一个掌跖角化周病变综合征患者家系组织蛋白酶C基因突变分析

一个掌跖角化周病变综合征患者家系组织蛋白酶C基因突变分析 南方医科大学 博士学位一个掌跖角化牙周病变综合征患者家系组织蛋白酶C基因突变分 析 姓名:李晓峰 申请学位级别:博士 专业:口腔内科学 指导教师:章锦才 20070420 博士学位论文 一个掌跖角化牙周病变综合征患者 家系组织蛋白酶,基因突变分析 博士研究生:李晓峰 指导教师:章锦才教授 摘要 一、研究背景 掌跖角化牙周病变综合征(,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,)，是一种罕见的常染色体隐性遗传疾病(,，, ,,,,,,)，又称帕一勒氏综合征(,,,,,,,,—,,,,,,, ,,,,,,,,，,,,)(发病率约为,—,,百万，临床特征是在发病早期出现乳牙和恒牙的牙周组织破坏，手掌脚掌的皮肤过度角化，伴有牙周组织过早破坏的严重早发性牙周炎常导致患者乳牙和恒牙过早脱落，牙槽骨破坏致使患者通常在,,岁时开始出现牙齿脱落，并在出生后一年内就已经表现出对细菌的易感性增加。常规的口腔治疗包括口腔卫生宣教、刮治和根面平整、阿莫西林一甲硝唑全身抗生素疗法等对,,,患者的侵袭性牙周炎疗效欠佳。 牙周病由牙龈炎和牙周炎两种形式组成，临床上牙龈炎是牙齿周围软组织的可逆性炎症，牙周炎与身体其他系统的多种疾病相关，这些疾病可引起不可逆的牙周组织破坏(结合上皮、牙周韧带、牙槽骨)，成人牙周病发生率为,,,,,,，儿童牙周病的发病率为,(,,,,，大多数牙周病的病因是复杂的多因素的，与环境和遗传因素密切相关。虽然特异性细菌(革兰氏阴性菌)与环境因素(例如吸烟)在牙周病的起病初期和发展过程中起重要作用，但是否会引起疾病发作则取决于宿主抵抗致病因素的先天反应。目前为止，微生物和环境因素的特异性靶分子还不清楚，但牙周炎有明显的遗传基础这点是逐渐明确的，目前已知 中文摘要大多数成人型牙周炎和早发性牙周炎(,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,,,，,,,)均有遗传倾向，与成人型牙周炎和早发性牙周炎相比,,,患者的遗传基因突变是主要致病因素。 ,,,主要由组织蛋白酶,(,,,,)的基因突变引起，,,,,基因编码的组织蛋白酶,(;,,,,,,,, ,)也被称作二肽肽酶，(,,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ，，,,,，)是一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶，是肽酶,,家族的成员，它具有肽链内切酶的活性，是溶酶体内一种重要的内切蛋白酶，它的作用是从蛋白质底物的氨基酸末端除去二肽，对免疫细胞和炎性细胞内的许多蛋白质降解和丝氨酸蛋白酶的活化有重要作用，例如:免疫系统的多核白细胞、单核巨噬细胞、肥大细胞和他们的前体细胞。,,,，对免疫细胞和炎性细胞内的许多丝氨酸蛋白酶的活化起主要的调节作用，在多种组织内有较高水平的表达，例如肺、肾脏和其他的上皮组织。目前认为,,,，的免疫作用主要是蛋白质的降解和酶原的活化二者协同作用的结果(,,,的病因学在过去的几年的研究中已经有了很多进展，包括免疫变态反应和对细菌感染的易感性，然而对皮肤病损和牙龈病变二者之间的关系仍然不清楚。最初,,,位点被定位在第,,染色体的, ,？,, ,,,,基因突变导致其编码的蛋白质异常，引起伴有牙周炎的掌跖角化症，又称掌跖角化牙周病变综合征(,,,)，,,,,基因突变的杂合子携带者既没有手掌脚掌过度角化表现也无侵袭性牙周炎，因此，一个野生型的;,,;基因的存在可以完全防止该疾病的发生，另外，在,,,,,,,,, ,,,,,,,,和青春期前牙周炎患者也可检测到;,,;基因的突变。 ,,,,,,等在,,,,年的研究中通过功能测定发现,,,患者,,,,的活 性几乎全部丧失，而在,,,,基因突变携带者中其活性显著降低，,,,,基因位点在染色体,,？,,基因图谱的,(,;,间隔内，这个间隔内的物理和基因图谱相关性显示:此区域内包含有几个表达序列标记(,,,,,,,,, ,,？,,,;, ,,,,，,,,,)和,个包括溶酶体蛋白酶组织蛋白酶,(,,,,)在内的已知基因。据,,,,年,,月,,日最新数据显示,,,,基因位于常染色体, ,？,,(卜？,,(,( ? 博士学位论文 虽然目前的研究显示,,,,基因突变导致其编码的蛋白质异常是引起,,,的主要原因，但,,,的病因学还有很多尚不清楚。据目前的研究显示,,,,基因突变杂合子携带者并不出现手掌脚掌皮肤过度角化和侵袭性牙周炎的临床表现，提示一个野生型的,,,,基因的存在可以防止,,,的发生。 ,,,,全长约,,,,，包含有,个外显子和,个内含子。其,(,,,长的,,,,编码了一个,,,个氨基酸的多肽，此多肽可能由,,个氨基酸单肽、,,,个氨基酸前肽和,,,个氨基酸成熟酶组成。到目前为止，在不同种族,,,患者中发现的,,,,基因突变形式多达,,余种，在汉族家系有关,,,,基因突变的报道不多。 二、研究目的: 通过对,,,患者及其家人的,,,,基因序列的分析，探讨掌跖角化牙周病变综合征(,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,)，又称帕一勒氏综合征，(,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,，,,,)患者组织蛋白酶,基因(,,,,)突变特点，进一步证实组织蛋白酶,基因的突变是,,,，,盎床显性的病因，为,,,的基因诊断提供了理论依据，;,,;薪的突变类型扩大了;,,;基因的突变谱，对进一步研究,,,,基因在,,,发生中所起的作用提供了理论依据( 三、研究方法: ,、临床病例和诊断 广东省口腔医院牙周病科治疗的一例临床诊断为,,,的,,岁男性，患者的父母出生于广东省，患者父母无血缘关系。患者在,岁时就出现侵袭性牙周炎和双足底、手掌皮肤角化过度的临床症状，同时伴有肘部膝部皮肤的过度角化。侵袭性牙周炎引起的乳牙脱落使患者在,岁时大部分乳牙都已经缺失，乳牙脱落后牙周炎症消退牙龈恢复正常。同时在儿童时期有反复发作的扁桃腺炎和发烧等临床表现，患者的父母和其妹妹临床检查是正常的。 ,、基因组,,,提取 在知情同意基础上，分别抽取,,,患者及其父母的外周静脉血，对照组,,,来源于,,个无皮肤病变的正常人，用基因组,,,提取试剂盒提取基因组 , 中文摘要,,,(,,,,,,, ,,,,,;, ,,(,,,，,,,,,,,，,,,,,天根生化科技北京有限公司)。用,,,,,,一,,,从患者妹妹的颊粘膜拭子中提取基因组,,,。以提取之,,,作为，用成对的外显子特异性引物对患者的,,,,基因组,,,的全部,个外显子进行,,,扩增反应。