人乳头瘤病毒DNA相关序列与p53基因突变对大肠癌生物学行为

人乳头瘤病毒DNA相关序列与p53基因突变对大肠癌生物学行为 人乳头瘤病毒DNA相关序列与p53基因突 变对大肠癌生物学行为 一 7中华普通外科杂志1999年7月第14卷第4期ChinJGenSure,lulY1999,Vo[14.No4?267? 直肠外科. 人乳头瘤病毒DNA相关序列与p53基因突变 对大肠癌生物学行为的影响50例乃3,/- o.z 4 李世拥于波安萍梁振家苑,N-J~马怡红邓永江 【摘要】目的探讨^乳头瘤病毒(nl'V)I~NA相关序列与p53基因突变及p53蛋白表达的关系 及其对大肠癌生物学行为的影响:方法采用PCR方法检测大肠癌及癌旁组织,肝转移灶中HPV DNA相关序列.并应用PCR-SSCP及免疫组化技术分别检测p53基因突变及p53蛋白表达.结果 在50例大肠癌中,控出tll~'16,18DNA相关序列26例(52.0%),其中HPV16DNA4例(8.0%),ItF~18 DNA22例(440%).p53基因突变率为560%:p53蛋白表达阳性率为42.0%.}?lvDNA相关序列 与p53基因突变及p53蛋白表达呈正比关系.结论}DNA相关序列可促进细胞转化,致p53基 因突变,抑制细胞的凋亡.与大肠癌的发生发展有密切关系. 【关键词】结肠直肠肿瘤乳头状瘤病毒.人基因,o53大肠怕 Detection0fIltlDrnan呻问h瑚vin骂Mnlatetlsequenc~p53genenmmllon-meolol,eet~c 日岫-哪 theirrelanotlsl~啪~ltllcel-ollsM0Io画咖behavior:areoort0f50c麟Shiyong,?Bo, 嘈,et啦?mofGenera/Sto'gery,Borg心地AreaGenera/Hosp/ta/,/~/j/.g1O[不? 【Al埘rt】Objeea,~Tostudytherelationshipbetweenhumanpapillcanavirtts(})1)NArelatedse- quencesandp53mutton'盯eol~ralcnr啪且ndto8ub枷atetheireffee~onc既娜bi0l0be_ havior.M甜10ds}??DNArelatedseqI】erleeswe工edetectedbyusingPCR_盯eol~ralca础0"m,adiem n0r.can娌Toustissuesand}砣patic?ebsta吕is.p53即enml~onsincoloreetalcaf?cerw 町earIa】vsedbyPCR-ssCP, D53proteinsw雠als0exa?曲 edwith1/rffnunohistoehemicalmethod.RIHPvl6DMdetectedin4 ca鲫(80%)andHP,r181)NAin22?s(440%).28Ca,g~lhadp53muttons(56.0%).p53proteinwa直 detee~clin21eases(42.0%).皿1)NArelated8棚嘲~etly刚0I1aItop53ger.emutationand p53I~tein髓pre鼬ion.0加dI帅}??18D3,ArelatedseqI1衄ceisas00cia埘ll1thegenesisandpmgre~ 0fedon~tal?pmm~ngcell岫J1sh0n,causingp53get~emuttonarIdinhibiting印0呻is. 【_wonb】C0kI_ene0das帽Papill0咐n,human(1栅es.口53 人乳头状瘤病毒(ttPV)感染是上皮性肿瘤发生 的一个重要原因.