免疫组化

免疫组化 免疫组化实验步骤 1 仪器设备 (1)18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉; (2)水浴锅 2 试剂 (1)PBS缓冲液(pH7.2,7.4):NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。 (2)0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(CB，pH6.0，1000ml):柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。 (3)0.5mol/L EDTA缓冲液(pH8.0):700ml水中溶解186.1gEDTA?2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。 (4)1mol/L的TBS缓冲液(pH8.0):在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。 (5)酶消化液: a、0.1%胰蛋白酶液:用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液:用0.1N的HCl配制。 (6)3%甲醇-H2O2溶液:用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。 (7)封裱剂: a 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液(pH9.0,9.5)等量混合; b 油和TBS(或PBS)配制。 (8)TBS/PBS pH9.0,9.5，适用于荧光显微镜标本;pH7.0,7.4适合于光学显微镜标本。 3 操作流程 (1)脱蜡和水化 脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60?恒温箱中烘烤20分钟。 1)组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟; 2)无水乙醇中浸泡5分钟; 3)95%乙醇中浸泡5分钟; 4)70%乙醇中浸泡5分钟; (2)抗原修复 用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。 1)抗原热修复 在沸水中加入EDTA(pH8.0)或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本适用于较难检测或核抗原的抗原修复。 2)煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至95?左右，放入组织芯片加热10~15分钟。 3)微波热修复 在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。适用的抗原有:AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，Topoismerase?等。 4)酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37?，切片也预热至37?，消化时间约为5~30分钟;胃蛋白酶消化37?时间为30分钟。适用于 被固定遮避的抗原，其中有:Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN 等。 (3)免疫组织化学染色 SP法 1)脱蜡、水化; 2) PBS洗2,3次各5分钟; 3)3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上，室温静置10分钟 4)PBS洗2,3次各5分钟; 5)抗原修复; 6)PBS洗2,3次各5分钟; 7)滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。 8)滴加?抗50μl，室温静置1小时或者4?过夜或者37?1小时。 9)4?过夜后需在37?复温45分钟。 10)PBS洗3次各5分钟; 11)滴加?抗40,50μl，室温静置，或37?1小时; 12)抗中可加入0.05%的tween-20。 13)BS洗3次各5分钟; 14)DAB显色5,10分钟，在显微镜下掌握染色程度; 15)PBS或自来水冲洗10分钟; 16)苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化; 17)自来水冲洗10,15分钟; 18)脱水、透明、封片、镜检。 