引物序列的设计按照,,,,,,等在,,,,年文献中报道的方案。 ,、聚合酶链反应和,,,直接测序 应用聚合酶链反应和,,,直接测序方法对,,,患者,,,,基因的,一,外显子的突变进行检测。同时也分别检测患者父母和妹妹的,,,,基因的,—,外显子序列。,,,扩增反应体系为,,, ,反应体系，其中基因组,,, ,,,,(,,,, ,,,,)，每种引物各,,,,(,,，，,,,)，,,,,,,,,,,,(各,(,棚),,,，,(,,,,的,,,,,？酶(,,,,, ,)(,,,,,, ,,,,？ ,,, ,,,，,,,,,, ,,,,,;,,,,,,, ,,,,,, ,,(，,,,)， ,,×,,, ,,,,,, ,,, ,，在,,,一,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,(,, ,,,,,,;,，,;(,(,(,)扩增仪上进行扩增反应。,,,反应条件:,,”,预变性,,,,，,,”,变性,,,，按各自的退火温度退火,,,，,,?延伸,,,，进行,,—,,个循环，最后在,,?延伸,,,,。,,,产物直接测序，检测到患者有几个碱基改变( 四、结果: 病人,岁时就已经有手掌脚掌过度角化和严重牙周炎的疾病发作史(同时伴有膝部肘部的皮肤过度角化。牙周组织早期破坏的侵袭性牙周炎导致的乳牙过早脱落后牙周炎症消退。该,,,患者在,岁(,,,,年)时大部分乳牙已经脱落，并在儿童时期就表现出对细菌感染的易感性增加，反复发作的感染，特别是反复发烧、扁桃腺发炎。患者的父母和妹妹均未发病。 通过对一个,,,患者的,,,,基因分析已确定了,个新的突变，对患者;,,;基因外显子卜,的,,,产物直接测序分析，在外显子,的,,,位碱基,被删除了(;(,,,,,,,)导致其后的第,,位氨基酸到第,,位氨基酸发生了移码突变，患者父母和妹妹此区域的,,,序列是正常的;患者外显子,在,,,位的碱基,被,置换(;(,,,,,,)，产生了一个单碱基杂合突变，此突变导致,,,,基因第,,,位氨基酸密码子由,,,替换为,,,，其编码的氨基酸由,半胱氨酸替换为, ，, 博士学位论文丝氨酸(,(,,,,,);外显子,的第,,,位碱基,被;置换(;(,,,,,,)，导致,,,,基因第,,,位氨基酸密码子由,,,替换为,,,，其编码的氨基酸由,苯丙氨酸变为,丝氨酸(,(,,,,,)。外显子,的第,,,,位碱基,被,置换，(,(,,,,,,,)，导致;,,,基因第,,,位氨基酸密码子由,,,替换为,,,(,(,,,,,)，但其编码的氨基酸未改变，仍为,谷氨酸，此突变为同义突变。 五、结论: 通过对一个汉族家庭的,,,患者的;,,;突变基因的分析已确定了,个新的突变，证实掌跖角化牙周病变综合征或帕一勒氏综合征(,,,,,,,,—,,,,,,,,,,,,,,,，,,,)与,,,,基因的突变有关，但突变的类型和病变的严重程度及皮肤病变发生的部位之间的关系还不明确。,,,是一种伴有掌跖过度角化 ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,，,,,,)和严重牙周破坏为临床特征的掌跖角化病(,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,，,,,)，,,,,是全部掌跖皮肤增厚的不同种类的一组疾病。临床上区别,,,和其他的,,,是严重的早期发作的牙周破坏。患者乳牙的发育和萌出过程是正常的，但是牙齿萌出进入口腔内就与牙龈感染和后来发生的快速牙周破坏有关，这些破坏性牙周病的形式特点是对传统的牙周治疗不敏感，因此，通常乳牙过早脱落，脱落后炎症消退牙龈恢复健康外观。秆而在恒牙萌出时期此过程重复出现，导致恒牙过早脱落，多数患者虽然第三磨牙保留下来了，但,,,患者牙槽骨有严重吸收，导致牙槽嵴广泛萎缩，牙齿治疗更复杂。有显示，通过牙周非手术治疗，结合抗生素的全身使用，拔除严重的患牙和认真的维护治疗，对某些掌跖角化一牙周破坏综合征患者有一定的疗效。但至今无一例报告掌跖角化—牙周破坏综合征患者经过治疗恒牙全部保留( 我们检测了一个,,,患者及其家庭成员的;,,,基因，并对该基因的突变进行了评估。用多聚酶链反应扩增,,,患者;,,;基因的全部,个外显子，扩增后的产物直接进行测序。检测到在,,,,基因第,,,氨基酸有一个错义突变，此处的氨基酸由,苯丙氨酸 变为,丝氨酸(,(,,,,,)，此突变改变了组织蛋白酶,多肽该区域 , 中文摘要的高度保守氨基酸位点，使,,,,蛋白质的结构发生了改变。在第,,,位氨基酸有一个杂合的错义突变，此处的氨基酸由,半胱氨酸替换为,丝氨酸(,(,,,,,)，也影响了组织蛋白酶;多肽的高保守氨基酸位点，使,,,,蛋白质结构发生了改变。在,,,碱基处有一个删除碱基,的突变，和一个,,,氨基酸的同义突变。同时在正常对照组中也未检测到这些突变。以前报导过突变的杂合子携带者没有,,,的临床表现和症状，此,,,患者是一个,,,,基因的复合型杂合突变。这些组织蛋白酶;基因的突变，扩大了,,,的突变谱，有助于理解基因型和显性之间的关系。 本研究的一例掌跖角化牙周病变综合征患者，经过广东省口腔医院牙周病科,,年的治疗和观察，所有恒牙完好保留，所采取的治疗措施包括牙周非手术治疗，抗生素的全身使用，认真的维护治疗，以及非激素类抗炎药和补肾固齿中药的应用。该病例的成功治愈的机制与组织蛋白酶;基因突变之问的关系还有待进一步的探讨(关键词:掌跖角化牙周病变综合征,帕一勒氏综合征组织蛋白酶;,二肽肽酶，突变 ,, 博士学位论文 ,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,, , ,,,,(,,,,),, , ,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,,,龟,,, ,,,,,,,, ,,,,,:,,,,,;,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,,,:,, ,,,,—,,,, ,,,,,,,,,,:,,,,(,,,,, ,,,,;,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,—,,,?,,, ,,,,,,,,(,,,，,，, ,,,,,,)，,,,, ,, ,,;,,,,;, ,, , ,, ,,,,,,,,,，,, , ,,,, ,,,,,,,,, ,,;,,,,,, ,,,,,,,, ;,,,,;,,,,,,, ,, ,,,,,,,,, ,,,删,,, ,, ,,碱,,,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