而HPV感染及ttPV亚型DNA相 关序列与大肠癌的关系报道不一_]J.我们应用 PcR,PcR-sscP及免疫组化技术检测大肠癌ttPV16, l8型DNA相关序列及p53基因突变,口53蛋白的表 达,探讨?)vDNA与p53的关系及对大肠癌生物学 行为的影响. 资料与方法 l+一般资料:我院1996年8月至1997年10月 大肠癌病例50例.其中男23例,女27例.年龄26, 85岁,平均56.4岁.均行手术治疗,经病理组织学 证实 作者单位:1(1~7110北京军区兽医院普外科 2.DNA提取:取新鲜大肠癌原发灶,癌旁组织, 肝转移灶组织,另距原发灶10cm处取肠粘膜组织 作为正常对照.采用酚.氯仿法提取基因组DNA. 3.at~~T检测:采用PeR方法.?,v晚期区共同 引物扩增片段为446bp.HIW16,l8早期区特异引 物,其扩增片段分别为203bp,244bp(以上引物均由 京师生物技术公司合成). 4.p53基因突变检测:采用PCR.SSCP方法.p53 基因第56,7,8,9外显子引物(均由京师生物工程 技术公司合成),其扩增片段分别为l8lbp,201bD, 171b口,204bp,185bp.PCR产物经热变性后上样于 8%聚丙烯酰胺凝胶,电泳后行银染,显色,观察异常 条带 5.p53蛋白检测:采用LSAB法染色.用已知阳 性切片作为阳性对照,以正常羊血清代替一抗作阴 1999年7月第l4卷第4期ChinJGe?Sure.1999.Vol14.No4 性对照. 6.统计学处理:组问计数资料采用R×C表进行 Y枪骑…一 结果 1在50例大肠癌中,应用HPV共同引物未检出 HPVDNA.而应用HPV16,18特异性引物,在原发灶 中检出有HPV16,18DNA相关序列者26例(26/50, 52.0%)其中HPv16DNA4例(4/50,80%),HPV 18DNA22例(22/50,44.0%).两者检出率差异非 常显着(P<0.01).在癌旁组织中检出有HPVDNA 者8例(8/50,160%).在正常对照肠粘膜组织中 未检出HPVDNA相关序列.原发灶组织中HPV DNA检出率高于癌旁组织及对照肠粘膜组织(P< 001)在12例肝转移病灶中检出有HPV18DNA 相序列者7例(7/12,58.3%).HPV18,16DNA相 茭序列住不同病变部位的检出率无显着差异. 2.应用PCR.SSCP方法,共检出有u53基因突变 者28例(28/50,56.0%).其中第5外显子突变3 例,第6外显子突变4例,第7外显子突变6例,第8 外显子突变l3例,第9外显子突变2例.第8外显 子突变率较高(P<0.05).免疫组化检测p53蛋白 表达阳性者21例(21/50,420%).在28例有p53 摹因突变中,p53蛋白表达阳性者16例(16/28, 571%)在22例无p53基因突变中,p53蛋白表达 阳性者5例(5/22,227%).两者差异有显着意义 (P<005). 3.HPv18,16DNA,p53基因突变及p53蛋白表达 在不同临床分期及病理组织学类型中的检测情况 t表1)在不同分期及不同组织学类型中HPV18, 16DNA相关序列检出率差异无显着意义(P>005) p53基因突变率的差异有显着意义(P<0.05).在 有淋巴结,肝转移者及癌细胞分化程度较低者p53 基突变率较高.但p53蛋白表达阳性率差异无显 着意义(P>0.05)在26例HPV18,16DNA阳性者 中,出现D53基因突变者19例(19/26,731%),p53 表1大肠癌50例}vDNA,3基固突变及 O53蛋白表达检测情况(例) 蛋白表达阳性者15例(15/26,577%)而在 HPV18,16DNA阴性的24例中,有p53基因突变者9 例(9/24,375%),t63蛋白表达阳性者6例(6,24, 250%)两组中p53基因突变率及p53蛋白表达阳 性率差异均有显着意义(P<0.05). 