下肢Buerger病患者腰交感神经节神经元TH和DBH的表达

下肢Buerger病患者腰交感神经节神经元TH和DBH的达 下肢Buerger病患者腰交感神经节神经元TH和DBH的表达 作者: 李德卫，赵渝，洪云，时德 【关键词】 ,血栓性脉管炎 Expression of tyrosine hydroxylase and dopamine beta hydroxylase in lumbar sympathetic ganglia neurons in patients with Buerger disease of lower limb 【Abstract】 AIM: To observe the expression of tyrosine hydroxylase (TH) and dopamine beta hydroxylase (DBH) in the lumbar sympathetic ganglia neurons of the patients with Buerger disease of lower limb. METHODS: The lumbar sympathetic ganglia was sampled in 14 patients with Buerger disease and the expressions of TH and DBH in the neurons in lumbar sympathetic ganglia were observed by immunohistochemical staining. Eleven nonBuerger disease patients served as controls. RESULTS: The TH and DBH expressions in the neurons in lumbar sympathetic ganglia in the patients with Buerger disease were higher than those in the control group. CONCLUSION: The lumbar sympathetic ganglia plays an important role in the development of Buerger disease. The enhanced expressions of TH and DBH may result in vasospasm, which accelerates the development of Buerger disease. 【Keywords】 thromboangiitis obliterans; ganglia, sympathetic; tyrosine 3monooxygenase 【摘要】 目的: 研究下肢Buerger病患者腰交感神经节神经元中去甲肾上腺素合成酶酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)和多巴胺β羟化酶(dopamine beta hydroxylase, DBH)的表达变化. 方法: 采用免疫组织化学SP法检测14例Buerger病患者腰交感神经节内神经元中TH和DBH的表达水平，11例非Buerger病患者腰交感神经节作为对照. 结果: Buerger病患者腰交感神经节神经元内TH和DBH的表达有高于正常人的总体趋势，差异具有统计学意义(P0.01和P0.05). 结论: Buerger病患者腰交感神经节神经元TH和DBH表达增强，可使血管 血栓闭塞性脉管炎(thromboangiitis obliterans, TAO)即Buerger病，是一种特发的非动脉粥样硬化性、节段性、阻塞性血管疾病，主要累及肢体中小动脉和静脉，尤以下肢最多见. TAO的发病机制复杂，除公认的吸烟因素外，至今病因和病理机制不明,1,. 对TAO的治疗方法较多，基于血管痉挛是本病的病理生理学特点之一,2,，治疗上提出了腰交感神经节切除术，以缓解血管痉挛，促进侧枝循环形成，临床报道其近期疗效较好,3,，这是否也一定程度上证明了Buerger病血管痉挛因素的存在. 支配四肢中小血管运动的主要是来自于交感神经节的交感缩血管纤维，神经递质为去甲肾上腺素(noradrenaline, NA)，酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)和多巴胺β羟化酶(dopamine beta hydroxylase, DBH)，是其合成过程中的重要酶类，其中TH是NA合成过程中的限速酶,4,. 我们运用免疫组化方法，观察下肢 Buerger病患者腰交感神经节神经元内TH和DBH的表达变化，并探讨其发病机制和临床意义. 1对象和方法1对象 201706/ 201706我院行腰交感神经节切除术的TAO患者14例，均为男性，年龄27,45(平均35.6)岁. TAO的诊断: ? 吸烟史，45岁以前发病; ? 患肢有动脉缺血症状; ? 患肢足背动脉或胫后动脉搏动减弱或消失; ? 缺乏动脉粥样硬化的危险因素(吸烟除外); ? 动脉造影符合TAO的典型X线征象;? 患肢血管病理检查确诊. 另外收集11例正常腰交感神经节作为对照组，标本来源于急性外伤死亡男性，年龄25,45岁，无其它基础疾病，并经院方和家属同意提供. 所有标本经40 g/L中性甲醛固定，石蜡包埋，5 μm连续切片，备作免疫组化及HE染色. 2方法 采用链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶(SP)法. 多克隆抗体TH购自美国Santa Cruz生物技术公司，免疫组化试剂盒及DAB试剂盒购自北京中山生物技术公司. 主要步骤: 37?二甲苯30 min×2脱蜡后，依次梯度乙醇水化各3 min;30 mL/L H2O2室温孵育10 min，消除内源性过氧化物酶活性;抗原微波法热修复，采用pH6.0的0.01 mol/L枸橼酸钠溶液，维持95?