,;,,,,,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,,,，,,,,,,,,,,,, ,,,;,,,,,,,,,，,,,,,;,,,,,, ,,,;,,,,,,,,,, ,, ,,;,,,,,, ,,,,;,,,,, ,,,,,, ,,, ,,,,, ,,,,, ,, ,,,,(,,,,,, ,, ,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,;,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,, ,,,,,,, ,,, ,;;,,,,,, ,,,,,,,,,,(,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,;,,,,,,;, ,,,, ,, ,, ,,,,, ,,,,, ,,, ,,,,,,,, ,?,,,,,,, ,,,,,,,,,,)(,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,伽一;佗,,; ,,,,,,,,(,,,),,, ,,,,, ,,,,,, ,,,,,,, ;,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,;,,,,,, ,,,, ,,,,,,, ,,,,,,;,,,,，,,;,,,,;,, ,;,,,,,删,;,,,,, ,,, ,,,, ,,,,,,,,，,, ,,,, ,, ,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,; ,,,,, ,,,,;, ,,,,,,,( ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ;,, ,, ,,,,,,, ,,,,,,, ,,,, ,,, ;,,,,,,,,,。,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,;,,,,，,,,,,,,,,, ,, ,,,,;,,,,, ,,,, , ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,岍,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,(,,,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,, , ,,,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,, ,,,, ,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,;,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,(,,,,,,;,,,,,, ,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,，,,,,,,,, ,,,,，,,, ;,,,,;,,,, ,,,,,,)(,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,, ,, ,;;,, ,, ,,—,,,,, ,,, ,,,,, ,,,,,,,,,, ,,, ,, ,(,,,,,,;,,,,,,,，,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,(，, ,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,，,,,, ,,,,, ,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,, ,, ,, ,,,,,,,,,;,,,, ;,,,,,,，,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,; ,,,, ,,;,,,,(,,,,,,,,,,,;,,,; ,,;,,,,,,(,,, ,,,,,,,, ,,;,,,,,),,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,(,,, ,,,,,,,，;,,,,,,,, ,,,,,,,),,,, ,,,, ,,,,,,,,,, ,, ,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,(,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,;,,盯,,,, ;,,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,(,, ,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,, ,, ,,, ,,,, ,,,,,,,, ,,,, ,,,,;,,(,, ,,,,，,,,,,,;,,,; ,,,,;,,,, ,,,,,,, ,, ,,,,, ,,;,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,, ,,,,,,,(,,,,, ,, ,, ,,;,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,, ,,,,, ,, , ,,,,,,,;,,, ,,,,,,; ,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,，,, ,, ;,,,, ,,,, ,,,, ,,,,, ,,,,, ,, ,,,,,,,(,,),,, ,,,,, ,,,;,,,,,,,,,,,,,,(,,,),,, ,,,,,,;,,,, ;,,,,,,(，, ;,,,,,,, ,, ,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,，,,,,, ,, ,,,,,,;, ,,,, , ,,,, ,,,,,,, ,,,,;, ,, ,,,,,,,,, ,,,,,( ,,, ,, ;,,,,(，, ,, ,,,,,,,,, ,, ,,, ;,,,,,,,, , ,,,,(,,,,(,,, ;,,,,,,,, ,,,,, ,,;,,,, , ,,,,