木瓜蛋白酶的活力检测标准研究

木瓜蛋白酶的活力研究 * 张兴灿，陈朝银，李汝荣 ,昆明理工大学清华大学生物资源开发研究所 ，云南昆明 ,-650224摘 要,分 别 按 国 家 标 准 和 企 业 标 准 中 紫 外 分 光 光 度 法 测 定 了 两 个 酶 制 剂 企 业 生 产 的 木 瓜 蛋 白 酶 酶 活 力 ，结 果 明 ， 企 业 标 准 与 国 家 标 准 测 定 的 酶 活 力 两 种 方 法 测 定 的 结 果 差 别 高 达 几 十 倍 ，原 因 可 能 与 底 物 溶 液 的pH、反 应 条 件 和 巯 基 还 原 剂 半 胱 氨 酸 盐 酸 盐 有 关 。 关键词,木 瓜 蛋 白 酶 ，酶 活 测 定 ，标 准 Study on determination standards of papain activity *ZHANG Xing-can, CHEN Chao-yin, LI Ru-rong (Institute of Bioresource R&D of Kunming University of Science and-Tsi Technolognghua Universityy, Kunming 65022Chin4,a) Abstract,The determination standards of enzyme activity of papain got from two companies depended on National standards and Enterprise standards was studied respectively，found that the results had great differences. Then possible reasons were analyzed，the main influential factors may be pH of substrate，reaction conditions and cysteine hydrochloride. Key words,papain,determination of enzyme activity,standard 中图分类号,TS207.2 文献标识码,A 文 章 编 号,1002-030(62011)10-0435-03 木瓜蛋白酶(Papain，EC 31412212)是一种具有 释放出的三氯乙酸可溶物在280nm处的消光值相当 广泛底物专一性的含巯基蛋白酶，有很强的分解蛋 于浓度为1g/mL酪氨酸消光时所需的酶量，为一个 μ [1]U)。 。 酶活力单位(白质的能力，此外也具有水解酰胺键和酯键的特性 由于它具有适用pH范围广、热稳定性好等优点，广泛 Utrospec2100 型 紫 外 分 光 光 度 计 Amersham l Pharmacia公司;HH-S型恒温水浴锅 郑州长城科工 应用于医药、食品、纺织、制革、饲料、染料等工业生 贸有限公司;实验所用试剂 均为分析纯。产中。活力是蛋白酶最重要的质量指标，目前国家仅[4][2]1.2 国标GB/T 23527-2009规定的 有蛋白酶制剂的通用标准，由于对各类蛋白酶制剂 1.2.1 试剂与溶液尚无标准规定，企业、生产厂商通常根据国家蛋白酶 1.2.1.1 三氯乙酸 称取三氯乙酸65.4g/L，用水溶解 制剂通用标准制定自己公司特定蛋白酶的企业标 1000mL。 并定容至准。例如，目前我国的一些植物蛋白酶制剂工厂已在1.2.1.2 缓冲溶液 因为木瓜蛋白酶是中性蛋白酶，采 生产木瓜蛋白酶，但对于木瓜蛋白酶的质量检测，特 pH=7.5)，分别称取磷酸氢二钠(NaHPO? 24用磷酸缓冲液(别是酶活性检测的方法、条件和标准比较混乱，使产 [3]。为了提高产品质量， 12H O)6.02g和磷酸二氢钠(NaH PO?2H O)0.5g，加水 2 2 4 2 品保存和销售受到严重影响 溶解并定容至1000mL。 增强国际市场的竞争能力，亟待加强管理和统一检 测标准。经我们研究发现，企业标准与国家标准测定 1.2.1.3 L酪氨酸标准储备溶液(100μg/mL) 精确称 - 105?