利用GC-MRM检测去势大鼠前列腺中睾酮、双氢睾酮和脱氢表雄酮

利用GC-MRM检测去势大鼠前列腺中睾酮、双氢睾酮和脱氢雄酮 利用GC-MRM检测去势大鼠前列腺中睾 酮、双氢睾酮和脱氢表雄酮 V01.29 2008年11月 高等学校化学学报 CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES No.11 2155,2158 利用GC/MRM检测去势大鼠前列腺中 睾酮,双氢睾酮和脱氢表雄酮 陈君,梁琼麟,李珲,罗国安,王义明 (1.清华大学化学系,北京100084; 2.北京大学泌尿外科研究所,北京大学第一医院,北京100034) 摘要建立了一种睾酮,双氢睾酮及脱氢表雄酮的GC/MRM方法.该方法回收率高,灵敏度好,对样 品需求小,已运用于研究去势大鼠前列腺中各种雄激素含量的变化.以去势大鼠为模型,对去势后3个月内 其前列腺内雄激素含量的变化进行检测分析.去势后,大鼠前列腺中雄激素含量经过2个月的平台后,至术 后3个月出现明显降低.而抑制5还原酶药物的作用,术后2个月时能明显改变前列腺中激素含量水平. 关键词前列腺;雄激素;气相色谱一质谱联用 中图分类号0657文献标识码A文章编号0251-0790(2008)11—2155-04 前列腺癌目前在欧美的发病率仅次于肺癌和结肠癌,是男性健康中的重要议_1].不论是正常的 前列腺组织还是恶性的前列腺肿瘤的生长,都依赖于机体中具有生理活性的雄性激素浓度].基于此 种观点,对于前列腺癌的治疗手段就是抑制机体中的雄性激素的分泌.抑制雄性激素分泌的方法主要 有两种:第一种是利用外科手术阉割睾丸,第二种是利用雄性激素拮抗剂治疗.去除雄性激素的治疗 对于早期前列腺癌有效率达到80%,90%.但是经过一段时间,前列腺癌细胞变成能够抵抗雄性激素 拮抗剂,此时的生长期转化为”非雄性激素依赖期”.前列腺中的雄性激素主要来源于睾丸和肾上腺 (图1).去势手术后,肾上腺究竟如何影响前列腺中激素的代谢,目前并无定论.雄性激素主要是睾酮 和双氢睾酮,在生物体内睾丸和肾上腺主要通过胆固醇的侧链氧化,双键异构,羰 基还原等步骤合成. Cholesterol O Pregnenolone . 一 H H l7a-Hydroxyprogesterone H 4-AndrostenedioneTestosteroneDihvdrotestosterone Fig?1Anabolismpathwayofandrogens GC/MS方法因其高灵敏度已被用于甾体激素的检测.由于生物样品中甾体激素含量较低,利用传 统GC/MS方法则对样品前处理提出了较高的.而生物样品中的脂类物质对甾体激素的检测会造 成较严重的干扰.正己烷或环己烷通常用来通过液一液萃取技术从脂类物质中分离出甾体激素].这 种方法耗时长,溶剂消耗大,而且回收率不高,.而固相萃取方法能有效地提高甾体激素的回收 ,二级质谱的运用能有效地消除脂类物质对甾体激素检测的干扰]. 率.另外 本文建立了一种适用于组织样品中甾体激素分析的固相萃取方法,并发展了一种基于二级质谱技 术的GC/MRM方法,同时将其应用于大鼠前列腺样品中睾酮和双氢睾酮含量的测定.通过给大鼠进行 双侧睾丸去势手术造模,利用GC/MRM方法检测模型鼠及给予5还原酶抑制剂的模型鼠一段时间的 收稿日期:2008-04-02. 基金项目:国家自然科学基金(批准号:30772169,90709045)资助. 联系人简介:罗国安,男,教授,博士生导师,主要从事生命分析化学方面的研究.E-mail:luoga@mail.tsinghua.edu.ca 高等学校化学学报V0l_29 前列腺中睾酮及双氢睾酮浓度变化,得出两种治疗手段对前列腺中睾酮和双氢睾酮代谢影响.’ 1实验部分 1.1仪器与试剂 CP一3800气相色谱仪及Saturn2200质谱仪(Varian公司,美国).固相萃取柱(WatersHLB,美国). 低温高速离心机(Hettich公司,德国). 