,,,,, ;,,,,,,, ,,, ,,,,,，, ,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,,,，,,,, ,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ，(,,, ,),,,;, ,,,;,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,, ,,,,, ,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,(，, ,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,(,仰, ,,,,,,,,,, ,,,,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,, ,, ,,,,,;,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,, ,, ,;,,,,,,,, ,, ,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,，,,;,,,,,, ,,,,,,,,,,,,;,,,, ,,,,,;,,,,，,,,,;,,,,,,;,,,,,,,,，,,,, ;,,,,,,, ,,,,, ,,,;,,,,,,，,,,, ,,,,,,, ,, ,, , ;,,,,,, ;,,,,,,,,,, ,,, ,;,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ;,,,,(，, ,, ,,,,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,,,, 博士学位论文,,,,,,, ,,;, ,, ,, ,,, ,,,,,，,,,,,,, ,,, ,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,(,,, ,,,, ,,,;,,,,,,, ,,, ， ,,, ,,,,,,, ,, ,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,,?,,,,,, ,;,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,;,, ,,,,(, ,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,, ,,,,,;,, ,,,, ,,, ,,,,,(,,;,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,;,,,,,,,,,, ,,,,;,,,,,, ,,,,;,,,,,;,,,,,,,，,,, ,,,, ,,,,,,, ,,, ;,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,,, ;,,,,(,,,,,,,,,,，,,, ,,, ,,;,, ,,, ,,,;,, ,, ,,,,, ;,,,,,,,,,,,？,, ,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,(,,,;,,, ,, ,,，,,,,;,,,,, ,, ,,，,,,,;,,,,;, ,,，,,,,，,,,,;)，,,, ？,,,, ,,;,,,,, , ,,,,,, ,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,, ,,, ,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,, ,,, ,,,, ,,;,,,,, ,,,,, ;,,,,,,,, ,(,,,,)(,,,,,, ,, ,,，,,,,;,,,, ,, ,,，,,,,，)( ,,,,;,, ,, ,,, ,,;,,,, ,,,,,,, ,,,, ,,,, ,,,,, ,, ,, , ;,,,, ,,,,,,,,,,,,,,;,,, ,,,,,,,,，,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,(,;,;,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,”,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,，,,, ,,,,，,,, ,,,,,,;, ,, ,,, ,,,, ,,,, ,,,, ,,,, ,,,,,,,;,,,, ,, ,,,,,,, ,,;, ,,,,,,,(，, ,,,,,,,,，,,,, ,;,, ,,,,,,,, ,,, ,,,, ,,,,,,;,,, ,, ,,,,, ;,,,,,,,,, ,,;, ,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,(,，,),,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,口,,)，,,,,,,, ,,,,;,,,,, ,,, ,,,;,,,;,,, ,, ,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,, ;,,,, ,, ,,,( ，, ,,,, ,,,,,, ,,,,,, ,, ,, ,,,, , ,,,;,,,,,, ,,,,, ,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,, ,,,, ,, ;,,,,,,,, , ,;,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,, ,,, ,,,,;,, ,;,,,,,, ,, ,,,,,,,,;,,,,,,,(, ,,,,, ,,,, ,,;,, ,,, ,,, ,,, ,,,, ,,,,,, ,, , ,(, ;, ,,,,,,,, ,,;,,,,,,,,, ,,？,,(,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,;,, ,,, ,,,,,,; ,,,, ,, ,,,, ，,,,,,,, ,,,,;,,,,, ,,;,,,,, ,,,,,,, ,,,, ,,, ,,, ,,,,, ,,,,, ,,;,,,,,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,; ,, ,,,,。