河蟹眼柄神经内分泌细胞Glu受体研究_cropped

河蟹眼柄神经内分泌细胞Glu受体研究_cropped 第 28 卷 第 6 期Vol . 2 8 , No . 6 水 生 生 物 学 报 2 0 0 4 年 1 1 月ACTA HYDROBIOLOGICA SINICA Nov . , 2 0 0 4 河蟹眼柄神经内分泌细胞 Glu 受体研究 221 ,2高春蕾 相建海 孙金生 (11 天津师范学院生物系 ,天津 300074 ;天津水产研究所 ,天津 300021 ; ) 21 中国科学院海洋研究所 ,青岛 266071 ( ) () 摘要 :作者采用全细胞膜片钳技术测定了中华绒螯蟹 Eriocheir sinensis眼柄视神经节端髓 X 器官 MTXO神经内分 ( ) 泌细胞对 0101 —10mmol/ L 谷氨基酸 Glu的反应 ,并结合药理学方法进行了 Glu 受体研究 。结果明 , Glu 激活 A- - ( ) 型和 B 型细胞离子型 Cl 通道蛋白受体 ,诱导快速激活 、快速失活的配体门控 Cl 通道电流 I。依据内外液的Glu - Cl 浓度比例引发去极化或超极化反应 ,继续施加 Glu ,细胞快速出现脱敏反应 ; 去除 Glu 后 ,细胞约需 20s 恢复对 Glu 的敏感状态 。I幅值呈浓度依赖性 ,量2效关系曲线呈线形 ,激活阈值为 0101mmol/ L ,约 5mmol/ L 达到饱和 。河 Glu- ( ) 蟹眼柄 神 经 内 分 泌 细 胞 I明 显 受 到 Cl 通 道 阻 断 剂 picrotoxin 015mmol/ L 抑 制 ; 对 离 子 型 Glu 受 体 激 动 剂 Glu - ( ) Quisqualate 、Kainate 、NMDA 、AMPA 不敏感 。Ibotenic acid IA可模拟 Glu 诱导快速激活 、快速脱敏的 Cl 电流 ,并与 Glu ( ) 产生交互脱敏作用 。Glu 和 GABA 对河蟹眼柄神经内分泌细胞无交叉脱敏和交叉激活作用 ,甘氨酸 Gly没有诱导 细胞产生任何反应 ,提示中枢神经系统通过 Glu 和 GABA 两套系统实现对眼柄神经内分泌系统的精确调控 。 关键词 :河蟹 ;MTXO ;神经内分泌细胞 ;谷氨酸受体 ;全细胞膜片钳技术 () 文章编号 :100023207 20040620647206 中图分类号 :Q424 ,Q26 文献标识码 :A ( ) 为甲壳动物的内分泌调控中心 。它分泌甲壳动物高谷氨酸 Glutamic acid , Glu是 中 枢 神 经 系 统 中 ( ) () 最丰富的一种兴奋性神经递质 ,既有递质功能 ,又参 CHH、蜕皮抑制激素 MIH、性腺发育抑制 糖激素 ( ) 与代谢 。根据生化药理研究结果 ,可将哺乳动物中 激素 GIH等多种神经肽类激素 , 调控甲壳动物的 5 ,6 枢神经系统的 Glu 受体分为离子型受体和代谢型受 生殖 、发育和蜕皮等重要生理功能。虽然 Glu 作 (体 。前者包括 N2甲基2D2天冬氨酸 N2Methy2D2aspar2 为递质或调质物质广泛的存在于甲壳动物体内 ,由 ( ) ) αtate ,NMDA受体 ,海人藻 KA受体和2氨基羟甲基 于受细胞培养材料的限制 ,至今仅观察了一种热带 ( 恶 唑 丙 酸 alpha2amino232hydroxy252methyl242isoxazole2 ( ) 地蟹即凶狠圆轴蟹 Cardisoma carnifex 分泌 CHH 细 7 ) proprionic acid ,AMPA受体 ; 后者包括 L222氨基242磷 ( )胞对 Glu 的反应。中华绒螯 蟹 Eriocheir sinensis () () 丁酸 L2AP受体 、反氨基环戊烷二羧酸 ACPDA受俗称河蟹 , 是我国主要养殖经济蟹类之一 。近年来 , 4 1 ,2各地河蟹养殖中普遍发生性早熟和养殖规格小等难 。哺乳动物神经细胞和肌肉细胞表达的离子 体 ,严重地阻碍了我国河蟹养殖业的发展 。对眼柄 型 Glu 受体多与 GABA 受体通道相关 。一些节肢动 3 神经内分泌激素分泌机制和调控的研究不仅有助于 物和软体动物也存在 Glu 和 GABA 共同的受体。 离子型 Glu 受体也广泛存在于甲壳动物神经组织 、 解决这些难题 ,还可为重要经济甲壳动物的人工繁 殖和生长控制提供指导 。作者已对河蟹眼柄 XO2SG 肌肉组织和内分 泌 系 统 , 介 导 调 控 多 种 生 理 活 动 。 神经内分泌系统组织学 、细胞学和免疫细胞化学方 如甲壳动物胃上神经节细胞表达抑制性谷氨酸受体 ( ) 通道 IGluRs, 介导抑制中枢对节律性活动组织的 面进行了全面观察 ,并进行了眼柄视神经节端髓 X 4 () 器官 MTXO神经内分泌细胞离体培养研究 ,依据大 控制。 小 、形态 、超微结构 和 体 外 生 长 方 式 等 特 征 区 分 出 眼柄 XO2SG 神经内分泌系 统 是 甲 壳 动 物 的 特 8 ,9 有结构 ,类似于哺乳动物的下丘脑 —垂体系统 ,被称 A 、B 、C 三种类型细胞。