实验十二 噬菌体效价的测定

实验十二 噬菌体效价的测定 实验十二 噬菌体效价的测定 一、实验目的 1、学习并掌握噬菌体效价的测定原理。 2、学习并掌握双层琼脂平板法测定噬菌体效价。 二、实验原理 噬菌体属于细菌病毒，它不具备完整的细胞结构，只能通过寄主细胞完成自我复制。因此人类只有通过电子显微镜才可观察到它们的形态结构。但由于噬菌体侵染细菌细胞后，可导致寄主细胞裂解死亡，并在琼脂培养基面形成是菌斑，所以人们可以此来判断噬菌体的存在。 当烈性噬菌体侵染敏感细菌后,会迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，结果就会在菌苔上形成一个具有一定形状、大小、边缘和透明度的肉眼可见噬菌斑(plague)。 噬菌体的效价:,mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。其测定常用双层琼脂平板法。由此得到的噬菌斑形态、大小较一致且清晰度高，计算准确。根据不同稀释度平板上出现的噬菌斑数目，即可算出原液噬菌体的效价。 双层琼脂平板的配制:底层平板(1.5~2,琼脂的LB培养基10ml)，将适当稀释的噬菌体与培养至对数期的受体菌混合，保温吸附，加入45?左右的半固体琼脂糖，迅速混匀铺平板作为上层。 计算公式:噬菌体效价(pfu/ml)=噬菌斑数×稀释倍数×10;(这里的10为换算单位，即实验中用到100μl噬菌体原液，换算成1000μl，即1ml时，要乘以10) 三、操作步骤 图 流程 步骤 目的 1、制备9套LB将融化并冷却至45?左右的LB培养基倒入1、提供细菌生长营养物质 固体培养基底无菌培养皿，每皿约10~12ml.水平放置，凝2、提供更加平整的平面 层平板 固后做好稀释度标记。 2、制备噬菌体取0.5mL噬菌体原液于4.5mL无菌水中得到通过连续稀释使单个噬菌 -1-1稀释液 10稀释液。再取0.5ml10稀释液于4.5ml体吸附一个大肠杆菌细 -2-3缓冲液中得到10稀释液。同理再制备10胞。 稀释液，并在试管上标记备用。(稀释过程应 充分混匀) 3、制备受体菌将感受态大肠杆菌接种于50ml LB培养液，经由实验员制备。 细胞 过夜培养，离心收集菌体细胞，悬浮于20ml 10mM MgSO4中备用。 -1-2-34、吸附 用取样器分别取100μl 10、10、10噬菌—— 体稀释液和100μl受体菌细胞液，充分混合 后置于37?恒温箱保温25min.并在离心管上 做好标记。 5、制备上层平用枪分别取350μL受体菌菌悬液和噬菌体稀防止琼脂糖凝固结块儿。 板 释液，加入到冷却至45?左右的0.7%琼脂糖 中，迅速混匀，倒在有相应标记的底层平板， 边倒边摇匀。 6、培养 37?倒置培养15~18h，检查结果。 —— 四、结果讨论 -2-3噬菌体稀释度 10 10 1 2 3 1 2 3 噬菌斑数(个)/皿 176 149 177 16 20 17 平均数 67 18 -2-2噬菌体效价(10)=67×10×10=6.7 -3-3噬菌体效价(10)=18×10×10=0.18 五、思考题 2、测定噬菌体效价的准确性应注意哪些操作, 答:噬菌体效价的准确性应注意以下几点: 1)实验操作为无菌操作，以免杂菌污染; 2)倒平板的时候要迅速，因为平板易凝，如果倒得太慢会使琼脂糖凝固不均匀; 3)倒培养基时要稍冷却，以免水汽影响噬菌斑的计数。