,,, ,,,, ,,;,, ,,, ,,,, ,, ,,;,,,, ,,;,,,,,,,, , ,,,,(;,,;)(,,;,,,,,,,,, ,,？,,(,,？,,(, ,, ,,,,,,,, ,, ,, ,,,, ,,,,( ,,, ,,,,,,,, ,, ,,, ,, ,,,,,,, ,,,,,,,(,,,,,,，,, ,,,,;,, ,, ,,, ,,,,,,,;,,,, ,,,,,,;,,,,,,,, ,,,, ,,,, ,,,,, ,, ,, , ;,,,, ,, ,,,, ;,,,,,,,,，,,,,, ,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ;,,,,,,, ,, ,,,, ,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,, ,,,, ,,, ,,,,,,;, ,, ,,, ,,,,,,,, ,,,, ,,,, ,, ,,,,,;,,,, ,, ,,,,,,, ,,,, ;,,,,,,,,( ,,, ,,,, ,,,, ,, ,,,, ,,,, ,,,, ,,, ;,,,,,,, ,, , ,,,,, ,, ,,,,, ,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,(,,, ;,,,,,,,,,,,, ,(,,, ,,,, ,,;,,,, , ,,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,, ,;,,(,,, ,,,,;,, ,,,,,,,,,,, ;,,,,,,, ,, , ,, ,,,,, ,;,, ,,,,,, ,,,,,,,，, ,,, ,,,,, ,;,,,,,,,,,,,,，,,, ,,, ,,,,, ,;,, ,,,,,, ,,,,,,(,, ,, ,,,，,,,, ,,,, ,, ,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,, ,,,, ,,,, ,,,;,,,,, ,;,,,, ,,,,,,, ,,,,,; ,,;,,,,,,, ,(,,,,,,,，,,,,,,,,, ,,,, ,,, ,,,,,, ,, ,,, ,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,(,?衄,,,，,,,: ,,, ,,, ,,,,,, ,,,,, ,, ,, ,,,,,,,,,,, ,,, ;,,,,;,,,,,,,;, ,,,,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,?,,, ,,,,,,,,(,,,)(,,, ,,,,, ,,,, ,,,,,,, ;,,,,,, ,,, ,,,,,,,, ,,;,,; ,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,，,,, ,,,,,,, ,,,,, ,,, ,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,, ,，,, ,,,, ,,, ,,,,,,, ,,,,, ,,, ,;,,,, ,, ,,,, ,,,, ,, ,,,(,匝,,,,,:,、,,,,,;,, ,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,; ,,,,,,,, ,,, ,,,,,, ,, , ,, ,,,, ,,, ,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,, ,;,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,, ,,,,,,;,,, ,,,,,,,,,,,;,, ,,,,,,,,(,,, ,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,, ,,,,, ,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,;,,,，,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,, ,,,,,,,,, ,,,, ;,,,,;,,,,,,,; ,,,,,,,, ,, ,,, ,, , ,,,,, ,,,(,, ,,, ,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,;,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,;, ,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,, ,,,, ,, ,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,, , ,,,,,,,,;, ,, ,,,,,,,,,,,,,(,, ,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,, ,,,,,,,, ,, ,,, ,,;,,,,,, ,,,,, ,,,, ,,,, ,, ,,, ,,, ,, , ,,,,,(,, 博士学位论文,,, ,,,？,,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,;,,,,, ;,,,,;,,,,,,, ,, ,,;,,,,,, ,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,, ,,;,,,,,,,,(,,,,,,,,,, ,, ,,;,,,,,, ,,,;,,,,,,,,,, ,, ,,;,,,,,, ,,,,;,,,,,。,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,;,,,,,(,,, ,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,, ,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ;,,,,,,,,,,,,(,,, ,,,,,,, ,,, ,,, ,,,,,,,’, ,,,,,, ,,, ,,,,,,;,,,(,、,,, ,)订,,,,,, ,,,,,,, ;,,,,,,, ,,,, ,,;, ,,,,,;,,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,,,,,, ,,, ,, ,,, ,,,,,？