本文在对河蟹眼柄神经 收稿日期 :2002209220 ;修订日期 :2003210224 () ( ) 基金项目 :国家自然科学基金资助项目 30271019;国家“973”重点基础研究资助项目 G1999012007资助 () 作者简介 :孙金生 1965 —,男 ,天津市人 ;研究员 ,博士后 ;主要从事甲壳动物内分泌学研究 通讯作者 :相建海 , E2mail :jhxiang @ms. qdio . ac . cn 10 ( ) Picrotoxin 分泌细胞电生理特征研究的基础上 ,采用全细胞 PTX、Bicuculline 、Quisqualate 、Kainate 、NM2 DA 、AMPA 、L Y354740 为 Sigma 产 品 , 实 验 前 用 无 菌 膜片钳技术观察河蟹眼柄 MTXO 神经分泌细 胞 对 Glu 的反应 ,并结合药理学方法进行 Glu 受体研究 ,河蟹生理盐水配至终浓度 。实验采用 16 通道快速 () 以为进一步研究眼柄神经肽类激素的分泌调控机制 加药系统 ALA Sci . Instruments N Y进行加药 。加药 打下基础 。 过 程 由 计 算 机 控 制 , 用 操 纵 器 操 纵 尖 端 直 径 为 μμ( 100m 的加药头至细胞约 50m 处 ,压力加药 10p . 1 材料和方法 ) s. i . ,可在 10mS 内将 16 个储液槽中的任何一种药 品或冲洗液快速地加到细胞表面并浸浴整个选定细 实验动物为取自天津111 动物解剖和细胞培养 市宁河县仁凤乡和山东东营河蟹养殖场的正常一龄胞 。 蟹种 ,壳宽为 2 . 1 —2 . 4cm , 臵室 内 水 泥 池 暂 养 。动 2 结果 9 物解剖和细胞培养方法详见孙金生的描述 。简述 如下 :选取附肢健全的健康蟹种 , 经 低 温“麻 醉”和211 河蟹眼柄 MTXO 神经内分泌细胞对 Glu 的反应 1?30碘伏浸泡消毒 20min 后 ,在苏净 BCM21000 超净 在全细胞电流钳模式下 ,将膜电流钳制在0 pA , 工作台中取下眼柄 。然后在无菌河蟹生理盐水中剥 使细胞处于静息不活动状态 。三种类型细胞的静息 ( ) 离外骨骼 、肌肉和连接组织 ,取出视神经节 ,并沿窦 膜电 位 均 在 - 50mV 左 右 n = 30 。此 时 灌 流 ( ) 腺的轴 路 , 在 视 神 经 节 端 髓 取 出 X 器 官 MTXO。1mmol/ L Glu ,观察河蟹眼柄三种类型神经分泌细胞 MTXO 于 24 ?振动消化 1 . 5h 后 ,在培养液中搅动打 对 Glu 的反应 。结果表明 ,A 型和 B 型细胞均产生 散细胞 ,分散的细胞于 24 —26 ?、黑暗 、潮湿条件下 去极化反应 。A 型细胞的平均去极化电压为 4518 ? 2 + 2 + ( ) 培养 。消化酶液为溶解于无 Ca、Mg生理盐水的3mV ,持续 6 . 5 ?018mS n = 5,B 型细胞的平均去极 ( ) 013 %胰蛋白酶 Sigma。培养液为 1 . 75 倍河蟹生理 ( ) ( 化电压为 - 47 ?2mV , 持续 3 . 7 ?015mS n = 5图 -( ) ) 盐水 配 制 的 L215 培 养 基 p H7 . 5 , 临 用 前 加 入 1。另外 ,通过降低电极内液或升高细胞外液 Cl 011mg/ mL 庆 大 霉 素 、150mmol/ L 葡 萄 糖 和 1mmol/ L 浓度 ,可使去极化反应转变为超极化 。为了鉴别是 谷氨酰胺 。膜片钳实验采用培养 2d 、形态特征典型 否有钙离子和钠离子参与去极化电位的形成过程 , 的 A 、B 、C 三种类型河蟹眼柄 MTXO 神经内分泌细 在进行 Glu 灌流前 ,首先将培养细胞与含有钙离子 2 + ( ) 胞 ,用奥林巴斯 IX70 观察细胞 。A 型和 B 型细胞分通道阻断 剂 Cd015mol/ L 和 钠 离 子 通 道 阻 断 剂 (别为抗 CHH 和 抗 MIH 免 疫 阳 性 细 胞 。实 验 前 , 用 μ) TTX5mmol/ L的细胞外液孵育 20min 。结果表明 , 无菌河蟹生理盐水冲洗培养皿 3 次 。 GABA 引起的 A 、B 二种类型神经分泌细胞的去极化 2 + ( ) ( ) 112 膜片钳实验和数据的采集 、处理 采用 EPC9反应不受 TTXn = 3和 Cdn = 3的影响 ,形成的 ( ) 膜片钳放大器 HEKA Elektronik , Germany,在电流钳 ( ) 去极化电压大小无明显差异 P > 0105。 和电压钳两种模式下测定河蟹眼柄神经分泌细胞对 () Glu 的反应 。实验在室温 22 —26 ?下进行 ,用高阻 封接全细胞膜片钳技术记录电信号 。数据的采集和 储存均通过 PULSE 软件完成 ,用 Igor 软件进行数据 。玻璃电极毛坯为 WPI 公司生产的薄壁毛细 () 管 1B150F24, 无 需 灌 尖 , 充 灌 内 液 后 电 极 电 阻 为 Ω 3 —5M。