脂多糖对皮肤纤维母细胞和表皮细胞的影响

脂多糖对皮肤纤维母细胞和皮细胞的影响 100037 北京 解放军第 304 医院 杨红明 付小兵 柴家科 盛志勇 牛津创面修复研究所 Magaret Hughes Goerge W Cherry 行 F 检验 。 关键词 纤维母细胞 ; 表皮细胞 ; L PS ; 细胞增殖 中国图书资料分类号 R329 . 282 结 果 在我们从事的某些植物提取物实验中证实了其 2 . 1 L PS 对 DM EM/ 0 . 4 %FCS 中纤维母细胞生长 〔1〕刺激纤维母细胞和表皮细胞生长的效果。植物 的影响 L PS 对纤维细胞的影响始于伤后 8 天 ,但 提取过程中可能存在内毒素污染问 。据报道某些 显著刺激作用则出现在应用后 10 天 。此时各剂量 细菌 来 源 的 内 毒 素 具 有 促 进 细 胞 分 裂 增 殖 的 作 ( 的吸收率是对照组的 125 %至 200 % P < 0 . 05 或 P〔2〕用。本研究旨在证明植物提取物最常受污染的 E ) < 0 . 01 ,图 1。coli 内毒素对纤维母细胞和表皮细胞增殖的促进作 用 ,并通过其刺激生长所需浓度与植物提取物实际 浓度的对比 ,来看其是否对我们既往显示的植物提 取物的促细胞增殖效果产生了影响 。 1 与方法 试 剂 ( ) ( 1 . 1 ?脂 多 糖 L PS1 mg 分 析 纯 E coli ) 0111 :B4 ,Sigma溶于 1 ml PB S 储存于 - 20 ?,实验 ( ) 当日溶化后稀释于培养液中 。?四唑盐 M T T购 图 1 不同 L PS 浓度对基础培养基中纤维母细胞 于 Sigma 及 Deto xigel 。 ( )生长的影响 P5 ,M T T 检测1 . 2 细胞培养 ?纤维母细胞 :冻存人乳房皮肤纤 2 . 2 L PS 对 DM EM/ 10 % FCS 中纤维母细胞生长 () μ维母细胞 5 代 , P5,实验当天解冻接种于 96 孔培 的影响 应用后 8 天和 10 天 ,L PS 浓度为 0 . 05g/ 养板 ,细胞密度为 1 000,1 500 个/ 孔 。细胞稀释于 μml 至 0 . 5g/ ml 组细胞生长率明显高于对照组 ,尤 营养型培养基 DM EM/ 10 % FCS 中 ,24 h 后换为基 μ以 0 . 1 和 0 . 5g/ ml 组显著 , M T T 检测时的吸收率 础培养基 DM EM/ 0 . 4 % FCS 。72 h 后 , 添加 L PS , ( 为对照组的 125 %至 167 % P < 0 . 05 和 P < 0 . 01 , μ浓度为 0 . 005,0 . 5g/ ml 。加药 10 天内 M T T 法监 ) 图 2。 测细胞生长情况 。实验重复 3 次 。 ?表皮细胞 : 冻 ( ) 存人阴茎包皮表皮细胞 3 代 , P3,实验当天解冻 , ( ) 稀释在营养型培养基 KGM中 ,然后接种于 96 孔 板 ,细胞密度 2 000 个/ 孔 。24 h 后 ,换为基础培养液 ( ) μKBM。48 h 后 ,添加 L PS 浓度为 0 . 005, 0 . 5g/ ml ,培养液每 2,3 天更新一次 。M T T 法检测 7 天 内细胞生长情况 。实验重复 3 次 。 ) μ(1 . 3 M T T 检测 25l M T T 溶液 5 mg/ ml加于培 μ养皿的每个孔中 ,2 h 后移去培养液 ,每孔加入 100l 〔3〕SDS 。测量波长 570 nm 的吸收率。 1 . 4 统计学处理 对每剂量 7 个孔的吸收率采用 图 2 不同 L PS 浓度对生长型培养基中纤维母细胞 统计学分析 。用 Stat view 512 TM 1 . 1 统计软件包 ( )生长的影响 P5 ,M T T 检测 2 . 3 L PS 对 KBM 中表皮细胞生长的影响 L PS ,而内毒素具促细胞分裂作用 。那么就有必要观 免 对 KBM 中表皮细胞生长的刺激作用早于纤维母细 察内毒素对皮肤细胞生长的可能影响 ,看其是否在 胞 ,出现在用药后 3 天 , 但 明 显 作 用 始 于 用 药 后 5 我们既往观察到的植物提取物促进皮肤细胞生长中 μμ天 ,以 0 . 005g/ ml 和 0 . 