,,,, ,,,,,,,(,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,, ,, ,,, ,,;,,,, ,,,,,,,, ,,,,,;,,,,,,(,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,, ,,,, ,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,, ,, ,,,,,,;, ,, , ,,,, ,,,,,,,(,,, ,,, ,,,, ,, , ,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ;,,,, ,,,;,,,,(,,,),,,,,,,;,,,,, ,,,,,,, ,,, ,,,,,,,, ,,,,;,,,, ,,,,,,,,(,,,,,,; ,,, ,,他,,,,,;,,, ,,,,, ,,,,,,,; ,,, ,,,,,;,,,, ,,,(,,,,, ,,,,,;, ,,(,正,,,,,,,’,,,,,)(,,,,,,;,,, ,,,, ,,, ,,,,,,,’, ,,,,,, ,,, ,,,,,;,,, ,,,,, ,,,,;,,,,, ,,,, ,,;;,, ,,;,,,,,,,,(,,, ,,,,,;,,, ,,,,,,; ,,, ,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,, ,,,, ,,,, ,,,,, ,,,,, ,, ;,彻,,,,:;,畸; ,,,,,,,(,,,,,,,,, ,,？,,,;,, ,;，?,,,;,’,,, ,, ,,,,,, ,, ,,(,、,,, ,,,,，,,,,,，,, ,,, ,,,,,,,，,, ,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,;,,,, ,,, ,,,,;, ,,, ,,？,,,;,,, ,,,, ,,,,,,,,,, ,,,;,,,, ,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,, ,, ,,, ;,,,,,,,, , ,,,, ,,,, ,,,，,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,;,,,,,,(,,, ,,,,,,,;,,,,, ,,, ;,,,,,, ,,, ,, , ,, , , ,,,;,,,, ,,,,,,;,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,;,,,(,,,,,,,,，,,，，,,, ,,,,;, ,,,,,,,,，,’,,， ,,,,,, ,,,,,,,(,(,,, ,,;,)，,(,, ，, , ,,,,,？(,,,,, ,)，,,, ,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,(,,, ,,,,,, ,,,,？ ,,, ,,, ,,, ,,,;,,,,, ,,,, ,,,,,, ,,,,,;,,,,,,,,,,,,, ,,(,,,(,,,,,,,;,,,,, ,,, ,,,,,,,,, ,, , ,,,?,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,(,, ,,,,,,;, ，,;(,,,),,,,, ,,, ,,,,,,,,, ;,,,,,,,,,:,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,。, ,,, , ,,,，,,,,,,,, ,, ,, ;,;,,, ,, ,,。, ,,, ,,,，,,。, ,,, ,, ,，,,。, ,,,,,, ,,, , ,,,,, ,,,,,,,,, ,, , ,,,, ,, ,,。,(,,, ,,,,,,,,, ,,,,,;,, ,,,’;,,,, ,,, ,,,,;, ,,？,,,;,,,(,,,,,,,: ,,, ,,,,,,, ,,, , ,,,,,,, ,, ,,, ,,, ,, ,, ,,, ,,,,,,,, ,, ,,, ,,, ,, ,,,,, ,,,,,(,,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,, ,, ,,, ,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,, ,,, ,,,,,, ,, , ,,,,, ,,,(,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,;,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,, ,, ,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,, , ,,,,,,,,;,,, ,,,,,,,,,,,,,(,,,,;,,, ,,,,,;,, ,,, ,,,,,,,,,,，,,,,,, ,,,, , ,,,,,,,, ,, ,,,,,;,,,,,, ,,,,, ,, ,,, ,,, ,, , ,,,,,(,, ,,, ,,,,, ,, ,,,, ,,,？,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,;,,,,, ,,,,;,,,,, ,, ,,, ,,;,,,,,, ,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,, ,, ;,,,,,,,,，,,,,,,,,,, ,,,,,;,,,,,, ,,,;,,曲,,,,, ,, ,,;,,,,,, ,,,,;,,,,,( ,,,,,,,, ,,,, ,,,, ,, ,,,,,,, ,,,, ,,, ;,,,,,,,, ,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,(,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,, ,,,, ,,,,,, ,,,, ,,,,,,;,,,(,,？