用硅酮树脂涂敷电极尖端降低杂散电容 () () () 图 1 Glu 1mmol/ L诱导 A 型 A和 B 型 B细胞产生去极化反应 干扰 。快 、慢电容为自动补偿 , 串联电阻补偿至最 () () Fig. 1 Depolarization were evoked in cell type AAand cell type B Bin ( ) 佳 。标 准 电 极 内 液 为 mmol/ L : 200 KCl , 5NaCl , ()response to Glu 1mmol/ L + 5MgCl, 20 HEPES , 5 ATP22Na , 5 BAPTA , KOH 调 2 - p H7 . 5 。标准细胞外液为添加 20mmol/ L 葡萄糖的无 212 Glu 激活 Cl 通道蛋白受体 菌河蟹生理盐水 。因实验修改电极内外液的成分在 形成全细胞电压钳构型后 ,将保持电压钳制在 文中另行说明 。 ) (- 50mV 接近静息膜电位 ,无明显的膜电流产生, 分别灌流 0101 —10mmol/ L Glu ,观察河蟹眼柄 MTXO (113 药 品 及 加 药 方 法 谷 氨 酸 L2Glutamic acid , 神经内分泌细胞对 Glu 的反应 。结果表明 ,A 、B 型 ) ( ) ( ) γGlu、2氨 基 丁 酸 GABA、甘 氨 酸 Glycine , Gly、 649 6 期孙金生等 :河蟹眼柄神经内分泌细胞 Glu 受体研究 细胞出现电流特征相似的快速激活 、快速失活的内Glu 的浓度无关 , 灌流阈值浓 度 的 Glu脱敏反应与 ( ) () 向电流 I。电流在灌流 Glu 后 425 ?124mS 内开 0101mmol/ L同样引起细胞的脱敏反应 , 甚至继续 Glu 始出 现 , 在 约 465 ?75mS 内 达 到 峰 值 , 635 ?145mS 灌流饱和浓度的 Glu 也不能使细胞产生反应 。洗掉 后失活 70 % —90 % ,随后出现 10 % —30 %的平台期 Glu 后 , 细 胞 很 快 就 恢 复 到 敏 感 状 态 。冲 洗 后 约 () 图 2A。量效关系呈明显的线型 ,产生阈值电流反 415s 恢复 50 % ,7s 恢复 75 % ,10s 恢复 84 % , 约 20s () 应的 Glu 浓度为0101mmol/ L ,饱和浓度接近 5mmol/ L 内完全恢复 图 3A 、B。平台部分既无明显的失活 , () () 也无明显的脱敏现象发生 图 3A。 图 2B。继续灌流 Glu ,两种细胞都出现脱敏反应 。 图 2 河蟹眼柄 MTXO 神经内分泌细胞对不同浓度谷氨酸的反应 。A :依次对同一个 A 型细胞灌流 5 —0101mmol/ L Glu ,诱发细胞产生不同幅 值的快速激活 、快速失活内向电流 。实线示灌流 Glu , 虚线示标准细胞外液冲洗 , 冲洗时间 > 20s 。B : 线形量效关系曲线 , 示激活阈值为 0101mmol/ L ,饱和浓度为 5mmol/ L 。横坐标为 Glu 浓度的 Log 值 Fig. 2 The responses of MTXO neurosecretory cells to the application of glutamate . A : The transient Glu currents were evoked from one type A cell in responses ( ) to a series of concentrations of Glu0101 —5mmol/ L. Real lines indicated Glu perfusion ; dotted lines indicated washing. B : Dose2response curve ,indicated a just2discernable effect at 0101mmol/ L and a near2saturation at 5mmol/ L ( ) 图 3 河蟹眼柄 MTXO 神经内分泌细胞对 Glu 产生快速脱敏反应 ,洗去 Glu 后又快速恢复到敏感状态 。A : 灌流 1mmol/ L Glu 1引发脱敏反 () () () 应后 ,冲洗 7s 4、10s 3和 20s 2 、5后记录的 A 型细胞 I。示河蟹眼柄神经内分泌细胞 20s 后完全恢复对 Glu 的敏感状态 ,平台部分未出Glu 现明显的脱敏反应 。实线示灌流 Glu ,虚线示标准细胞外液冲洗 。B :1mmol/ L Glu. 引发 A 型细胞脱敏反应后 3 —25s 内恢复的敏感程度 。