高达 30嘶一50嘶(zJ.l封此,需要建立一个快速, 准确的实验室诊断方法.聚合酶链反应技术具 有高度特异性和敏感性,自1985年(3】问世以 米,已经在传染病诊断,遗传学,分子生物学 等领域获得广髭应用.本文将介绍嗜肺军团菌 检测方法及在实验动物感染神军团病爆发时的 初步应用结果. 和方法 一 ,菌株:本实验用的军团嫡全部来臼羹 国疾病控制呼?心(CDC),其它细菌来自中 国科学院微生物所菌种保存室. =,培养基:(1)军团萤培养基.按文 献(')配制:(2)昔通培养基. 三,引物合成:按文献(5)报道的序列. 由中国科学院微生物所合成: PrimerI.5一GTCATGAGGAAT CTCGCTG一3 Primer?.5一CTGGCTTCTTCC AGCTTCA一3 四,动物试验:取豚鼠(本所动物室饲 养)12只(每只重量200~250g),分为两组.实验 组豚鼠1o只.每只腹腔接种对数生长期嗜肺军 团菌血清1型参考菌株(phil~delphla,ATCC 33152)菌悬渡1ml,菌量为1?2x10.cfu/ ml(6】.正常对照组豚鼠2只,每只接种生理盐 冰1ml.以相同条件饲养两组豚鼠,豚鼠死亡 后各驶肝,肾,肺组织进行PCR检测在细菌分 离培养,对照组豚鼠经处死后进行同样处理. 五,细菌基因组DNA样品制备:刮取对 数生长期菌苔于0?5mlTE液中(Trls10 mmol/L,EDTA—Na.1mmol/L,pH8-0), 洗涤3次话,将沉淀物溶于等量的TE中,100? 水浴煮沸5分钟一20?冰冻0分钟,再在10O? 煮沸5分钟.再--20?冰冻.如此反复3—5次. 最后以500r/mi~离心5分钟.取上清液备用. 六,豚鼠组织中DNA制备【7);取豚鼠组织 1—0g,以无菌手续将组织研磨成匀浆,加入 -中国预防医学科学院流行赢学微生物学研究所l~2z06 北京市 2武警北京总队医院 一 份组织裂解液(NaC1100mmol/L,Tris- Hcl10retool/L.EDTA—Na,zsmmol!L, SDS0.5嘶,蛋白酶K0.1m~/ml,pH8?0) 37?裂解过夜.再用酚:氯仿抽疆两次,氯 仿抽提一次,用冷无水乙醇援淀DNA抽于, 用TE溶解DNA,4?保存备用. 七PCR扩增:在Pharmaeia公司的 热循环仪上进行.取一灭菌0—5mlEppendorf 管,加入36M无菌双蒸水.10×TaqDNA 聚合酶反应缓冲液51(KC1500mmol/L, Tris-HC1100mmol/L,MgC1.15mmol/L, 明胶0—1%,TritonX一1001%,pH9—0),4 xdNTP(2retool/L),PrimerI11(20 pmol/L),Primer?lI(20pmo[/L), DNA样品11,混匀,95?水浴变性1O分 钟,冷却,离心沉下冷却水,加入TaqDNA 聚合酶ll(2.5u),混匀,反应体系上面覆 以401液体石蜡72?保温2分钟,然后按下述 参数进行循环扩增:94?变谴1分钟,55?退 火1分钟,72?延长2分钟,反复循环35次. 最后72?保温5分钟,冰冻. ^.扩增产精检测: 1一琼脂糖凝胶电泳检测(B1.用TBE液 (EDTA—Na22retool/L,Tris—HCl89 retool/L,Boricacid89mmol/L)配制1% 的琼脂糖凝胶,加样,以B伏/cm稳压,电泳1 小时,凝胶用O-5~g/ml溴纪乙啶染色3O分钟, 在紫外灯(254nm)上观察结果并照相. 2.DNA斑点杂交检测:探针接文献(5)报 道的序列合成,探针的.P末端标记按标记盒 说明(标记物购自北京福瑞公司)进行.斑 点杂交按文献(9)进行. 丸,豚鼠组织中军团茵的分离培养:按艾 献(1o)进行酸化处理,然后划线接种于BcYE 琼脂平板上,烛缸培养3—7天,挑取单个菌辫 进行衄清学检查. 锫果 一 PCRtka'l嗜肺军团茵特异性试验.刮 中华巍行病学杂志l9?'年?月第l6春簟2搠 取BCYE平板上对数生长期的菌落,用TE洗涤 并制成菌悬液,提取基因组DNA,用上述引 物进行PcR扩增,结果直?表l?舀l所示. 袭1PCR检测嗜肺军团苗的特异性 扩增产物扩增产曲 茸株菌株 (8706p)tarobp) 雷肺军团菌苗种其它军团酋 血清銎』型+米克戴善军团茸一 2銎+杜奠夫军团菌一 3銎+博杰曼军团菌一 4型+是难军团蘑一 5型+非军团菌 6型+枸棒藏盐杆苗一 7型+蜂窝啥夫尼亚杆菌一 8型+肺兜克首伯氏杆苗一 9型+奇异变形杆菌一 i0型+肺j趄支原体一 1l型+表皮葡萄球曹一 12垄+脑膜真紊瑟氏菌一 13型+肺.I龟双球菌一 l?型+乙型溶血佳链球苗一 卡他球菌一 圈lpCR扩增嗜肺军团曹1~14j蒲銎茸株基因组 DNA结果 ODNA大小,噬苗体DNA,EcoRl+HtadI I,ll嗜肺军团曹l,l'血清型菌株DNA扩增产竹1 I5对厢 嗜肺军团菌Lp1一l4都能产生一条870bp 的DNA区带,而其它军团菹和非军团菌则无 任何DNA区带出现,说明该引物对嗜肺军团 菌具有高度特异性. :,PCR捡测嗜肺军团茵基因姐DNA的敏 中华谛行病学杂志l904年4月第l5卷!