,,,;, ,,,,,,,, ,, ,,, ,,,, ,,,,,,,,,,;, ,,,, ,,, ,,,,,,, ,,,,,, , ,,;,,,,,,, ,,,,,,,, ;,,,,, ,, ,,,,,,,, ,,,,,, ,(;(,,,,,,,),,,;, ,,,,,,,;,, , ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,(，, ,,,, ,脱，,,,,,,,’,,,,,,, ,,, ,,,,,,, ,,,,,, ,,,, , ,,,,,, ,,？,,,;, ,, ,,,(,;？,,锄;, ,,,,,,,, ,, ,,,,,,, , ,,,,,,,,,;, ,,,, ,,, ,,,,,,, ,,,,,, , , ,, ;,,,,, ,, , ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,, ,,, ,,;,,,,,,, , ,,,,,;, ,(,(,,,,,,)，,,, ;,,,, ,, ,,,,, ,;,,,,,,,,,, ,,, ,,,, ;,,,,,,, ,, ,,,,,, ,,,;, ,,,,,,, ,, ,(,,,,,(,,,, , ,,,,,,,,,;,,,,, ,,, ,,,,,,, ,,,,,, , ,,;,,,,,,,, ;,,,,, ,, ,,,,,,,, ,,, , ,,,,,;, ,(;(,,, ,,,)，,,, ;,,,, ,, ,,,,, ,;,, ,,,,,,,, ,,, ,,,, ,,, ,, ,;,，,,, ,,,,, ,;,, ,,,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,, ,,,;, ,,,,,,, ,, ,(,,,,,(,,, ,,,,, ,,, ,,;,,,,,,,, ;,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,;,,(;(,,,,,,,)，,,,;,,,,,,,,,,, ,;,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,, ,, ,,, ,,,, ,,,,, ,;,, ;,,,,,, ,, ,,,,,,,, ,,,, , ,,,,,;, , ,, , ,,,, ,,,,,,,,,,,,,(,,,,, ,,,,,,, ,;,, ,,,,,,,, ,,, ,, ,,;,,,,,, ,,,;, ,,,,,,, ,, ,(,,,,, 博士学位论文,,,;,,,,,, ，, ,,,, ,,,,,，,, ,,,, ,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,, ,,,,,,,,, ,, , ,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,，;,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,, ,,,, ,,, ,,,,,,,,;,,,, ,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,(,,,,,,,，,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,, ,, ,,, ;,,,,,,,, ,, ,,,, ,, ,,, ,,,,,, ,, ;,,,,,,,, ,,,,,,, ,, ,,,,;,,,,,,,, ,,,,, ,,？,,,,, ,,,,,,, ;,,,,,,;,,,,,(,,, ,, , ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,(,,,),,,, ;,,,,;,,,,,,,; ;,,,,;,, ,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,;,,,,(,,, ,,,, ,,; , ,,,,,,,,,,,,, ,,,,, ,, ,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,, ,,,;,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,(,,,,,;,,,,，,,, ,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,, ,,,(, ,, ,,,,,,(,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,;,,,,(，, ,,,,;,,,,,,,,;,,，,,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,, ,,,,, ,,,;,,, ,,,,,,,,，,,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,,,, ,,,,, ,,,, ,,, ,,,, ;,,,,, ,, ,,,,;,,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,？,,,, ,,,,, ,,,,,,;,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,,,,(,,,, ,,,, ,, ,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,, ,, ;,,,,;,,,,,,,;,,,, ,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,，;,,,,？