干燥至恒重的L-酪氨酸(0.1000?0.0002)g， 的酶活力的差值竟然高达几十倍，这说明我国的酶 取预先于 1mol/L盐酸溶液60mL溶解后定容至100mL，即为 用制剂市场存在着较大的漏洞。 1mg/mL酪氨酸溶液。材料与方法1 吸取1mg/mL酪氨酸溶液10.00mL，用0.1mol/L盐 1.1 材料与仪器 100mL，即得到100μg/mL的L-酪氨酸 酸溶液定容至样品 选用两个酶制剂公司生产的木瓜蛋白酶 标准储备溶液。 产品，以酪蛋白为底物，测定木瓜蛋白酶的酶活性; 1.2.1.4 氢氧化钠溶液(20g/L) 称取氢氧化钠片剂 酶活力单位定义 在测定条件下每分钟水解酪蛋白 20.0g，加水900mL并搅拌溶解。待溶液到室温后，以 1000mL，搅拌均匀。 水定容至收稿日期,2010)10)08 * 通 讯 联 系 人 作者简介,张 兴 灿 ,1987-,，男 ，在 读 硕 士 ，研 究 方 向 ,生 物 技 术 制 药 。 1.2.1.5 盐酸溶液 浓度为1mol/L及0.1mol/L，按GB/ 基金项目,云 南 省 科 技 计 划 项 目 ,2009EB08,1 。T 601配制。 1.2.1.6 酪蛋白溶液 (10.0g/L) 称取标准酪蛋白 1.3.1 溶剂 (NICPBP国家药物标准物质)1.000g，精确至0.001g， 1.3.1.1 0.05mol/L 磷酸氢二钠溶液 称取8.955g磷 酸氢二钠(NaHPO?12HO)到500mL容量瓶，用纯水 用少量氢氧化钠溶液润湿，加入相应的缓冲溶液约24280mL，在沸水浴中加热煮沸30min，并不时搅拌至酪 溶解并稀释至刻度，摇匀备用(加一滴甲苯防腐)。100mL容量瓶中， 蛋白全部溶解。冷却到室温后转入 1.3.1.2 酶缓冲液(现配现用) 称取0.528g L-半胱氨酸pH缓冲溶液稀释至刻度。定容前检查并调 用适宜的 盐酸盐、0.2236g乙二胺四乙酸二钠(EDTA)，用 0.05mol/LpH至相应缓冲液的规定值。此溶液在冰箱内贮存， 整磷酸氢二钠溶液分别溶解(共加入约90mL)，合并混 3d。使用前重新确认并调整pH至规定值。 有效期为0.1mo/L氢氧化钠溶液或0.1mo/L盐酸调pH,6.0， ll 匀，用1.2.2 分析步骤 100mL。 定容到1.2.2.1 标准曲线的绘制 L-酪氨酸标准溶液:按表 1.3.1.3 酪蛋白溶液(现配现用) 称取0.600g酪蛋白 1配制。L-酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测定。 0.001g0.05mo 80m(标准至)，加入l/L磷酸氢二钠溶液L， 表1 L-酪氨酸标准溶液 60?水搅拌溶解，用0.1mol/L 盐酸调pH,6.0，用纯水 100m40?0.2? L，()保温备用。 酪氨酸标准溶液酪氨酸标准储备液体积加水体积定容到 管号 (g/mL)(mL)(mL)μ 1.3.1.4 2.994g1.982g三氯乙酸溶液 称取乙酸钠，0 0 0 10 乙酸，1.798g三氯乙酸，用纯水分别溶解后混合，定容 1 10 1 9 到100mL容量瓶中，摇匀备用。2 20 2 8 1.3.1.5 待测酶溶液 称取待测木瓜蛋白酶适量(精3 30 3 7 4 40 4 6 确到0.001g)，置100mL容量瓶中，加5mL酶缓冲液浸 5 50 5 5 20min，加水至刻度，摇匀后，吸取1.0mL到25mL容 泡 分别取上述所配的溶液，以0管为空白，利用紫 量瓶中，加酶缓冲液至刻度，摇匀。 外分光光度计于波长275nm下测定吸光度。以吸光度 1.3.2 测试步骤 A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲 1.3.2.1 待测酶溶液的测试 量取1.0mL待测酶溶液 1时的酪氨酸的 40?0.2)?水浴锅中水浴10min， 置于具塞试管中，在(线。利用回归方程，计算出吸光度为 量(μg)，即为吸光常数K值。其K值应在130~135范围 迅速加入酪蛋白溶液5.0mL，振荡使之充分混合后封 10min，加入三氯乙酸溶液 内，如不符合，需重新配制试剂，进行实验。口放回水浴，精确计时 1.2.2.2 样品的测定 待测酶液的制备:称取酶样品5.0mL，立即摇匀，过滤。用纯水作为空白，在275nm1:2g，精确至0.0002g。