塑 感性试验:将嗜肺军团菌生长物制成不同稀释 度的菌悬液[即含不同的菌落形成单位(cf./ m1)],制备基因组DNA样品进行PCR扩 增,通过琼脂糖电泳检测扩增产物,结果表 明.其敏感性为350cfu/ml,用同位素标记 NDNA探针进行斑点杂交来检测扩增产物. 其敏感性为43cfu/ml. 三,PCR检洲豚鼠组织中嗜肺军团茵兹 果:用PCR检测lO只人工感染豚鼠组织标本 共3O份,2只正常对照豚鼠组织标本6份.同时 进行军团菌的分离培养,结果见表2.实验组 豚鼠组织中嘻罅军团菌PCR检出阳性率为 83.3叻,而细菌分离培养阳性率只有26.6铀, 经统计学处理两者具有显着性差异(P< 0.01),6份正常对照豚鼠组织标本两种方法 检测均为阴性. 襄2PCR检测豚鼠组织中嗜肺军团菌的阳性率 丑别仞最 阳性 PCR培养祛 实验组3025(8s.3嘶)8(26.6嘶) 对厢姐B00 四,PCR在一班Lp10引起的爆发中的初 步应用结果:在一次LplO军团菌引起的爆发 中(经血清学调查,Lpl0感染者占22?2%,并 从鱼池水中分离到1株细菌,除用常规方法进 行鉴定外,经PCR扩增检测亦表明为嗜肺军 团菌血清1O型,有可能这起爆发与鱼池水有关. 结果见图2. 讨论 实验结果表明.通过PCR扩增,有一条 870bp的DNA片段,为嗜肺军团卤血清l,14 型所共有.而其它种军团菌和一些非军团菌扩 增结果则为阴性.f物序列是决定PCR方法 特异性的主要因素.用琼脂糖凝胶电泳,溴化 乙啶染色检'冽扩增产物,敏感性为350cfu/ml, 与文献报道(1J)的操针检测的10?,10s个细菌 一n9?周2鱼池水分高物DNA扩增结暴 J.棱酸标准参厢曲(^phageDNA/F,coR[+Hi~tdl[) 2.嘻肺军团羞血清J0型参考株(Leiden-t)阳性对照 3.鱼池承分高格BJ9~1oo 4.未抽jI板DNA矾性对照 相比,敏感性有较大的提高,用同位素标记的探 针与扩增产物进行斑点杂交,敏感性为43cfu, ml.因此对于含病愿体很少的标本,用PCR 扩增目标DNA的数量,再用探针检测.两者 结台起来可以大大提高病原体的控出率. 用此法检查lO只』,工感染豚鼠的30份组织 标本,F}{性率为83?3%(26/30).发现每只 感染豚鼠至少有两个脏器标本为阳性.说明军 团病是涉及多个脏器的细菌性疾病,与国外报 道相符(1l,JzJ.细菌培养的阳性率只有26.6, 与PCR法比较低得多,有可能酸化处理过程 中,低pH值除杀死非军团菌外,亦可能杀死 某些军团菌或者使之成为活的非可培养状态, 尚有待研究. PCR技术具有早期快速,特异性及敏感 性高等优点,有希望用于军团病的早期诊断和 流行病学调查.本文刑一起Lp10爆发的 初步分析尚需进一步完善. StudiesoiltheDetectionofLegioneIIj pneumophilebytheApplicationof PolymeraseChainReaction(PCR)Y" huanxin,anChaoqun,D8n口Changying I~ituteoIEpidemiologyandMicro— biology,Chine~eAcademyo/Preventive Medicine.Beijing102206 Acccrdlnlgto幢eaeque~,ceofge4omic 120 DNA~agmentofLegionetlapneumophits thePCRTB0p;rformedwith.pairofat- tifieialsynthesizedprimertResaltsofaga.- roseeleetrophoresisandEBstalnlagshowed thattherewasa870hpbandskatedby serogroups1,J4ofL.e".f如.Thesen— sitivity0fPCRindetectingLegiJaella ffomaterTas350cfn/ml-however.the .pe.ill~DNAl~obelabeledTith?,pas 43cJalmlbyblothybridization?Thepoxitiye rateoftissue0pecimeasfrominfected guinea—pigswitkLegionellapneumop'=ila Tas83.3嘶byPeRdetertion,andonly 26?B嘶byhueteriologicalcultaremthod. AnoRtbreakeawsedbyLp10asverifi— edbyPCR.Theresultshowedthatthe PCRconlddeteettheinfetionofL gionel1arapidly?specifleallyand$ensiti— rely? 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