,,,,,,，,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,(,,,,, ,,,,,,,,,,,，,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,, ,,, ,,,,,,, ,,,,,,艘;, ,,,,,姆,,,,,,,,;,(,,,,,,,，,,,, ,,, ,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,, ,,,;,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,，,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,，,,,,,,,, ,,, ,,,,,, ,,,,,, , ,; ,,,,,,,,, ,,,,,,(,,,,,,;,,,, ,, ,,, ,,,,,,,, ,,,, ,,,,, ,, ,,,,,,, ,,,,,,，,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,, ,,,,,,，,,,,,,;,,,,,;,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,(,,,, ,,;,,, ,,,,,,, ,,,;,,,,, , ,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,(,,,,,,,,,;,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,, ,，,, ,,,,,,,;,,,,,,, ,, ,,,,,;,,,,, ,, ,,,,,,,, ,,,,;,,, ,,,,,，,,, ,, ,,,,,,,; ,,,,,,,,,;, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,;, ;,,,(,,,，,, ,,, ,,,,, ,, ,, ,,,,,,, ,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ;,, ,, ,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,( ,, ,,,, ,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,;,?,, ,,,,,,,,，,,, ,,,,,,,,, ,,,,乙蝴 ,,, ,,,, ,,;,,,,, ;,,,,,,,, , ,,, ,,,,,,,,,(,,, ,,,,,,,, ,,,,;,,,, ,,,,,,,, ;,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,, ;,,,, ,,,;,,,, ,,,,,,,;,,,,, ,, ,,, ,,,,, ,,,,, ,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,;, ,,;,,,,,,, ,,？,,,;,,,(,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,， ,(,,,,,，,,,,;,,,, ,,,,,, ;,,,,,,,, ,,,,, ,;,, ,,,,,,,, ,,,,,, ,,, ;,,,,,,,, , ,,,,,,,,,,,，,,,;, ,,,,,, ,, ;,,,,, ,, ,,,,,,, ,,,,;,,,,，,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,， ,(,,,,,，,,,, ,,,,;,,,, ,,,,,, ;,,,,,,,, ,,,,, ,;,, ,,,,,,,, ,,,,,, ,,, ;,,,,,,,, , ,,,,,,,,,,,，,,,;, ,,,,,, ,, ;,,,,, ,, ,,,,,,, ,,,,;,,,,，,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,, (;(,,,,,,,)，,,, ,,,, ,;,,, ,,,,,,,,,，,(,,,,,(,,,,,,,,,, ,,,,,,,, , ,,,,,,,,,,,, ;,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,, ;,,,,;,,,, ,,,,,,;,,,，,,, ,, ,,,,,,;, ,, ,,,(,,,,, ,,,,,,,,, ,,,, ,,, ,,,,,,, ,, ,,,,,,,,, ;,,,,,, ,,,,,,,,,,,，,,, ,,,,;,,, ,,,,,,,,,,, ,,,, ;,,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,, ,,,, ,,,,(,,,,,,,, ,, ,,,,, ;,,,,,,,, , ,,,, ,,,,,,,,, ,,,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,?,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,, ,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,, ;,,,,,,,,,,,( ，, ,,, ;,,,,,, ,,,,,，,,, ,,, ,,,,,,, ,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,;,,,,,, ,,,,,,,,,;,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,，,,; ,, ,,,,,,,; ,,,,,,,,,;,，,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,;, ,,,,，,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,;,,,(,,,,, ,, ,,,,, ,, ,,,,,,,,,，,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,(,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,;;,,,,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,, ,,,,,,, ,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,:,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,?，(,,昆,,, ,,,,,,,,;,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, , ,,,,,,,, ......