讨论 HPv是一组亲皮肤和粘膜上皮的病毒,主要感 染人的生殖系统和皮肤,粘膜,导致良性和恶性肿 瘤.目前已知HPV有60余型.HP'v感染,特别是 16和18型DNA相关序列作为一种病毒致癌基 因与肿瘤发生之问的关系已Bl起人们的重视.已发 现HPVDNA与宫颈癌,皮肤癌,口腔癌,肺癌,食管 癌有关.在上述癌组织中常有H1)v16,18DNA相关 序列存在,以HPV16DNA多见J大多数乳头瘤病 毒只有单一的宿主,且只在分化的上皮或粘膜内一 定的解剖部位才能生长.我们对50例大肠癌检测 结果显示,病灶内HI?V18DNA检测阳性率明显高于 HPv16DNA而正常对照肠粘膜中未检出相应的 HPVDNA相关序列.表明v18与大肠癌的发 生,发展较之16更为密切也说明HPV不同 亚型之间具有明显的宿主组织特异性.HPV16既 可在粘膜中发现,也可在皮肤病灶中发现,但多见于 病毒阳性的鳞状细胞癌.而HPV18主要见于病毒 阳性的腺癌. HPV是一类DNA肿瘤病毒,DNA长度为7.9 lcb,全部的开放读码框架均由1条DNA链编码.全 部基因组可分为早期区(约4.5kb)及晚期区(约2.5 kb).早期区又分为E_.ER不同开放读码框架,与细 胞转化功能有关.晚期区分为La,k区,编码病毒 衣壳.一般认为HPVDNA是以游离形式存在于良 性或癌前期组织中我们应用HPV不同型别的共 同引物扩增病毒晚期区保守序列来检测HPV16,18 均为阴性.而将引物选择在与细胞转化相关的早期 区,E7框内,则检测出了HPY18,16DNA相关序 列表明HPV18,16DNA在大肠癌的整合是发生在 E区.有E6,区整合掺人宿主基因中.E6,E7的启 动子受E,基因抑制,当HPVDNA片段缺失或断裂 后,失去完整性,E6,E7表达增强,其蛋白产物有促 进细胞转化功能,使转化细胞获得"永生".因此, HPv18,16有凋亡抑制作用,其所致细胞恶变不是由 于影响细胞的增殖,而是抑制了细胞的捅亡. p53基因参与细胞增殖周期的调节,在DNA损 h 中华普通外科杂志1999年7月第l4卷第4期ChinJc啪,July1999,州14,?.4 伤反应及DNA复制中亦起重要作用HPVDNA经 可致D53基 插入方式整合到人染色体的某些位点, 因突变突变的p53抑癌活性丧失,而且出现促恶 性转化活性.本实验结果表明,HPV18,16DNA相关 序列与3基因突变呈正比关系在l2例肝转移 病例中,有7例在大肠癌原发及转移灶中检出}v l8DI~'A相关序列.在有D53基因突变及ttPV18, 16DNA阳性者中,n53蛋白表达阳性率较高而在 无p53基因突变但有ttPV18,16DNA者,p53蛋白表 达阳性率较低.原因是HPV18,16E6蛋白与D53蛋 白结合,可使野生型p53蛋白降解.?)vR蛋白与 p53蛋白结合抑制其负性调控作用.ttPVI8E6除可 抑制3蛋白结合至其DNA识别序列外,还可使已 结合的口53与DNA解离L4J.因此,mJV他较之 脚Jvl6具有更强的对抗p53及抑制细胞凋亡的作 用.组织学检查表明,在有ttPV18感染者,其癌组 织病灶的坏死程度较轻因此HPV18对大肠癌恶 269 性进展的影响也是通过减少癌细胞的凋亡所致. 由于ttPVl8通过抑制细胞凋亡引起细胞的恶 性转化及影响大肠癌的恶性进展,同时ItP~'-DNA插 入基因组可致口53基因突变.因此,对大肠内可疑 病灶行组织活检,检测HPVl8DNA相关序列及p53 基因突变,有助于监测病变进展并发现早期癌变. 