滇藏荨麻提取物的5α还原酶抑制活性的研究_25251

滇藏荨麻提取物的5α还原酶抑制活性的研究_25251 滇藏荨麻提取物的5α ====================================================================== 作者:王炜 冀保全 唐玲 史丽颖 冯宝民 王永奇 【摘要】 目的研究滇藏荨麻提取物各极性部位的5α-还原酶抑制活性。 方法基于酶联免疫方法，建立抑制5α-还原酶体外模型，从大鼠前列腺组织中 提取5α-还原酶，与底物睾酮以及供氢体NADPH共同组成了一种微量反应体 (DHT)的含量。以DHT的含量来判断5α-还原酶系。利用酶标仪检测双氢睾酮 的活性，用非那雄胺做阳性对照药。结果滇藏荨麻根95%乙醇提取物的正丁醇 萃取物具有显著的抑制5α-还原酶的活性。结论滇藏荨麻根95%乙醇提取物的 正丁醇萃取物为抗BPH的有效部位。 【关键词】 5α-还原酶 滇藏荨麻 双氢睾酮 前列腺肥大 酶联免疫 Abstract:ObjectiveTo study the inhibitory effect of all kinds of constituents in Untica mairei Levl's extract on 5α-reductase activity. MethodsThe 5α-reductase inhibitor's model in vitro was established which were composed of the 5α-reductase extracted from the prostates of male rats, testosterone (as a substrate) and NADPH (as a hydrogen supplier). The concentration of DHT which measured by ELISA could show the activity of enzyme. The specificity of 5α- reductase was judged with finasteride as a positive control. ResultsThe result showed the n-butanol extractant in the extract of Untica mairei Levl's roots which extract by 95% alcohol could inhibit the activity of the 5α-redutase remarkably.Conclusionn-butanol extractant in the extract of Untica mairei Levl's roots which extracted by 95% alcohol is the effective part, which can resist BPH. Key words:5α-reductase; Untica mairei Levl; Dihydrotestosterone(DHT); Benige prostaticHyperplasia; Enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) 良性前列腺肥大症(Benign Prostatic Hyperp lasia, BPH)属于常见男性 疾病之一。据临床医学统计数字明BPH为多发病之一。50岁以上的男性中 BPH的发病率约为40%,50%，65岁以上男性中BPH的发病率高达60%,65%,而 70岁以上约90%,1,2,。患有BPH症的病人,因肥大的前列腺组织压迫尿道而 引起小便不畅,排尿困难,尿频尿急,尿液残留等症状，更严重者甚至会引起尿潴 留,必须进行插管导尿术,病人十分痛苦。 目前,荨麻制剂在国外,特别是在德国已被广泛应用。大荨麻Untica dioica L.根提取物不仅用于BPH的治疗,也用于预防,3,。大荨麻作为天然药 物治疗BPH，为避免手术及西药的副作用提供了新的安全可靠的途径,4， 5,。 我们曾对国产的8种荨麻属植物根的不同提取物进行了抗BPH的筛选，结果表明滇藏荨麻Untica mairei Levl.和荨麻Untica fissa Pritz.根的20%和95%乙醇提取物具有强的抗BPH的作用,3,。为了进一步明确其有效部位，我们以5α-还原酶为作用靶点，采用酶联免疫法(ELISA)，对滇藏荨麻根的95%乙醇提取物进行了梯度极性溶媒萃取，并对不同极性组分进行了抑制5α-还原酶的活性研究。 甾体5α-还原酶是定位于靶细胞微粒体上的膜蛋白，依赖还原型辅酶 )转化为生理活性更强的双氢睾II(NADPH)作为供氢体，不可逆地催化睾酮(T 酮(DHT),6,，DHT被认为是BPH的主要病因。抑制酶活性，减少DHT的生成，已成为非手术治疗BPH的主要途径。 本次实验首先建立反应体系，利用生成的DHT与HRP(辣根过氧化物酶)标记的DHT竞争结合酶标板上的抗DHT抗体，通过颜色反应所测定的吸光值，最终换算为DHT的浓度，从而考察不同组分对5α-还原酶活性的影响。 1 1.1 药品与试剂非那雄胺(保列治)，Merck Sharp & Dohme(U.K.) Ltd，批号J20050041;睾酮，上海久邦化工公司，批号20051106;NADPH，Biosharp 公司，批号041939;DHT双氢睾酮试剂盒 ADL公司，批号10-9031;其他化学试剂都为国产分析纯。 