重组孕激素受体基因酵母法对南山茶子拮抗孕激素作用的研究

重组孕激素受体基因酵母法对南山茶子拮抗孕激素作用的研究 重组孕激素受体基因酵母法对南山茶子拮抗孕激素作用的 研究 作者:吴小娟～李剑～刘芸～李娜 ～唐玲～冯宝民～王 永奇 【摘要】 目的研究南山茶子拮抗孕激素作用。方法用系统溶 剂分离法将南山茶子醇提物分成极性不同的组分～利用重组人孕激素 受体基因酵母生物检测法筛选南山茶子拮抗孕激素活性部位。结果5 个组分都现出拮抗孕激素的效应～活性强弱依次为醋酸乙酯层> 正丁醇层>石油醚层>水层>醇提物。结论醋酸乙酯部位可能 为南山茶子拮抗孕激素的活性部位。 【关键词】 南山茶 重组人基因酵母 孕激素受体 拮抗作用 Abstract:ObjectiveTo study the antiprogestin active parts of the seeds of Camellia serrdserrate Chi.MethodsThe seeds of Camellia serrdserrate Chi. extract was separated into four fractions according to polarity, its antiprogestin active parts was investigated by a recombinant yeast screening assay. ResultsThe five fractions showed antiprogestin activity, and the order of the estrogenic activity of these fractions was ethyl acetate> normal butyl alcohol> petroleum ether > water extract > alcohol extraction.ConclusionThe ethyl acetate is the antiprogestin active parts of the seeds of Camellia serrdserrate Chi.. Key words:Camellia serrdserrate Chi.; Recombinant yeast; Progesterone receptor; Antagonistic effect 正常人骨代谢的平衡是离不开体内一种特殊物质调节的～这种 特殊物质就是激素。激素是由内分泌器官所分泌的一种高效能有机化 合物～人体内很多种激素～其中目前已经明确与骨质疏松有关联的8 种:雌激素、甲状腺激素,PTH,、降钙素、活性维生素D、甲状腺激 素、雄激素、皮质类固醇激素、生长激素。其中前4种更为重要。这 些激素或通过影响破骨细胞的数量及活性来调节骨吸收过程～或通过 影响成骨细胞的活性来调节骨形成过程～从而调节骨代谢。当这些激 素在人体内达到某一浓度时能够维持骨吸收与骨形成的平衡～但当它 们在体内的含量发生异常变化时～便会使骨代谢失去平衡～导致骨量 的减少～从而引起骨质疏松。已有大量的文献报道,1～2,:孕激素 受体能够降低雌激素受体(ER)的转录活性～也就是说对孕激素受体活 性的抑制能够增强体内雌激素受体活性的表达。 南山茶Camellia serrdserrate Chi.属于山茶科山茶属植物～ 广泛分布于我国的西南部和东南部～集中分布于我国长江以南的亚热带地区～资源非常丰富,3,～其化学成分主要有黄酮～皂苷和多酚这三大类,4,～我们在对山茶属植物药用价值的研究过程中发现～南山茶种子乙醇提取物对维甲酸所致骨质疏松的大鼠有很强的抗骨质疏松活性～并且明显高于阳性对照药。为了具体确定南山茶子抗骨质疏松的有效部位～我们首先用95%乙醇提取南山茶子得到醇提物～对其中三类化学成分的含量进行了测定～总黄酮4.07%～总皂苷12.15%～总酚4.30%,5,～并分别依次用石油醚、醋酸乙酯、水饱和正丁醇进行萃取～浓缩至干～再用转基因酵母的生物检测方法对它们是否有拮抗孕激素受体的作用进行研究～从而从另一角度来阐明南山茶子抗骨质疏松的作用机理。 1 仪器与试药 Laborata 4000型旋转蒸发仪,Heidolph～Germany,,酶标仪,Spectra Fluor plus～TECAN～Austria,,分光光度计,WFZ UV-2000～上海,,恒温振荡摇床,HZQ-F～哈东联,,恒温平板摇床,Titramax 1000～Heidolph～Germany,,百级超净工作台,DL-CJ-1F～哈东联,,旋涡混合器,MS2～广州IKA Works,～96孔培养板～96孔酶标板,比利时 Orange,。ONPG,Sigma～USA,～二甲基亚砜,99.9%～Sigma～USA,～酵母氮碱,Difco～USA,。 南山茶种子,2006年3月采集于广西省平南县六陈镇～经昆明植物民裴盛基教授鉴定,,重组人孕激素受体,hPR,基因酵母,Gaido赠送,,SC培养基,孕酮,PG,,MP. Bio medical公司,,酶反应底物邻硝基苯基β,D,半乳糖苷,Sigma,,二甲基亚枫(Sigma)～所用试剂均为分析纯～溶于超纯水,Milli-Q～USA,。 