然后用相应的缓冲溶液充分溶 下测定滤液的吸光度A。1 1.3.2.2 待测酶的空白测试 量取1.0mL待测酶溶液 解，然后取滤液(慢性定性滤纸)稀释至适当的浓度。 测定:先将酪蛋白溶液置于(40?0.2)?恒温水浴中，40?0.2)?水浴锅中水浴10min， 置于具塞试管中，在( 预热5min，然后按以下流程操作:迅速加入三氯乙酸溶液5.0mL，振荡使之充分混合后 10min，加入酪蛋白溶液5.0mL， 封口放回水浴，计时试管B(酶试样，需三个平行样) 试管A(空白) 280nm下测定溶 ? ?立即摇匀，过滤。用纯水作为空白，在加酶液2.00mL 加酶液2.00mL 液的吸光度A。 2?(40?0.2)?，2min (40?0.2)?，2min ?1.3.2.3 酪氨酸标准液配制和测试 称取0.050g L- 加酪蛋白溶液2.00mL(摇匀) 加三氯乙酸4.00mL(摇匀) 酪氨酸标准品(精确至0.001g)至1000mL容量瓶中， ?(40?0.2)?，10min (40?0.2)?，10min ?0.1mol/L 盐酸溶解并稀释到刻度 (此为50μg/mL 加三氯乙酸4.00mL(摇匀) 加酪蛋白溶液2.00mL(摇匀) 用? ?的标准液)。以纯水作空白，在280nm波长处测吸光 取出静止10min，过滤 取出静止10min，过滤 A。 3度 (慢速定性滤纸) (慢速定性滤纸) 1.3.3 结果计算 试样中酶活力X1(u/g)按下式计算:? ?X1,([ A)A)/A]×50×(11/10)×(n/m)式(2) 123 测滤液吸光度测滤液吸光度 式(2)中:A—待测酶溶液测试滤液的吸光度; 1结果计算 从标准曲线上读出样品最终稀释 1.2.3 A—待测酶空白测试滤液的吸光度;A—酪氨酸标 23 液的酶活力，单位为u/mL。样品的酶活力按下式计算:n—待测酶样品的稀释倍数;m—待测 准液的吸光度; X×V×n×8 11 X= × 式(1) 2 酶样品的质量，g。2×m 10 2 结果与讨论式(1)中:X—由标准曲线所得的样品最终稀释 1 液的酶活力，u/mL;X—样品的酶活力，u/g;V—溶解 2.1 由所配制的酪氨酸稀释液测定的吸光度数据 2 mL;n—稀释倍数;8—反 标准曲线样品所使用容量瓶的体积， 应试剂的总体积，mL;2—吸取酶液的体积，mL;m—=0.0077由标准曲线所得的回归方程为:YX，相 样品的质量，g;1/10—反应时间10min，以1min计。R=0.9979，经计算吸光常数k=130，符合实验 关系数[56]-1.3 按两个公司各自的企业标准进行测定 要求。 其中一个公司的企业标准为Q/JWLSW 01-2007 2.2 两个标准测得的酶活力结果 (木瓜蛋白酶)，另一个公司的企业标准为Q/NPB 01-对比表2和表3可以看出，在两个不同的标准下 2009(木瓜蛋白酶)，两个标准的内容基本一致。 测定的酶活力值有着高达几十倍的差值。 436 年第期 201110 表4 企业二的木瓜蛋白酶的酶活力结果 酪氨酸质量酪蛋白质量试样质量溶解体积试样酶活酶活均值 方法再次稀释倍数AAA 123 (g)(g)(g)(mL)(u/g)(u/g) 0.384 96980 QN/PB 0.385 97589 0.0502 0.5998 0.9997 250 20 0.232 0.433 99299 01-2009 0.394 103329 7323 0.219 GB/T 0.221 7812 1.0000 1.0650 250 20 0.189 7730 23527-2009 0.222 8056 酸盐，这也是影响最后结果的一个重要原因。半胱氨0.4 酸是一种还原剂，它通过改变蛋白质分子之间和蛋 白质分子内部的二硫键，减弱了蛋白质的结构，这样 0.3 蛋白质就伸展开来，从而使酶分子更易作用于折叠 0.2 的蛋白质肽键，使肽链更易被水解。吸光度A 0.1 结论4 0.0 目前对于动植物组织提取的蛋白酶制剂，国家 GB/T 还没有制定相应的标准，像蛋白酶制剂国标0 10 20 30 40 50 235272009中明确规定该标准不适用于动植物组织 -L-酪氨酸标准溶液的浓度(μg/mL) 图1 酪氨酸溶液的标准曲线 提取的蛋白酶制剂。