脱氢表雄酮(DHEA,Sigma公司,美国);双氢睾酮(DHT,TCI—EP公司,日本);睾酮(T,Acros公 司,美国);七氟丁酸酐(HFBA,Avocado,美国);甲醇(色谱纯,Fisher公司).丙酮经过无水硫酸钠处 理.水为MilliQ纯水系统制备. 1.2实验过程 1.2.1气相色谱质谱条件VarianVF-5色谱柱(30m×0.25mm×0.25Ixm),不分流进样,载气为 He气,流速1.0mL/min,进样口恒温280?,自动进样,进样量1ILL.色谱柱初始温度95?保持 5min,以10~C/min程序升温至270?,再以3~/min速度升温至280?后保持3rain. 选择EI-MRM方法(图2).睾酮母离子选择为在EI.MS模式下的基峰467ainu,二级质谱轰击电压 0.54V,定量离子451amu;双氢睾酮母离子选择600DHEA 为在EI—MS模式下的基峰414amu,二级质谱轰击喜:[TJ1DHT电压 0.60V,定量离子399amu;脱氢表雄酮母离丢300lnJI8 子选择为在EI—Ms模式下的基峰270amu,二级质呈2l0【l(10}flJ\7\\,,谱轰击电压0.53V,定量离子199amu.扫描质量0l- 范围70,500amu,扫描时间0.44s/scan,灯丝电21.021.5.拿. 流6OA,电子倍增器200V.离子阱温度设为Fig.2MasschromatographyofT,DHEAand 200?,传输线温度270qC,电子倍增器温度DHTinprostatetissue 40qC. 0.5g前列腺组织经过超声破碎,固相萃取其中甾体激素,并利用HFBA衍生后,采用GC.MRM 模式对其中睾酮,脱氢表雄酮和双氢睾酮进行测定. 1.2.2样品收集与前处理将25只体重为(200?10)g的正常雄性SD大鼠按照时间分为术后1个 月,2个月各l0只和3个月5只三组,均对其进行摘除睾丸手术.1个月和2个月组内7只同时灌喂 5还原酶抑制剂.大鼠在1mL0.5%的水合氯醛麻醉下取出前列腺,并放于液氮罐中保存. 将样品复融后,精确称量约0.5g左右组织,将组织剪碎,加入2mL甲醇,超声破碎180S(工作 6S,停9S).以6000r/rain的速度离心10min,取上清液.在沉淀中加入1mL甲醇,涡旋30S,以 6000r/rain的速度离心10min,合并上清液.在上清液中加入3mIMilliQ超纯水,在事先用2mL甲 醇,2mL水及2mL体积分数为50%的甲醇水溶液处理活化过的WatersHLB固相萃取小柱上上样,流 速1,2滴/s.然后依次用1mL体积分数为50%,70%及100%的甲醇进行洗脱,收集100%甲醇洗脱 液.将收集的洗脱液于45下用氮气吹干.用200L无水丙酮复溶,加入20L七氟丁酸酐进行衍 生,于45?下反应30rain.反应完毕,用N:气吹干,再用200L正己烷复溶. 2结果与讨论 2.1方法学考察 2.1.1日间日内精密度取20只正常大鼠的前列腺组织混匀后,分为20份,每份0.5g.分别将5, 10及50ng/mL的混合品溶液分别加入到样品(/7.=3)中做加样回收率实验,以一份空白前列腺组 织样品经过前处理步骤后进行测量计算.日内精密度是将100ILL的5,10及50ng/mL的混合标准品 加入到样品中,按照前处理方法处理后,每个样品在1d中不同时间测量3次;日间精密度计算是将 =3),按照前处理步骤处理后,连续3d 5,10,50nmL的混合标准品加入到样品中(凡 进行测定.结 果表明,日内精密度RSD(%)均小于7%,日间精密度RSD(%)均小于12%.由于所测激素为内源性 陈君等:利用GC/MRM检测去势大鼠前列腺中睾酮,双氢睾酮和脱氢表雄酮 物质,计算回收率时必须扣除空白组织中的激素含量,加标样的测量浓度项为原始测定浓度. 