水溶性高良姜素精氨酸酯的制备研究-临床医学论文

水溶性高良姜素精氨酸酯的制备研究-临床医学论文 作者:符伟玉，张建和，罗辉，佘戟，梁念慈 【关键词】高良姜素;,,L 摘要:目的制备水溶性高良姜素衍生物，提高高良姜素的生物利 用度。方法采用过量的L精氨酸与高良姜素在乙醇中回流反应，反应 混合物经柱层析分离纯化，得3个水溶性化合物B，C，D。结果经 TLC，UV，IR谱初步分析，确定B，C，D分别为:高良姜素一精氨 酸酯、高良姜素二精氨酸酯、高良姜素三精氨酸酯。高良姜素，B， C，D抑制红白血病K562细胞生长的IC50(μg/ml)值分别为:26.2， 40.4，47.9，60.5。结论此高良姜素水溶性衍生物的制备反应为一酯 化过程;但高良姜素结构中羟基封闭不利于其生物活性的保持。 关键词:高良姜素;L精氨酸;水溶性衍生物;K562细胞 StudyonPreparationoftheWaterSolubleGalangin-arginineEster Abstract: ObjectiveTopreparethewatersolubtegalanginargininederivativeandimprovethebioavailabilityofgalangin(Ga).MethodsOverdoslyLarginineandGawererefluxedinalcohol.ReactioncompoundswereisolatedonsilicagelcolumnchromatographyandthEirstructureswereidentifiedbyspectralandchemicalanalysis.ResultsThreewatersolubecompoundswereisolatedandidentifiedasgalanginmonoargininate(B),galangindiargininate(C)andgalangin-triargininate(D).Ga,B,CandDinhibitedthegrowthoferythroleukoemiaK562cells,andtheinhibitedIC50(μg/ml)valueswere26.2,40.4,47.9and60.5.ConclusionTheabovepreparationofthewatersolubleGalanginargininederivativewereesterificat ionprocess,buttheblockingofHydroxylinGastructurewasdisadvantageousto keepitsbioavailability. Keywords:Galangin;Larginine;Watersolublederivative;K562Cell 高良姜Alpiniaofficanorum是南方广泛种植的一类药用植物,1,。高良姜素(galangin)属黄酮类化合物，是高良姜的主要成分之一，同时也存在于多种植物体中。高良姜素明显的抗癌、抗氧化、抗病毒、抗致畸等作用日益得到关注,2,，但与大多数的黄酮类苷元相似，高良姜素几乎不溶于水，限制了给药途径，影响其在体内的吸收和代谢,3,。为了拓宽高良姜素的临床用途，提高其生物利用度，本研究组尝试通过高良姜素与精氨酸结合制备水溶性的药物前体,4，5,，就制备工艺、产物的结构以及衍生物对癌细胞的抑制作用进行了初步的探讨。 1仪器与材料 1.1仪器Lambds 2s型紫外/可见光谱仪(PE公司);175C/UMA500型显微红外光谱仪(BioRAD公司);852型恒温磁力搅拌器(深圳天南海北有限公司);CO2孵箱(Precision);IS6000型液闪记数仪(Beckman)。 1.2材料 高良姜素按文献,1,提取纯化;L-精氨酸(上海丽珠东风生物技术有限公司);薄层层析用硅胶GF254(青岛海洋化工厂);柱层析用200~300目硅胶(青岛海洋化工厂);其它试剂均为分析纯。 2方法与结果 2.1高良姜素精氨酸酯的制备高良姜素121.1mg(0.448mmol)，微温下完全溶于40ml无水乙醇中，然后加入L精氨酸470mg(2.7mmol)，搅拌下，滴加pH=10~11的Na2CO3溶液，将反应系统调至pH=8左右，加热搅拌回流48h，TLC监测反应进程。反应结束后，减压除去溶剂至干，再加入经干燥处理的无水乙醇溶解，减压过滤，滤液浓缩至小体积，经200~300目硅胶柱层析分离。 2.1.1经石油醚?醋酸乙酯=5?1?1?1梯度洗脱，得难溶于水的化合物A:34.9mg;Rf=0.86(展开剂:石油醚?醋酸乙酯=2?1)，高良姜素的Rf=0.86;显色:紫红色(FeCl3);黄绿荧光(AlCl3，紫外灯);橙红色(2.4二硝基苯肼)。 2.1.2经醋酸乙酯?