胡桃楸树皮对红细胞氧化损伤抑制作用及其活性成分探讨

胡桃楸树皮对红细胞氧化损伤抑制作用及其活性成分探讨 胡桃楸树皮对红细胞氧化损伤抑制作用及 其活性成分探讨 现代预防医学2O07年第34卷第19期ModernPreventiveMedicine,2007,Vo1.34,NO.193685 文章编号:1003—8507(2007)19—3685—03中图分类号:1:1329.26文献标识码:A 胡桃楸树皮对红细胞氧化损伤抑制作用及其 活性成分探讨 杨赛,赵星宇,李娟,王德洁,巨艳红,李静 【论着】 一?摘要:[目的]观察胡桃楸树皮对红细胞自氧化损伤和H202所致的红细胞氧化损伤的抑制作用,同时对活性成分 曩.进行定性分析.[方法]用健康成人静脉血制成l%红细胞悬液,加入不同浓度的胡桃楸树皮提取物,以孵育24h和 HzO2为损伤因素,采用比色法测定红细胞的溶血程度来探讨胡桃楸树皮抑制红细袍氧化损伤的作用.采用化学预示法和 .薄层层析法对胡桃楸树皮活性成分进行分析.[结果]与对照损伤组比较,胡桃楸两种组分的各剂量组都可抑制红细 胞的氧化溶血和H202所致的氧化溶血,并都呈一定的剂效关系.相同浓度不同组分对红细胞的抑制作用相比,组分1 优于组分2胡桃楸树皮活性成分主要是黄酮,皂苷,葸醌,酚类及鞣 质.[结论]胡桃楸树皮提取物能明显抑制红 细胞的氧化损伤;胡桃楸树度含有黄酮,皂苷,葸醌,酚类及鞣质等抗 氧化活性物质. 关键词:胡桃楸;氧化损伤;红细胞;溶血;活性成分 STUDYONTHEINHIBITIVEEFFECToNoXIDATIVEDAMAGESoFREDBLOODCELLS . oFTHEBARKoFJUGLANSMANDSHURICAMAXIMANDITSACTI VECoMPoNENTS YAGsai.ZHA0Xg—yu.Llju.et.(,DepartmentojHealthLaboratory.School0jPublicHealth, JilinUnery’Changchun130021,China) AbstractObjectiveToinvestigateeffectofJuglansMandshuricaMaximBarkonhydroperoxide—inducedoxidation .andauto-oxidationandarmlyse 【heactivecomponentsofantioxidantmaterialsfl’om【heBa1’kofJuglansMandshuricaMaxim. Methods,edifferenlconcentrationsofJuglansMandshuticaMaximBarkwereaddedto,%suspensionofhmuanredblood cells.ThehemolysisofredbloodcellsbyitselfandH202weremeasuredbyeolorimetricassay.Additionally,theac~vecompo— nentsofantioxidantmaterialsfromtheBm.kofJuglansMandshmqcaMaximweledeterminedbythemethodofchemicalantiTLC. 一 Results]ComparedwithCOIlLr0lgroup,bothgroupsofJuglansMandshuficaMaximBarkcouldit~hibit.hydroperoxide—induced oxidationandauto-oxidationofRBC,theeffectofComponent1.wasbetterthanthatofComponent2atthesamedose;【he . componentsofantioxidationresistanceweremainlyflavonoids,saponins,anthraquinones,phenolsandtannis.[Conclusion] |ThebarkofJuglansMandshuricaMaximisabletoit~hibithydroperoxide—i nducedoxidationandauto—oxidationofRBC flavonoids.saponinsanfliraquinones,phenolsandtannisale,containedasantioxidationtesistanceeonlponents. Keywords:JuglansMandshuricaMaxim;OxidativedamageRBC;hemolysis;activecomponents 胡桃楸(JuglansMandshuricaMaxim)为胡桃科胡桃属植物, 别名核桃楸,山核桃.