1.2 仪器 酶标仪(型号:RT-2100C，深圳雷社生命科学股份有限公司);数显不锈钢电热培养箱(型号:HPX-9272MBE，上海博迅实业有限公司医疗设备厂);台式高速冷冻离心机(型号:Biofuge prime，R Heraeus 公司);ALPHA1-4型冷冻干燥机(CHRIST公司);微量振荡器(型号:MODEL MM-1 上海无线电仪器厂);数显恒温水浴锅(型号:HH-2 常州国华电器公司)。 2 方法 2.1 还原酶的制备雄性SD大鼠3只，体重(200?10)g，大连医科大学实验动物中心提供)，禁食不禁水过夜处死，迅速取出腹侧的前列腺组织在冰台上剪碎，用预冷的匀浆液(蔗糖0.73 mol?L-1氯化钙1.91 mmol?L-1)在玻璃匀浆器中匀浆,7,，在4?下以10 000 r?mim-1低温高速离心20 min，取上清液再以16 000 r?mim-1低温高速离心30 min，即为5α-还原酶提取物。采用lowry法测定蛋白含量，以酶提物中的总蛋白含量表示5α-还原酶提取物的含量，将提取物放入小离心管在-70?下保存，备用。 2.2 样品制备取滇藏荨麻根100 g,粉碎，95%乙醇回流提取3次，1 h/次。将提取液浓缩至干浸膏。将95%乙醇提取物分别用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取，得石油醚萃取物、醋酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水层部分。另取滇藏荨麻根50 g,粉碎，20%乙醇冷浸，第1次24 h，第2，3次12 h。将提 取液浓缩至干浸膏。 将各组分分别用50%乙醇配置成4 mg?ml-1工作溶液。按照“2.3”项中的操作向酶反应体系中加入。酶促反应后测定其OD值。 2.3 酶促反应体系的建立及DHT的定量测定5α-还原酶活性测定方法参照文献,7~9,，并参照对荧光法测定5α-还原酶反应的底物、NADPH和反应酶的浓度以及反应温度和反应时间等摸索的条件略加修改。操作分两部分完成，即?将反应成分依照先后顺序(缓冲液，37?恒温;睾酮;样品及阳性对照药;NADPH;酶组织液)加入96孔板内，使之微量化，设置不同反应孔和对照孔板。反应温度为37?(相对饱和湿度)，反应时间为60 min;?采用ELISA法定量测定产物DHT，以产物的生成量大小反映酶活性的强弱。受试样品管中DHT的含量低于酶反应管中DHT含量时，则视为具有抑制5α-还原酶的活性。检测方法及计算参照试剂盒使用说明进行。所有实验孔均为双复孔操作。在已经确定的反应体系基础上，辅酶NADPH浓度为1 mmol?L-1，睾酮浓度为0.5 1，结合试剂盒微量测定的特点，将整个反应体系的总量定为μmol?L- 200μl。反应体系中各组分的比例见表1。 酶反应体系中各组分的原始浓度分别为:缓冲溶液(PBS 20 mmol?L-1， 1，EDTANa2 1 mmol?L-1,pH值6.8);NADPH浓度(20 蔗糖0.2 mol?L- mmol?L-1);粗酶浓度(4.3 mg?ml-1);睾酮浓度(20 μmol?L-1);非那雄胺(1.3 mmol?L-1)。 表1 5α-还原酶反应体系的组成(略) 3 结果 3.1 ELISA显色反应双氢睾酮(DHT)系列品的浓度分别为:0，2.5，5，10，25，50 ng?ml-1酶标板读取的OD值依次为:0.199，0.726，1.085，1.713，2.561，2.832以OD值为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标，绘制标准曲线。结果见图1。 图1 ELISA显色反应标准曲线(略) 3.2 对5α-还原酶活性的影响将样品测得的OD值代入回归方程，计算所得的DHT的含量。结果见图2。 从图2可以看出滇藏荨麻根95%乙醇提取物的正丁醇萃取物有明显的抑制5α-还原酶的活性，而石油醚萃取物及20%乙醇提取物表现出弱的活性，其他受试样品则均未表现出抑制作用。 图2 滇藏荨麻提取物对5α-还原酶活性的影响(略) 4 讨论 我们选取5α-还原酶的抑制作用为指标，是因为5α-还原酶是睾酮向双氢 睾酮转化的关键酶，而双氢睾酮是导致前列腺肥大症的重要因素。在老年人体 内血清睾酮明显下降，但前列腺内雄激素仍然很高。其中90%为双氢睾酮 (DHT)，为睾酮在前列腺内经5α-还原酶作用的代谢产物。人类前列腺的生 长和发育有赖于双氢睾酮，因此阻断睾酮向双氢睾酮转化，降低血清中双氢睾 酮水平，可抑制前列腺增生，缩小前列腺体积，增加尿流量，改善梗阻症状。 通过以上实验得出，滇藏荨麻根95%乙醇提取物的正丁醇萃取物有明显的抑制 5α-还原酶的活性，与阳性对照药对比分析，确认滇藏荨麻根95%乙醇提取物 的正丁醇萃取物为抗BPH的有效部位，其有效成分的研究仍在进行中。 【参考文献】 ,1, 李 飞. 良性前列腺增生治疗药研究进展,J,.药学进展， 1995, 19 (4) : 193. ,2, 徐积恩. 良性前列腺增生治疗药普甾胺,J,.国外医学?合成 生化药制剂分册，1995，16(4):240. 药? ,3, 王永奇.荨麻属植物治疗BPH研究概况,J,.大连大学学报，2005， 26(2):54. ,4, 翁玲玲. 国外正在研制的甾体药,J,.中国药学杂志，1994， 29(3):174. ,5, 解红武. 良性前列腺增生的药物治疗,J,.天津药学， 2002， 14(3):15. ,6, Metcalf B W，Holt D A，Levy MA. et al. 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