纵 坐标为不同时间记录的 I与对照 I的比值 ,示细胞在不同时间内恢复的敏感程度 ,约冲洗 415s 后恢复 50 % GluGlu Fig. 3 Desensitization occurred rapidly after Glu application ,then recovered after washing with standard extracellular solution. A : The Glu currents were recorded () () () () 7s 4、10s 3and 20s 2 、5after washing ,showed recovering ratio of first response to 1mmol/ L Glu1. Real lines indicated Glu perfusion ; dotted lines indicat2 ed washing. B : Recovering ratio 3 —25s after washing ,showed that recovery to 50 % of the first response required 415s ,to 100 % required about 20s - Glu 电流幅值与保河蟹眼柄神经内分泌细胞的 内液中氯离子的浓度 ,观察 Cl 对 I反转电位的影 Glu- 响 。结果表明 , I的反转电位随着内外液中 Cl 浓 Glu持电压相关 。在电压钳模式下 ,将保持电压分别钳 度的比例的不同而发生变化 ,非常接近 E。图 5 是 Cl 制在 - 90 —10mV ,对同一个 A 型细胞灌流 1mmol/ L () 在 0 —90mV 保持电压下记录的 B 型细胞 IA及 Glu ( ) Glu ,用标准电极内外液记录到一系列 I图 4A。 Glu () 电流 - 电压关系曲线 B。E为 - 45mV ,反转电位 Cl ( ) 电流电压关系曲线结果 图 4B显示 , I没有整流 Glu 约为 - 40mV 。作者还观察到保持电压越负 ,记录的 - ( ) 特征 , 但 存 在 反 转 电 位 约 - 2 . 5 mV, 接 近 Cl 的 () I失活越快 图 4A 、5A。进一步的结果表明 , I对 GluGlu( ) NERNST 电位 E, - 4mV, 提 示 I的 反 转 电 位 与 Cl Glu ( ) 氯离 子 通 道 阻 断 剂picrotoxin敏 感 详 见2 . 3 , 而 且 电极内外液中氯离子的比例相关 。于是 ,通过改变 图 4 在电压钳模式下 ,将保持电压分别钳制在 - 90mV —+ 10mV ,对同一个 A 型细胞灌流 1mmol/ L Glu , () () 用标准电极内液记录到一系列 IA及其峰值与保持电压关系曲线 BGlu () Fig. 4 A series of Glu currents were recorded from one type A cell at the holding potential of - 90mV —+ 10mV Aand () () ( ) corresponding IVcurve Bin responses to 1mmol/ L Glu ,when the standard intracellular solution E= - 4mVwas used Cl ()图 5 在电压钳模式下 ,将保持电压为分别钳制在 - 90mV —0mV ,对同一个 B 型细胞灌流015mmol/ L Glu ,记录到一系列 IA Glu () 及其与保持电压关系曲线 B。Ecl = - 45 ,反转电位约为 - 40mV () Fig. 5 A series of Glu currents were recorded from one type B cell at the holding potential of - 90mV —0mV and corresponding IVcurve in - ( ) response to 015mmol/ L Glu ,when the low Cl intracellular solution E= - 65mVwas used. Showed that reversal potential was at - 40mV Cl + 2 + Na 和 Ca没有参与 Glu 诱导的去极化过程 ,证明 代谢型 Glu 受体激动剂 , IA 是离子型和代谢型 Glu 河蟹眼柄神经内分泌细胞表达的 Glu 受体为配体门 受体激动剂 。河蟹眼柄神经内分泌细胞仅对 IA 产 生反应 ,出现类似于 I的快速激活和快速失活的内 控氯离子通道蛋白 。 Glu 向电流 。灌流 IA 20s 后 ,快速更换为 Glu 或 GABA , 213 河蟹眼柄神经内分泌细胞 Glu 受体的药理学 特性 作者通过观察细胞对一些哺乳动物 Glu 受体的11 激动剂和阻断剂的反应 ,初步鉴定河蟹眼柄神经 内分泌细胞 Glu 受体药理学特征 。Picrotoxin 是最早 - 被鉴定的配体门控 Cl 通道阻断剂之一 。当河蟹眼 柄神经内分泌细胞在含有 015mmol/ L Picrotoxin 的细 胞外 液 中 浸 浴 5min 后 , 对 Glu 的 反 应 明 显 受 到 抑 图 6 Picrotoxin 阻断河蟹眼柄 A 型神经内分泌细胞 Glu 电流 ( ) ( ) 制 ,抑制程度大于 90 % n = 3图 6。