由于国家还没有制定相应的标 表2 企业一提供的三种木瓜蛋白酶样品按国标测定的 准，就使动植物组织提取的蛋白酶制剂的酶活力测 酶活力结果 定没有依据可循，造成其市场比较混乱。[3] 质量稀释 稀释液酶活 样品的酶 酶活均值关于木瓜蛋白酶活力测定的标准，方焕等人早 吸光度 样品 活力(u/g) (u/g) 倍数力(u/mL) (g) 就已经讨论过，他们比较讨论了木瓜蛋白酶的三种0.608 81.600 8156 活性检测方法，结果表明，以酪蛋白为底物的紫外分 0.607 81.466 8143 1.0005 250 8107 A 光光度法操作简便、成本低廉，适于酶纯化过程中的 0.598 80.254 8021 0.586 78.639 62855 活性比较和木瓜蛋白酶系列产品及国内商品酶的活0.589 79.043 63178 B 1.0009 2000 62855 性测定;以BAEE为底物的光学法反应稳定、重复性 0.583 78.236 62533 好，适于酶学性质的理论研究和出口商品酶的活性 0.286 38.262 91737 0.285 38.128 91416 C 1.0010 6000 91738 测定;以酪蛋白为底物的茚三酮显色法，虽然操作烦 0.287 39.397 92061 琐，但所需仪器简单，测定结果误差较小，非常适用于条件简陋的地区。本文中测定木瓜蛋白酶的活力 表3 企业一提供的三种样品按其企标测定的酶活力结果 均是采用上面的第一种方法，即以酪蛋白为底物的 酶活力值 酶活均值稀释 样品 质量(g) AA 12 倍数 (u/g) (u/g) 紫外分光光度法，正是由于这种方法操作简便、成本 0.367 50016 低廉，当前我国许多关于酶制剂的标准几乎都采用0.369 50464 0.1005 100 0.144 50240 A 的是这种方法。0.368 50239 由于动植物资源有限，工业上生产蛋白酶制剂 0.813 1376875 主要利用枯草杆菌、栖土曲霉等微生物发酵制备，但 0.827 1405320 B 0.1008 1000 0.167 1389200 是像木瓜蛋白酶这样的动植物组织提取的酶制剂也 0.817 1385401 0.744 3211967 占据巨大的市场份额，因此国家有必要制定关于动 0.720 3083702 C 0.1005 2500 0.143 3156742 植物组织提取的蛋白酶制剂的统一标准，以便人们 0.737 3174556 能够在市场更加方便的进行质量检测。参考文献 讨论3 酪蛋白溶液配制方法的影响 3.1 国标中酪蛋白溶液配制完后其pH调节至7.5，而 路英华蛋白酶的研究进展生物科学信息，，,,,[1] ,[J],1991328-10, 企业标准中的酪蛋白溶液是调节pH至6.0。可能是在 [2] 凌 奥 汉 ，吴 显 荣 ,木 瓜 蛋 白酶与番木瓜栽培 [M],北 京 , 中 国 pH为6.0条件下，酶活力较高。农 业 出 版 社 ，1998,107, 3.2 反应条件的影响 [3] 方 焕 ，生 吉 萍 ，吴 显 荣 ,工业生产中木瓜蛋白酶的活性检测 国标中是在加入三氯乙酸后静置10min再进行 方 法 比 较[J],食 品 与 机 械 ，2000,6,27,-29, 过滤，这样蛋白质就基本完全除掉了，而企业标准中 [4] GB/T2352 7-2009中华人民共和国国家标 准 蛋白酶制剂[S], 是加入三氯乙酸混匀后直接进行过滤，可能的结果[5] Q/JWLSW0 1-2007 广西南宁杰沃利生物制品有限公司企 就是蛋白质没有完全沉淀下来，这可能会导致测出 业 标 准 木 瓜 蛋 白 酶[S], 酶活力值较大。[6] Q/NPB01 2009广 西 南 宁庞博生物工程有限公司企业标准 - 3.3 半胱氨酸盐酸盐的作用木 瓜 蛋 白 酶[S], 企业标准中配制的酶缓冲液中含有半胱氨酸盐 437 2011年第10期 file:///C|/Users/Administrator/Desktop/新建文本文档.txt 涵盖各行业最丰富完备的资料文献,最前瞻权威的行业动态,是专业人士的不二选择。 file:///C|/Users/Administrator/Desktop/新建文本文档.txt2012/8/26 12:19:58