按照下式计算回收率: 回收率(%)=[(加样测定浓度一空白组织浓度)/加样浓度]X100% 计算所得结果如表1所示. Table1RecoveryofT,DHTandDHEA SampleSpikedconcentration/(ng-mL)(n=3)P(Found)/(ng?mL)RSD(%) T0l8.35?0.57 54.45-4-0.25 l08.82?0.37 5046.6?2.15 DHT015.23?0.94 54.71?O.29 108.59?0.40 5045.1?2.60 DHEA0l6.61?0.67 54.36?O.27 l08.87?0.36 5046.3?2.3l 3.12 5.53 4.20 4.61 6.14 6.10 4.63 5.78 4.o6 6.22 4.O6 5.OO 2.1.2固相萃取回收率及稳定性通过比较100rig/mL标准品溶液经过固相萃取操作和不经过固相 萃取操作得到的峰面积,得出睾酮,双氢睾酮及脱氢表雄酮的固相萃取回收率均达到90%以上.通过 对100ng/mL标准品混合溶液处理衍生后,在0,12和24h内重复测定衍生后化合物的稳定性.结果 显示,衍生后化合物在室温下24h内稳定,睾酮,双氢睾酮及脱氢表雄酮的RSD(%)分别为6.47%, 5.80%和0.14%. 2.1.3标准曲线将质量浓度均为1mg/mL的睾酮,双氢睾酮及脱氢表雄酮混溶于甲醇中,于 一 20o【=保存.标准工作曲线质量浓度均为1,2,5,10,20,30和50ng/mL.定量分析采用外标法.以 标准溶液的峰面积对浓度作图得到标准曲线.睾酮,双氢睾酮及脱氢表雄酮的标准曲线列在表2中 Table2StandardcurveofT,DHT,andDHEA 2.2去势大鼠前列腺中睾酮,双氢睾酮及脱氢表雄酮的测定 去势大鼠按照时间分为术后1个月,2个月及3个月3组.其中1个月和2个月组中去势并给予 5还原酶抑制剂药物大鼠各7只,仅去势大鼠各3只;3个月组为仅去势3个月大鼠5只. 睾酮由睾丸分泌经过血液循环到达前列腺,并在其中转化为双氢 在正常大鼠中, 睾酮与雄性激素 受体结合来发挥作用.去势手术切除了睾酮主要来源睾丸,临床上一直认为去势后前列腺中睾酮和双 氢睾酮将出现下降.本实验结果也证实,去势3个月时确实表现出下降的趋势(图3).由图3可见,去 lMon【l12Month3Month Timeafteremasculation Fig.3VarietyofT,DHT,andDHEAinemasc~ated ratSprostatein3months Theerrorhatsarethemaxinnmandminimum. afterandwithdrugafterandwithdrug emasculationforlmortthemasculationforlmonth Fig.4Impactof5areductaseontheandrogens metabolisminemasc~atedratSprostate TheelTorharsarethemaxinumandminimum. O22—392—375 眇髂一舛?一盯鼹 高等学校化学学报 势后,睾酮和双氢睾酮出现一个先升后降的过程,而脱氢表雄酮却出现的是先降后升的过程.不过在 去势两个月时还存在一个短暂的上升过程.前列腺中的雄性激素,一半来源于睾丸分泌的睾酮,还有 一 半来源于肾上腺分泌的脱氢表雄酮.脱氢表雄酮在前列腺中能够通过17flHSDm氧化转化为睾酮. 本课题组之前的工作中已经证明,去势后,肾上腺在1个月内存在一个应激性增加分泌脱氢表雄酮的 能力,而后肾上腺表现出失代偿现象.而当.肾上腺出现失代偿时,前列腺表现出对脱氢表雄酮合成能 力的代偿性增加. 对于去势并给药2个月组,虽然此时来源于睾丸和.肾上腺的雄性激素已大幅度下降,由于前列腺 自身对脱氢表雄酮表现出合成能力,使得前列腺中雄性激素的代谢并未在此时停止.5还原酶抑制剂 主要作用是抑制睾酮向双氢睾酮的转变,去势2个月时,给予5还原酶抑制剂组睾酮和双氢睾酮含 量要低于对照组,而脱氢表雄酮的含量要高于对照组(图4).由图4可见,去势并给药1个月与仅去 势组激素含量并没有太大区别,但给药2个月组与仅去势2个月组,睾酮和双氢睾酮含量明显降低, 而脱氢表雄酮含量略有上升.由于5还原酶抑制剂在术后2个月已表现出明显抑制双氢睾酮合成的 作用,同样就减少了脱氢表雄酮向睾酮的转变,于是表现出给药组脱氢表雄酮高于对照组,而睾酮和 双氢睾酮低于对照组.