L Y354740 是 Fig. 6 Glu currents resolved from cell type A were blocked by application of Picrotoxin 651 6 期孙金生等 :河蟹眼柄神经内分泌细胞 Glu 受体研究 ( 只记录到 I, 在甲壳动物眼柄神经内分泌系统中 Glu一步证实 河蟹眼柄神经内分泌细胞对 GABA GABA ) ( ) 的反应另文发表,未记录到 In = 5。同样 ,灌流 和 GABA 激活不同的受体 。这一结果提示 ,甲壳动 Glu Glu20s 后 ,细胞 对 IA 引 起 的 反 应 脱 敏 , 而 对 GABA 物中枢神经系统由 Glu 和 GABA 介导 , 分别激活不 ( ) μ( ) 的反应未受到影响 n = 5。Gly 1mmol/ L没有诱 同的受体 ,通过两条途径实现对眼柄神经内分泌系 ( ) 导细胞产生任何反应 n = 3。为 进 一 步 鉴 定 表 达 统的精确调控 。 Glu 受体的类型 , 分别观察了离体培养的细胞对一 参考文献 : 些离子型 Glu 受体激动剂反应 。结果显示河蟹眼柄 1 Rekling J S , Funk G D ,Bayliss D A , et al . Synaptic control of mo2 ( ) 神经 内 分 泌 细 胞 对 Quisqualate 1mmol/ L , n = 3 、 toneuronal excitabilityJ . Physiol . Rev . 2000 ,80 :767 —852 ( ) ( ) Kainate 1mmol/ L , n = 3 、NMDA 1mmol/ L , n = 3 、 Liberman D N ,Mody I. Properties of single NMDA receptor channels 2 () AMPA 1mmol/ L ,n = 3均不敏感 。 in human dentate gyrus granule cellsJ . J . Physiol . 1999 , 518 :55 — 70 3 讨论 Cully D F , Wilkinson H ,Vassllatis D K , et al Molecular biology and 3 electrophysiology of glutamate2gated chloride channels of invertebrates 眼柄 XO2SG 神经内分泌系 统 一 直 是 甲 壳 动 物 J . Parasitology . 1996a ,113 : S191 —S200 内分泌研究的重点内容 ,已分离纯化多种甲壳动物 Cleland T A ,Selverston A L . Inhibitory Glutamate receptor channels in 4 特有的神经肽类激素 。这些激素在甲壳动物的性腺 cultured lobster stomatogastric neuronsJ . J . Neurophysiol . 1998 ,79 : 发育 、蜕皮生长和能量代谢等重要生理活动中发挥 3189 —3196 着关键的作用 。人们一直致力于这一系统激素的分 Cooke , I. M , Sullivan R. E. Hormones and neurosecretion M . New 5 York :Academic Press ,1982 ,205 —209 泌调控研究 ,期待在生产中控制经济甲壳动物的繁 Keller R. Crustacean neuropeptides structure ,function and comparative 殖和生长 。谷氨酸是广泛分布在甲壳动物神经系统 6 aspectsJ . Experimentia. 1992 ,48 :439 —448 ( ) 的递质或调质类物质 ,介导中枢神经系统 CNS对 Duan S ,Cooke I M. Glutamate and GABA Activate different receptors 3 ,4 ,12 7 不同靶 组 织 的 兴 奋 或 抑 制 作 用。但 是 , 由 于 - and Cl conductances in crab peptider2secretory neuronsJ . J . Neu2 研究手段和培养细胞材料的限制 ,迄今仅观察了热 rophysiol . 2000 ,83 :31 —37 7 带地蟹眼柄分泌 CHH 细胞对 Glu 的反应。作者 Sun J S ,Liu A X. Du Y Z ,Microstructure and ultrastructure of sinus 8 采用全细胞膜片钳技术 ,首次全面观察了河蟹眼柄 gland in the eyestalk of Eriocheir sinensis J . Acta Zoologica Sin . MTXO 不同类型 神 经 内 分 泌 细 胞 对 Glu 的 反 应 , 发 2001a ,47 :27 —31 孙金生 ,刘安西 ,杜育哲 ,中华绒螯蟹窦腺的 显微和超微结构. 