2 方法 2.1 试剂的配制 2.1.1 SC培养液称取36 mg赖氨酸～12 mg组氨酸～6.7 g无氨基酵母氮源～20 g葡萄糖溶于1 000 ml超纯水中～用0.22 μm滤膜过滤除菌后于4?下冷藏保存。 2.1.2 基础缓冲液称取21.5 g Na2HPO4〃12 H2O～6.22 g NaH2PO4〃2H2O～0.75 g KCl～0.25 g MgSO4〃7H2O溶于1 000 ml超纯水中～于4?下冷藏保存。 2.1.3 邻硝基苯基β,D,半乳糖苷溶液,ONPG,溶液,13.3 mmol〃L-1,称取0.4 g ONPG溶于100 ml基础缓冲液中即可,现配现用,。 2.1.4 Na2CO3溶液,1 mol〃L-1,称取10.6 g无水Na2CO3溶于100 ml超纯水中～于4?下冷藏保存。 2.1.5 CuSO4溶液,50 μmol〃L-1,称取1.196 g CuSO4〃5H2O溶于100 ml超纯水中～于4?下冷藏保存。 2.2 酵母接种的培养重组人孕激素受体基因酵母由Gaido赠送～培养基为增加硫酸铜,50 μmol〃L-1,、腺嘌啉、赖氨酸、色氨酸的SC培养基～室温避光保存,6,。 将1 ml新鲜冻融的酵母菌株接种到9 ml SC培养液中加10 μl CuSO4～臵于转速130 r〃min-1～温度为37?的空气浴摇床中培养过夜～用分光光度计测定10倍稀释的酵母菌株培养液在600 nm波长处的吸光度,以培养基为空白,～要求吸光度值在0.15，0.5～用培养液将酵母菌液稀释到A600=0.75作为工作液,7,。 2.3 南山茶的抗孕激素活性测定分别称取南山茶子醇提物～石油醚层浸膏～醋酸乙酯层浸膏～正丁醇层浸膏以及水层浸膏各50 mg～用1 ml DMSO溶解～得浓度为50 mg〃ml-1的溶液。取990 μl工作菌液至对应的EP管中～分别加入5 μl DMSO,空白,～5 μl用DMSO溶解的孕酮,PG～阳性对照～1×10-7mol〃L-1,和5 μl用DMSO溶解的样品涡旋混匀。在加入5 μl样品的EP管中再加入5 μl PG,浓 度为1×10-7mol〃L-1,涡旋混匀～将以上溶液各200 μl依次转移至96孔板中～然后于恒温平板摇床800 r〃min-1～37?振荡培养2 h。酶标仪测定A595后～吸取150 μl溶液弃去～加入120 μl测试缓冲液和20 μl氯仿～在30?的恒温摇床上预培养10 min。加入40 μl ONPG,4 mg〃L-1,反应液将酶反应启动至出现明显的黄色后加入100 μl 1 mol〃L-1Na2CO3溶液终止反应～吸取200 μl上清液转移到酶标板中测定A420的值,7,。 2.4 β-半乳糖苷酶活性以及孕激素抑制活性的计算 U=,(A420-A′420)/T×V×A595,×D 式中U代表酶活力～A420代表样品在420 nm处的吸光度～A′420为空白溶液,即DMSO,在420 nm处的吸光度～A595为样品在595 nm处的吸光度～T代表反应时间～V为反应菌液的稀释倍率～D为稀释因子。 抑制率(%)=1-U样U阳×100% U样为加入样品后品所表现出的酶活性～U阳为对照品PG的酶活性。 3 结果 实验最后的总体积为200 μl～样品的反应时间都为60 min～样品稀释倍率为0.2～将我们所测得A420和A595值带入上面的公式～就可以计算出相应的β-乳糖苷酶的活力值和抑制率。结果见表1和图1。表1 加入南山茶各样品后孕酮的酶活值/U和抑制率,略, 由表1和图1可以看出～样品南山茶子的醋酸乙酯部位抗孕激素活性最强～抑制率达到50%～其他各个组分基本相当～因此通过以上的数据分析我们可以判断南山茶子醇提物的醋酸乙酯部位为其拮抗孕激素的活性部位。 4 讨论 重组孕激素受体基因酵母是一种快速、有效的检测化合物是否有孕激素活性或抗孕激素活性的方法。它是将人孕激素受体基因,hPR,和孕激素受体响应元件,PRE,相连的β-半乳糖苷酶,LacZ,报告基因这两个基因片段引入到酵母中～当被测物质加入培养基中诱导或抑制PR时～都会启动基因的转录～产生和分泌β-半乳糖苷酶。通过测定A420的吸光度值来反应β-半乳糖苷酶的活性～从而可以得出被测物质对孕激素受体的作用。 植物雌激素与雌激素受体结合～在体内具有双向调节作用。当 体内雌激素水平较低时～它就表现出雌激素样活性～当体内雌激素超 过正常水平时～它就发挥出抗雌激素的作用,8,。重组雌激素受体基 因酵母筛选南山茶子抗骨质疏松有效部位的实验的结果显示醋酸乙 酯部位对雌激素受体表现出双向调节的作用～具有较明显的雌激素活 性同时又有较强的抗雌激素活性～因此推断雌激素样作用可能是南山 茶子发挥抗骨质疏松作用的主要机理之一～但是, 醋酸乙酯部位具有 抑制孕激素受体的作用～同样能够导致生物体产生类雌激素样的结 果。因此～同时应用重组雌激素和孕激素受体基因酵母～可以更加准 确筛选出南山茶子抗骨质疏松的活性部位。 致谢:本实验是在中科院生态研究中心水生态毒理研究组完 成～在此特别向王子健研究员给予本实验的帮助和支持表示最诚挚的 谢意～感谢本实验室所有的老师和同学。 【参考文献】 ,1,Wen D X, Xu Y F, Mais D E, et al. 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