给药2个月组3种激素含量均低于给药1个月组,说明持续给予5还原酶抑制 剂抑制睾酮向双氢睾酮的转变也将影响到脱氢表雄酮转变为睾酮的代谢,甚至影响脱氢表雄酮的合成 代谢. 参考文献 [1]HellerstedtB.A.,PientaK..ACancerJ.Clinicians_[J],2002,52:154—179 [2]ProstateCancerTrialwastsCollaborativeGroup.Lancet.[J],2000,355:1491—1498 [3]SmetsF.,VanhoenackereC.,PottieG..Ana1.Chim.Acta[J],1993,275:l47—162 [4]LookL.V.,DeschuytereP.,PetegheinC.V..J.Chromatogr.[J],1989,489:2l3_2l8 [5]ImpensS.,CouaheynD.,WaschK.D.,eta1..Ana1.Chim.Acta[J],2003,483:269—28O [6]HamoirT.,CouaheynD.,deBrabanderH.,eta1..Analyst[J],1998,123:2621--2624 [7]KaklamanosG.,TheodoridisG.,IoannisN.P.,eta1..J.Agne.FoodChem.[J],2007,55:83 25--8330 [8]LabileF.,Luu—TheV.,B61angerA..J.Endocrinol[J],2005,187:169—174 [9]WANGWan(王琬),HEYong-Xin(何永鑫),CHENJun(陈君).Chem.J.ChineseUniversities(高等学校化学学报)[J],2008 29(7):1349—1351 DetectionofTestosterone,:Dihydr0test0sterOne,Dehydr0epiandr0ster0ne inEmasculatedRatProstatev/aGC/MRM CHENJun,LIANGQiong.Lin,LIHui,LUOGuo.An,WANGYi.Ming (1.DepartmentofChemistry,TsinghuaUniversity,Belting100084,China; 2.InstituteofUrology,TheFirstHospitalofPekingUniversity,PekingUniversity,Beijing1 00034,China) AbstractProstatecancerisacommonmalignancyinmen.Forprostatedependentonandrogenforgrowth, orchiectomyisadoptedinclinicaltherapyalongwithmedicinesaimedtorestrainthesynthesisandsecretionof androgensinadrena1.ThefunctionofadrenalandrogenisnotcleartillnOW,therefore,itneedsmore considerationonhowtooperatethetherapyproperly.WeestablishedaGC/MRMmethodforthedetectionof androgensintissuesample,bywhi(‘hwemonitoredtheconcentrationofandrogensinemasculatedrat.Itis shownthattheinfluenceofadrenalandrogenonthehormonemetabolisminprostateexistedviathisexperi— ment. KeywordsProstate;Androgen;Gaschromatography—Massspectrometry (Ed.:A,G)