其种子,青果,叶,树皮均可人药…. 胡桃楸树皮简称楸树皮,有清热解毒,抗菌消炎和明目等功效嘲. 国内外均有研究报道,胡桃楸有抑制肿瘤细胞增殖的活性. 迄今,虽对胡桃楸的抗肿瘤活性研究较多,但其抗氧化损伤活 性和抑制红细胞氧化损伤作用的研究尚未见报道.本文采用比 色法测定红细胞溶血程度来探讨胡桃楸树皮抑制红细胞氧化损 伤的活性,观察胡桃楸树皮提取物对氧自由基的消除作.H=I.并 对胡桃楸树皮提取物中活性成分进行了初步鉴定.为开发该药 物提供实验依据. 1与方法 作者简介 通讯作者 作者单位 杨赛(1982一),女,硕士研究生在读,研究方向:天然植 物有效成分及活性研究 李静,E—mail:l_jlu.edu.cn 1.吉林大学公共卫生学院卫生检验教研室.长春.130021; 2.吉林大学第一临床医学院临床医学一系 1.1胡桃楸树皮的来源与提取 野生胡桃楸树皮于2005年秋采自吉林省通化地区.白然 阴干.提取方法:胡桃楸树皮经荫干粉碎后称1000g,水煎 煮3次,大孑L树脂交换法得50%乙醇提取物(JME).此提取 物又分为州部分,其中溶于水的部分为组分l(JME1),不溶 于水的部分为组分2(JME2). 1.2实验用血 健康成人静脉血,肝素抗凝. 1.3测定分析方法l,0J 1-3.1红细胞悬液的制备取健康成人静脉血.肝素抗凝川 pH7.4的PBS(含磷般盐5.0lllnloI/L和氯化钠0.15mol/L)冲 洗,离心3次l7】.1500r/min,离心10nlin.然后JL}j上述PBS 屺成1%红细胞悬液 1-3.2胡桃楸两种组分对红细胞自氧化溶血的影响取红细胞 悬液3I111.加入_}_H上述PBS配制的含有不浓度的胡桃楸提 取物200(JME1,终浓度分别为0.2nqg/ml,0.1mg/ml, 0.05ing/?lJ,0.02mg/ml.JME2}_}j二甲基砜与上述PBS适 比例作为溶剂配制,终浓度分别为0.1rag/nil,0.05nlg/ml, ? 3686?现代预防医学2007年第34卷第19期M()’ler【lPIeventiveMedic_ne. 2007Vo1.34,NO.19 0.025mg/ml,0.01Illml.以下实验同),以PBS组为对照 损伤组.37cc温育24h后,1500r/rain.离心10nfin.425 Din处测定各管吸光度,以对照损伤组为100%溶血.计算溶血 度.每次实验设3个平行管且重复3次.(以下实验同) 1.3.3胡桃楸两种组分对H10:所致红细胞氧化溶血的影响 取上述红细胞悬液3rnl,加入上述提取物,,以PBS代替提取 物为对照损伤组,每管各加入H:O!(终浓度为1%),时设 正常红细胞组,加PBS不_』JI】H01,37?温育1h后,1500r/ inln,离心10illln.425nnl处测定每管吸光度,以对照损伤组 为100%溶血.以正常红细胞组为空白,计算溶血度. 1.4提取物活性成分分析Ls] 按照化学预示法,分别用浓盐酸一镁粉,饱和醋酸铅.5% 醋酸镁,1%FeCI等与提取物进行反应,观察颜色变化.泡沫 试验,观察泡沫消退的时问.时进行薄层层析,根据层析斑 点所显示的颜色判别化合物类别:蒽醌类化合物(硅胶G,展 开_齐IJ为氯仿,乙酸乙酯一乙酸4:1:0.2,醋酸镁显色):黄酮 类化合物(硅胶G,展开剂为氯仿一甲醇8.3:1.7,1%FeCI显 色);鞣质及酚类化合物(硅胶G,展开剂为苯一乙酸乙酯一甲 酸75:24:1,1%FeCI显色);皂苷类化合物(硅胶G,展开 剂为正丁醇一酣酸一水3:3:1,浓硫酸显色). 1.5数据分析 实验数据采用Microsoft0fficeExcel2003进行统计描述 相关分析,单凶素方差分析和t检验. 2结果 2.1胡桃楸两种组分对红细胞自氧化溶血的抑制作用 红细胞经温育24h,可出现明显的溶血现象,胡桃楸两种 组分的各剂量组都可抑制红细胞的自氧化溶血,并呈一定的剂 效关系.经方差分析.两种组分各剂量组与对照损伤组比较, 差异有统计意义(F=2435.7,P<O.(】1).经两样本t检验分 析,两种组分相浓度提取物的红细胞溶血度比较,差异有统 计意义(t=一6.77,t=一58.19.P<O.O1),且组分1的溶血度 明显低于组分2.见1. 表I胡桃楸两种组分对红细胞自氧化溶血的抑制作用(?s) [注]两种组分各浓度与对照组比较尸<O.O1,相侧浓度不同组分比较 尸<0.O1.’<0.01 2.2胡桃楸两种组分对H0,所致红细胞溶血的抑制作用 H,0具有很强的氧化性,体系可出现明显的溶血现象, 胡桃楸两种组分的各剂量组都可抑制H:0所致的红细胞氧化 溶血.并呈一定的刺效关系.经方差分析,两种组分各剂量组 与对照损伤组比较.