参考文献 l0lengJY.Shet,IF.ng?,etalDeteti~nofpapillomavims DMinceccarcino~bv?chainreacti~.1995 37:87-90 2SchroyerKKimJ,M~LrlosM.etPapi/Joma~alsfauadin,moreetal squamouscarcinoma,nolin.onadetloc??mmArchSm'g,1992. 127:741—.. 3PmMM,DunneJ,HoganG.etalHu嘶papilloma~Srmt, ~Te16and l8sen嘲inearlycervicalneoplasia.Viro|oK'~,1986,155:13一l8. 4拙]dBT,PB出M.JmJ,咀.HP—l8E6?eddI帆d p53I)NAbindingaeti~tyisindepen~tofE61rLdLIc.|de日Ii帆 ODe%,en.1995.10:261.鹋 (收稿:l998m20修回:1998~4)5) (本文编辑:自文英) 胰母细胞瘤一例 高毅扬继震 胰母细胞瘤罕见,1997年3月我院 发现一侧. 一 ,临床资料 患者男性,4o岁.因巩膜,皮肤黄染 1个月人院.体检:巩膜,皮肤重度黄 染,右上腹可触及肿大胆囊,右肋缘下可 触及肝脏,质中,无结节.血清总胆红素 159,,~ol/L,直接胆红素120?L,GT 310IU/L,AKP271IU/L,AFP50, umol/L, 尿胆红素(+++).B型超声和示 胆囊体积明显增大,肝内,外胆管扩张, 胰头部近十二指肠侧3.6em×2.9咖等 回声包块,胆总营下段梗阻:纤维十二 指肠镜:十二指肠乳头口见约3.0cmx 4.0cm肿块,紫红色.表面糜烂,触之易 出血,活体组织检查为低分化腺癌.术 前诊断为壶腹部癌.术中见肝左叶2个 实性肿块,分别约为30廿力×2.0cm,20 作者单位~510'282广州,第一军医大学珠 江医院普通外科 cmx20cm大小,质中;十二指肠降段内 侧壁触及约5O椰lx4.0cmx3.0啪的 肿物,质硬,与胰头相连无明显分界肝 十二指肠韧带和胰周围可见明显肿大的 淋巴结多个,质硬:行胰头十二指肠切 除术,左肝部分切除术.术后病理报告: 十二指肠降段内侧见50唧x3.0cm× 30cm肿物,与胰腺组织相连;肝肿块切 面见多个黄豆至蚕豆大小的灰白色结 节.镜检:十二指肠,肝脏,胰头均见肿 瘤组织,瘤组织由上皮成分和间叶成分 组成.内见条索状腺样结构,以及棱形细 胞纵状和交错排列的鳞状小体,瘤细胞 异形,部分坏死.免疫组织化学染色检 查结果:Ck(+),Vim(+),c肾A(+), Res(+),EMA(+).病理诊晰:胰母细 胞瘤,侵及十二指肠并肝转移.术后恢 复顺利,12天带T管出院,拒绝化学药 物治疗和放射治疗,术后4个月死亡: 二,讨论 Panereatalala.~nm,PB) 胰母细胞瘤( . 病例报告 约占胰腺非内分泌性肿瘤的0.16%,可 发生于胰腺各个部位,以胰头部最为常 见,肿瘤多有完整包膜,部分病例表现为 分叶状,瘤组织与人胚胎第八周的胰腺 组织相似,主要由上皮成分和间叶成分 构成,上皮细胞排列成巢,由棱形细胞巢 构成的鳞状小体是PB特异性组织病理 特征之一.免疫组织化学研究显示,PB 组织同时表现为腺样分化,内分泌分化 和腺管分化的特征,表明瘤组织由多源 性细胞成分组成.事例胰头肿瘤的病理 特点符合PB的特征【. 根治性切除术是主要的治疗方法, 化学药物治疗和放射治疗有一定疗 效. 参考文献 1KLDS.WrIg删,Adair岱,etPan- 叫目【珊}ad_mk叩岫cstudyand Dftheb【.AmJP~ho!, 1995.19:I37I-1389+ (收稿:1997439.D1修回:1997.10-18) (本文编辑:薛雷,高健)