动物学报 ,2001 ,47 :27 —31 现分泌 CHH 和 MIH 细胞表达离子型 Glu 受体 ,其他 Sun J S ,Liu A X ,Chen J T. et al . Cytoloyand culture of neurosecretory 9 细胞对 Glu 没有反应 。I不仅 激 活 快 、脱 敏 快 , 而 Glu cell in the eyestalk of Eriocheir sinensis J . Acta Hydrobiol . Sin . 且恢复敏感状态也快 ,在 20s 内完全恢复 ,而热带地 2000 ,24 :374 —379 孙金生 , 刘 安 西 , 贺 秉 军. 河 蟹 眼 柄 MTXO 蟹需要 140s 恢复到 90 %的敏感状态 。河蟹眼柄神 神经分泌细胞的培养和细胞学研究. 水生生物学报 2000 ,24 : 374 —379 经内分泌细胞 Glu 受体的一些药理学特征与热带地 Sun J S ,Liu A X ,Chen J T. et al . Patch clamp study on the ion chan2 蟹眼柄分泌 CHH 细胞相似 ,如 IA 可以模仿出对 Glu 10 nels in the cultured MTXO neurons in Eriocheir sinensis J . Acta Bio2 的反应并与 Glu 的反应出现交叉脱敏作用 ,对哺乳 physica Sin . 2001 , 17 : 231 —238 孙金生 , 刘安西 , 陈 家 童 , 相 建 ( ) 动物中枢神经系统 CNS兴奋型受体激动剂 NMDA 、 海. 河蟹眼柄 MTXO 细胞离子通道的膜片钳研究. 生物物理学 Quisqualate、Kainate 不 产 生 反 应 , 被 picrotoxin 抑 制 报 ,2001b ,17 :231 —238 等 。河蟹眼柄神经内分泌细胞 I有两种成分 ,一是 Ozawa S , Kamiya H , Tsuzuki K. Gutamate receptors in mammalian Glu11 central nervous systemJ . Prog. Neurobiol . 1998 ,54 :581 —618 快速脱敏的峰值部分 ,另一是几乎不脱敏的平台部 Cleland T A , Selverston A L . Glutamate2gated inhibitory currents of 分 ,提示 河 蟹 眼 柄 神 经 内 分 泌 细 胞 可 能 表 达 两 种 12 central pattern generator neurons in the lobster stomatogastric ganglion Glu 受体 。另外 ,河蟹眼柄神经内分泌细胞 Glu 受体 J . J . Neurosci . 1995 ,15 :6631 —6639 通道与 GABA 受体通道无交互脱敏和交互激活 ,进 RESEARC H O N THE GL UTAMATE GATED C HANNELS IN THE NEUROSECRETO RY CELLS OF MTXO IN THE EY ESTAL KS OF ERIOC H EIR S IN ENS IS 1 ,2 2 2SUN Jin2Sheng, GAO Chun2Leiand XIANG Jian2Hai (11 Department of Biology , Tianjin Normal university , Tianjin 300074 ; Tianjin Fishery institute , Tianjin 300021 ; )21 Institute of Oceanology , The Chinese Academy of Sciences , Qingdao 266071 Abstract :The X2organ sinus gland is a major peptidergic neurosecretory system in crustacean , analogous to the vertebrate hy2 ) ( pothalamoneurohypophyseal system. Chinese mitten2handed crab Eriocheir sinensisX2organ located on the ventral surface of ter2 minalia in the eyestalk ,named MTXO. Three types of neurosecretory cells dissociated from MTXO had been identified on the basis of shape ,size and outgrowth fashion. The cell type A