差异有统计意义(F=263.15,P<0.01). 经两样本t检验分析.两种组分相同浓度提取物的红细胞溶血 度比较,差异有统计意义(t=152.97,t=55.27,P<O.O1) 且组分1的溶血度明显低于组分2.见表2.. 表2胡桃楸两种组分对H!O:所致红细胞溶血的 抑制作用(?) [注]两种组分各浓度与对照纽比较,J(001,$tfl,~l浓度不同分比较 尸(0.O1.<0.O1 2.3胡桃楸树皮提取物成分定性结果 为了初步探讨胡桃愀树皮乙醇提取物的有效成分.采H{化 学预示法和薄层层析法进行定.结显示:浓盐酸镁粉沸水 浴l』JI1热显红色.层层析显深黄色,说明富含黄酮.酣酸镁』JI】 人试液显橙色,薄层层析显橙色,说明含有总醌类化合物.泡 沫试验现象是泡沫持久不退及薄层层析显示粉红色.证明苷 的存在.1%FeCIl』JI]人试液中显深蠕色.薄层层析显示蓝色, 证明酚类和鞣质的存在. 3讨论 大量研究表明,在常生理情况下,机体代谢过程巾产生 自由基,其产生和消除处于动态平衡.但住病理状态和衰老情 况下,其产生和消除的平衡破打破,人体自由基产生过多或消 除过少.都对机体造成氧化损伤[9.t0,引起各种炎症,老年性 白内障,动脉粥样硬化,老年性痴呆,衰老等.此,筛选具 有清除氧白由基和抗脂质过氧化』/J能的有效药物十分必要. 本实验结果显示.胡桃锹两种组分_Jju入红细胞怂液中都l1I 明显抑制红细胞的白氧化和H:01所致的红细胞氧化溶血,行 都随加入剂量的增加,抑制作用加强两种组分相浓度比 较.组分l抑制溶血作川优于组分2.对胡桃楸树皮活性成分 鉴定的结果显示.胡桃楸提取物活性成分主要是黄刖,皂什, 蒽醌,酚类及鞣质.这都证明,胡桃楸树皮乙醇提取物具有显 着清除氧自由基和抗脂质过氧化的活性.胡桃楸为野生值物, 资源丰富其树皮,羽状复叶,果实及果实外果皮都有很高的 药.I+j价值和经济价值,本实验研究结为升发和利川胡桃楸这 种天然植物,研究抗衰老的新型巾药提fJL实验伙. 参考文献: f1【朱有昌.东北药用植物lM].黑龙汀省:黑龙汀科技H1版社, 1989.207-209. I_21石建辉,王金辉,车东,等.胡桃楸树皮化学成分研究lJj.I|药 研究与信息,2005,7(】):7-8. 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P<0.05);无应答者与HLA—B62表型呈负相关(P<0.05). 由此可见,免疫应答基随地域,人种的不同而存在着差异. 4机体免疫状况 最初人们发现淋巴细胞记数可提示是否产生抗一HBs.当 淋巴细胞<1300/ram时不太可能产生抗体.有学者观察了健 康人群乙肝疫苗接种前后CD?CD,CD及CDCD的变化, 发现,CD比例3次免疫后均较免疫前增高,证实机体接种乙 肝疫苗后T淋巴细胞彼激活,分化,增殖:并且免疫前的CD 在抗体阳转者高于不出现抗体者.提示T细胞数偏低呵能影响 抗体的产生lI.近来有学者将乙肝疫苗接种后无应答的研究投 向了引起免疫耐受的信号系统.T细胞在接受特异性抗原信号 的同时,必须接受抗原呈递细胞表面的协刺激信号.才能被 活化,否则易形成免疫耐受.协同刺激分子B(CD,CD) 及其配体CD结合是特异性免疫应答发生的重要因素.黄茵ll7 等研究发现,细胞免疫功能正常的乙肝疫莳尤,弱应答者.其 IL—l2和IL一10分泌低下,协同刺激分子CD,和CD表达不 足.研究发现IL一2具有免疫佐刺效应.可增强特异性抗原的 免疫原性和主对抗原的反应性[t82.核细胞分泌IL一2水平 下降可能是乙肝疫苗接种后尤,弱应答发生的原和机制之 一 .谢姑_I9等对乙肝疫苗接种后无,弱应答者外周血单个核细 胞(PBMC)培养上消液以白细胞介索,2(IL一2)及其可溶性 受体(slL一2R)水平进行了测定.尤,弱应答组的IL一2活性 水平不仅明显低于』E常者,而且尢,弱应答者IL一2活性与抗一 HB8含量呈相关关系. 由于以上诸多原,使尢,弱应答者的疫苗接种得不到较 理想的结果.有研究表明复种虽可使部分无,弱应答者的抗一 HBs水平有所提高,短期内获的抗体滴度与应答良好者无较 大差异,但持久性还尚无定论l8].再接种的方法能不能有效的 提高乙肝疫苗无,弱应答者的抗体水平.怎样才能提高无,弱 应答抗一HBs的水平,还有待进,步的研究. 参考文献: [1]陈敏,陈清,陈思东,等.乙肝疫苗免疫无(弱)应答影响的因 素的分析[J].J东药学院,2003,19(2):173—175. [2]王永忠.乙肝疫苗免疫失败儿童病毒S基”a”决定簇变异研 究[J].中国优生与遗传杂志,2003,11(4):29—30. 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