甲醇=5?1?1?1梯度洗脱，得可溶于水的化合物B:52.7mg;Rf=0.67(展开剂:醋酸乙酯?甲醇=8.5?1);显色:紫红色(FeCl3);黄绿荧光(AlCl3，紫外灯);橙红色(2.4二硝基苯肼)。 2.1.3经醋酸乙酯?甲醇=2?1洗脱，得易溶于水的化合物C:111.7mg;Rf=0.22(展开剂:醋酸乙酯/甲醇=2?1);显色:紫红色(FeCl3);黄绿荧光(AlCl3，紫外灯);橙红色(2.4二硝基苯肼)。 2.1.4经醋酸乙酯?甲醇=1?1?1?5梯度洗脱，得易溶于水的化合物D:55.0mg;Rf=0.22(展开剂:为醋酸乙酯/甲醇=1?5);显色:无色(FeCl3);浅黄荧光(AlCl3，紫外灯);橙红色(2.4二硝基苯肼)。 2.2高良姜素、A、B、C、D的紫外吸收谱(见图1)及λMeOHmax(见表1)和红外吸收谱(见图2)得到测定。 2.3对红白血病K562细胞生长的抑制作用采用MTT法观察高良姜素、B、C、D分别在48h对K562细胞生长的抑制作用。各样品用DMSO配成原液，超声震荡。各药物临用前用对应溶剂稀释至所需浓度，煮沸30min灭菌。处理细胞时，DMSO的终浓度小于或等于0.1%，实验表明该浓度对细胞无影响。 取对数生长期的K562细胞1.0×105/ml，加入24孔板。每孔1ml，用药组分别加入相当于各样品:5，10，20，40，80μg/ml的各溶液1μl，对照组只加入1μlDMSO，每组均设3个平行孔，设好空白对照孔。加药的细胞于37?、5%CO2的饱和湿度孵箱中培养48h后，用台盼蓝拒染法并在倒置显微镜下进行活细胞计数。计算各药物对细胞的抑制率，并按改良Karber该上公式计算得高良姜素、B、C、D的IC50(μg/ml)值分别为:26.2，40.4，47.9，60.5。 3讨论 3.1由TLC、UV、IR的数据可以确定，A与高良姜素为同一化合物。在IR谱上，B、C、D在1126cm1、1060cm1明显的双峰，表明酯键的存在;而3300cm1的N+-H强吸收宽峰、2934cm1的N+H2特征峰和1650cm1、1576cm1的gN+H特征峰存在，则应表明B、C、D结构中NH2处于游离状态。高良姜素、B、C、D的TLC的Rf值说明，高良姜素、B、C、D的极性是依次增强的，显示高良姜素与精氨酸结合的信息,6,。结合B、C、D的TLC斑点的显色情况和各 自的紫外吸收曲线，B、C、D的仍具备黄酮类化合物的典型结构。但与高良姜素的λMeOHmax:265nm、363nm比较，B、C的λMeOHmax值明显向短波收缩，D的最大吸收峰几不可见，这种现象与高良姜素上的羟基部分或全部被酰化有关,7,。我们认为，通过滴加Na2CO3溶液调节反应系统至弱碱性，不仅提高了高良姜素上羟基的活性，同时这碱性环境可能也有利于精氨酸与高良姜素的酯化，而不是生成精氨酸铵盐类的复合物。由TLC、UV、IR的数据可以初步确定B、C、D分别为:高良姜素一精氨酸酯、高良姜素二精氨酸酯和高良姜素三精氨酸酯。进一步的结构分析有待进行。 3.2在制备工艺的选择中，当高良姜素与精氨酸的投料摩尔比为1?1时，产物较单纯，但产率低，实用价值不大。通过高良姜素与过量的精氨酸反应，产物比较复杂，但通过分离纯化后，得到了3种水溶性的高良姜素衍生物，以此可以研究不同的羟基被封闭后的性质，并且产率得到较好的提高。增加Na2CO3溶液的滴加量，提高反应系统的pH值，可以提高反应速度，但也可能导致黄酮环的破裂。 3.3对红白血病K562细胞生长的抑制作用显示，3种水溶性的高良姜素衍生物B、C、D仍具有抑制K562细胞生长的作用，但与高良姜素相比，IC50值呈倍数增加。表明当高良姜素上羟基逐渐被封闭后，其抑制K562细胞生长的活性也随之降低，这说明高良姜素上各羟基的存在是其保持生物活性的必需。因此，为改善高良姜素理化性质的任何结构上的改造，应尽量避免封闭其结构中游离的羟基。 参考文献: ,1,罗辉，蔡春，张建和，等.高良姜化学成分研究,J,.中药材，1998，21(7):349. ,2,何瑞，王涛，李彩君，等.天然化学成分高良姜素研究进展,J,.时珍国药研究，1999，10(10):788. ,3,赵维中，戴利明，方明，等.槲皮素在兔体内的药代动力学,J,.中国药理学报，1992，8(6):452. ,4,郑惠珍，唐朝枢.L精氨酸的跨膜转运及临床意义,C,.国外医学生理、病理科学与临床分册，1999，19(6):475. ,5,符伟玉，佘戟，莫丽儿，等.槲皮素精氨酸复合物的制备研究,J,.中草药，2002，33(8):695. ,6,佘戟，陈杰，莫丽儿，等.胶束纸色谱分离和鉴定黄酮类化合物,J,.广东医学院学报，1999，17(2):102. ,7,K.R,马卡姆.黄酮类化合物结构鉴定技术，第1版,M,.北京:科学出版社，1990:44.