，10~12 min;正常动物血清封闭，室温10 min;加一抗(TH 1?50稀释)37?湿盒孵育2 h;生物素化二抗，室温10 min;辣根酶标记链酶卵白素工作液，室温10 min; DAB显色3~4 min;苏木精复染，中性树胶封片. TH及DBH染色均定位于交感神经节神经元胞质，阳性表达呈黄色颗粒. 染色强度分为: 0级(完全阴性，与背景一致);1级(弱阳性，淡黄色，高于背景);2级(阳性，黄色，明显高于背景);3级(强阳性，棕褐色). 观察切片×400视野，可见细胞核者为有效计数细胞，计算不同细胞染色强度与细胞数的乘积，总和作为每高倍视野下染色分值. 每例切片随机计数10个视野，最后取其均值. 选择视野时注意避开非神经元组织(纤维结缔组织和血管、淋巴管断面)过多的视野. 统计学处理: 定量资料以x?s表示，两组间比较用t检验,组间方差不齐时，采用两样本比较的秩和检验Wilcoxon秩和检验. P0.05表示差异显着. 2结果 TH和DBH染色均定位于交感神经节神经元胞质. TH在Buerger病患者腰交感神经节神经元的表达，染色强度以阳性居多，强阳性次之，正常组中以弱阳性为多，阳性次之，比较每高倍视野下染色分值，前者高于后者,(24.6?3.4) vs (12.6?2.3),，有显着性差异(P0.01, Fig 1, 2); DBH在Buerger病组神经元的表达则以强阳性为主，阳性次之，对照组中以阳性为主，比较染色分值, Bureger病组高于对照组,(35.8?6.2)vs(29.7?4.5),有显着性差异(P0.05, Fig 3, 4). 同时对病变组和对照组的年龄进行比较，两组间存在较好的均衡性,(35.0?7.8)岁vs (32.0?6.2)岁,. 3讨论 Buerger病的发病机制复杂，确切病因至今不明，曾有学者设想病因是肾上腺交感系统的过度活跃，并以此提出了肾上腺(髓质)切除术和交感神经节切除术，之后有一些研究者报道Buerger病患者尿中儿茶酚胺代谢物水平增高，加上交感神经节切除后部分患者临床症状的好转，都提示存在着交感张力的增强. 但也有人认为该病患者的交感肾上腺功能减退，RonconAlbuquerque等,5,测得的Buerger病患者血中儿茶酚胺水平较正常人降低. 这些都没有得到进一步证实. Buerger病主要累及下肢中小动脉和静脉. 支配下肢血管运动的交感神经节前纤维，主要起于脊髓第10胸节至第2, 3腰节的侧角细胞，终止于相应或下位的交感神经节，节后纤维汇入腰丛和骶丛，随股神经、闭孔神经和坐骨神经分布到股动脉远段以远血管，其神经递质为去甲肾上腺素(NA). 血管紧张性的形成是由于交感缩血管神经末梢不断的释放微量神经递质. 神经元自循环中摄取酪氨酸，在酪氨酸羟化酶(TH)作用下生成多巴，再经多巴脱羧酶(DDC)形成多巴胺，然后通过多巴胺β羟化酶(DBH)合成NA. TH是 NA合成过程中的限速酶. 本实验中，我们以免疫组化的方法，观察到Buerger患者腰交感神经节神经元内TH及DBH表达比正常人高的总体趋势，差异具有统计学意义. 作为NA合成过程中的重要酶类, TH及DBH表达的增强，可导致腰交感神经节后纤维(交感缩血管纤维)内神经递质NA合成的增加，使得下肢血管的张力增大，处于一种持续的痉挛状态;或者是对外界刺激反应过激，处于一种易于痉挛的状态. 血管的长期痉挛，影响滋养血管对血管本身的血供，血管壁因相对缺血而受损害，加上痉挛造成管腔更趋闭塞，促进了各种病因对血管的损伤作用，构成并加速了本病的发生发展，致使管壁肥厚、炎症细胞浸润和血栓形成. 这也可以解释?, ?期Buerger病患者施行腰交感神经节切除术可取得较好效果. ?期Buerger病患者腰交感神经节切除效果不明显的原因可能与血管腔已经闭塞、血管壁交感神经末梢发生退行性变和纤维化而失去神经支配等因素有关. 这也表明腰交感神经节在Buerger病的发生发展过程中可能起着重要作用，腰交感神经节神经元中TH和DBH表达增强可使血管 ,1, Mills JL Sr. Buerger disease in the 21st century: diagnosis, clinical features, and therapy ,J,. Semin Vasc Surg, 2017;16 (3):179-189. ,2, Singh K, Sood S. Autonomic functions in Buerger disease ,J,. Indian J Physiol Pharmacol, 2017; 45 (4): 470-474. ,3, Bozkurt AK, Besirli K, Koksal C, et al. Surgical treatment of Buerger disease ,J,. Vascular, 2017;12 (3):192-197. ,4, Levitan IB, Laczmarek LK. The Neuron cell and Molecular Biology . 2nd edi. New York: Oxford University Press Inc, 1997: 149. ,5, ,M, RonconAlbuquerque R, Serrao P, ValePereira R, et al. Plasma catecholamines in Buerger disease: Effects of cigarette smoking and surgical sympathectomy ,J,. Eur J Vasc Endovasc Surg, 2017;24 (4):338-343. ,6, 李德卫，赵渝，时德，等. 下肢血栓闭塞性脉管炎患者腰交感神经节病变的研究,J,. 第四军医大学学报，2017;24(24):2251-2254.