and cell type B were immunoactive to anti2CHH and anti2MIH serum respec2 tively. In the present paper ,the whole2cell patch clamp technique was used to examine the responses of MTXO neurosecretory ( ) cells to rapid application of glutamic acidGluand the Glu receptor characteristics. The results suggested that glutamate activated - a ionotropic Cl channel receptor and evoked depolarization or hyperpolarization in the type A and type B neurosecretory cells in - - -( ) response to the Glu 1mmol/ Ldepending on the Cl ]/ Cl ]ratio . Under voltage clamp mode ,the transient inward Cl 0i ) (( ) channel currents Iwere resolved in responses to Glu0101 —5mmol/ L. The size of Glu currents were related to the Glu con2 Glu centration , Dose2responses curve showed line shape , with a just2discernable effect at 0101mmol/ L and near2saturation at 5mmol/ L . During continued Glu perfusion , the responses declined more quickly for higher concentration. When the desensitiza2 tion had occurred ,it could not be overcome by application of higher concentration. The recovery required 20s for type A and type - B cells after washing with standard extracellular solution. The Glu currents had reversal potentials that followed Nernst Clpoten2 - tials when Cl was varied. The pharmacological results revealed that the GABA receptor of the crab neurosecretory cells were - () sensitive to the Cl channel blocker picrotoxin015mmol/ L,insensitive to ionotropic Glu receptor agonist ,Quisqualate 、Kainate 、 ( ) NMDA 、AMPA. Ibotenic acid IAwas proved to be an effective agonist on the cell type A and B ,producing inward currents that showed rapid desensitization similar to the Glu responses. The responses to Glu were attenuated after application of IA , showed cross2desensitization between IA and Glu. No response was observed in the crab MTXO cells after application of Glycine . Some evidence revealed that Glu and GABA activated different receptors. This suggests that the neurosecretory cells were regulated by CNS through different Glu and GABA system. ( ) Key words : Eriocheir sinensis ;MTXO ;Neurosecretory cell ; Glutamic acidGlu; Whole2cell patch clamp technique