5g/ ml 显著 , 增长 117 %2 起作用 。 ( ) 164 % P < 0 . 05 和 0 . 01,这一结果低于基础培养实验证明 , E coli 来源的内毒素对人类两种类 型培养基中的皮肤纤维母细胞和表皮细胞生长均有 液中纤维母细胞 。L PS 的这一影响持续至用药后 7不同程度的促进作用 ,尤以纤维母细胞为明显 。这 () 天 图 3。一促进作用除了能间接反映细胞数量的 M T T 值的 升高外 ,从显微镜下细胞数量的增加上也得到了证 实 。但 L PS 的明显刺激作用所需时间长于 Meghji 〔2〕( 等的 报 道 。尽 管 我 们 所 用 最 低 L PS 浓 度 5 ng/ ) ml明显高于以前所用的 Eupolin 提 取 物 的 含量 ) (0 . 02,0 . 5 ng/ ml,但在使用后 3 天未发现明显刺 激作用 ,而 Eupolin 提取物此时的刺激作用已非常 显著 。尽管 L PS 的作用在用药后 5 , 10 天可以看 〔1〕 到 ,但 促 细 胞 增 生 程 度 远 不 如 Eupolin 提 取 物。 此结果提示 , 既往我们观察到的 Eupolin 提取物促 不同 L PS 浓度对基础培养基中表皮 图 3 皮肤细胞生长作用主要是由于 Eupolin 植物本身 ,( )细胞生长的影响 P3 ,M T T 检测 而非 L PS 。 细菌内毒素被认为是炎性细胞介质产 生的重要 2 . 4 L PS 对 KGM 中表皮细胞生长的影响 L PS 刺激物之一 。内毒素可以诱导纤维母细胞等产生 对 KGM 中表皮细胞的刺激生长作用类似于基础培 αIL21b 、IL26 、IL28 和 TN F等 ,而这些介质具有一定 μ养液中的影响 ,显著差异出现在伤后 5 天 ,0 . 01g/ 促进皮肤细胞生长的作用 。这可能部分解释 L PS ( ) ml 组为对照组的 120 %左右 P < 0 . 05 ,图 4。 的作用 。除了间接途径外 ,L PS 是否对皮肤细胞具 有直接作用尚不完全清楚 。我们观察到 ,L PS 除了 对营养型培养基中的皮肤细胞有刺激作用外 ,对基 础培养中的细胞也有明显影响 。由于对照组中的细 胞生长呈下降趋势 ,L PS 的这一作用可能与其受细 胞分泌的酶的降解而释放出寡糖类营养物质有关 。 参 考 文 献 Phan T T , Hughes MA , Cherry GW. Enhanced p roliferatio n of fi2 1 bro blast s and endot helial cells t reated wit h an ext ract of t he leaves of ( ) Chro molaena o do rata Eupolin , a herbal remedy fo r t reating 图 4 不同 L PS 浓度对生长型培养基中表皮细胞 wo unds. Plast Reco nst r Surg , 1998 , 101 : 756 ( )生长的影响 P3 ,M T T 检测Meghji S , Qureshi W , Henderso n B et al . The role of endoto xin and 2 cyto kines in t he pat hogenesis of o do ntogenic cyst s. Archs Oral Biol , 3 讨 论 1996 ,41 :523 Hansen MB , Nielsen SE , Berg K. Reexaminatio n and f urt her devel2 3 不同于静脉及肌内注射制剂 ,目前尚缺乏外用 op ment of a p recise and rapid dye met ho d fo r measuring cell growt h/ 药中内毒素的限制 。事实上 ,某些外用药物 ,尤 cell kill . J Immunol Met ho ds , 1989 ,119 :203 其是植物提取物 ,很难完全排除内毒素的污染 。当 ( )2000205218 收稿 2000211203 修回 我们在试图采用洗脱法完全清除植物 Eupolin 提取 ()本文编辑 曾 星