SABC法 1)脱蜡、水化。 2)PBS洗两次各5分钟。 3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5,10分钟，蒸馏水洗3次。 4) 抗原修复。 5) PBS洗5分钟。 6) 滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。 7) 滴加?抗,室温1小时或者4?过夜或者37?1小时(4?过夜后在37?复温45 分钟)。 8) PBS洗三次每次2分钟。 9) 滴加生物素化二抗,20?,37?20分钟。 10)PBC洗3次每次2分钟。 11)滴加试剂SABC，20?,37?20分钟。 实验动物的标记 第一、常用的标号方法及其优缺点 实验动物在运来之后，要经历什么样的步骤呢, 首先，要确认品系、雌雄、数量，并观察有无不良状态。这相当于一般商品交易中的“验货”环节。 第二，要进行适应性喂养。在此期间只需按雌雄分笼，每笼饲养适当数目即可。这个时间至少三天，多则一周。在前面的专中已有述及。 第三，对动物进行标号。有多种方法，下面将一一具体介绍。 第四，随机分组。注意，不是随机分组再标号，而是标号后再分组。因为没有标号是没法随机的。 第五，进行实验处理。从这里开始，才是真正进入主题的实验了。包括造模、给药、手术等等处理。 下面我们就先来讲讲编号的方法。 标号是动物实验中非常重要的一项工作。因为一个实验中的动物品系一样、生物学特征基本无差异，不进行标号就没法识别。这样，实验也就无从进行。标号就是为了对实验动物“了如指掌”，便于和检测。标号方法应保证不对动物生理或实验反应产生影响，且号码清楚、易认、耐久和适用。标号一般借助于动物本身的一些特征来进行，如:被毛、脚趾、耳朵等;也可以辅助器具来进行，如:金属环或牌;也可以给单笼饲养的动物笼具编号以便识别。 目前常用的标记编号方法有染色法、耳孔法、烙印法、挂牌法等。此外还有断趾法、剪尾法、被毛剪号法、笼子编号法等。 A 染色法 染色法是用化学物质在实验动物身体明显的部位，如被毛、四肢等处进行涂染，以染色部位、颜色不同来标记区分实验动物，是最常用、最易掌握的经济方法。据染液的不同，可染成黄色、红色、咖啡色、黑色等。此法适合于被毛白色的动物，如:大鼠、小鼠。但像C57小鼠为黑色或褐色，则不宜用。 B(耳孔法 耳孔法是用打孔机直接在实验动物的耳朵上打孔编号，根据打在动物耳朵上的部位和孔的多少，来区分实验动物的方法。用打孔机在耳朵打孔后，必须用消毒过的滑石粉抹在打孔局部，以免伤口愈合过程中将耳孔闭合。耳孔法可标记三位数之内的号码。另一种耳孔法是用剪刀在实验动物的耳郭上剪缺口的方法，作为区分实验动物的标记。如:兔。 C(烙印法 烙印法是直接把标记编号烙印在实验动物身体上，尤如盖印章一样。烙印方法有两种，对狗等大动物，可将标记号码烙印在其皮肤上(如耳、面、鼻、四肢等部位)，对家兔、豚鼠等动物，可用数字号码钳在其耳朵上刺上号码;烙印完成后，伤口涂抹酒精黑墨等颜料，即可清楚读出号码。烙印法对实验动物会造成轻微损伤，操作时宜轻巧、敏捷，必要时麻醉， 以减少痛苦。 D(挂牌法 挂牌法是将编好的号码烙印在金属牌上，挂在实验动物颈部、耳部、肢体或笼具上，用来区别实验动物的一种方法。金属牌应选用不生锈、刺激小的金属材料，制成轻巧、美观的小牌子。 我们可根据实验动物品种、实验类型及实验方式，选择合适的标记编号方法。一般来说，大、小鼠多采用染色法，家兔宜使用耳孔法，狗、猴、猫较适合挂牌法，狗还可用烙印法。 E 其它方法 断趾法:剪去的一部分脚趾可渐渐长合，因此，不是太好分辨。 剪尾法:有损伤。 被毛剪号法:适合标号数字较小的，一般在,以内的数字。 笼子编号法:适合于单笼饲养的动物。 二、常用的染色剂及大、小鼠染色方法 常用染色剂如下: (1)3% ~ 5%苦味酸溶液(即,，,，,,三硝基苯酚)，因与动物的被毛中的蛋白发生反应，可染成较为牢固的亮黄色。可用水，也可用一定浓度的乙醇来配制。 (2)0.5% 中性红或品红溶液,可染成红色。 (3)2%硝酸银溶液，涂染后在可见光下暴露十分钟左右可染成咖啡色。 (4)煤焦油乙醇溶液，可染成黑色。 染色法适用于被毛白色的实验动物，如:大鼠、小鼠等。 涂染方法: ,单色涂染法 单色涂染法是用单一颜色的染色剂涂染实验动物不同部位的方法。常用的就是苦味酸，或者品红。也有用苦味酸标雄性，品红标雌性的。均可。 根据个人习惯及不同的传统，可有多种不同的编号方法。当前的编号方法可谓林林总总，新的“发明创造”很多。甚至一个实验室不同的人做实验，编号方法完全不一样。但，在此，我想提醒大家一下:同一个实验室，标号方法最好统一。众所周知，药理实验一般都是要靠两个及以上的多人合作才能完成，非常需要协作精神。而如果参与实验的人对其中一个的编号方法不熟悉，就可能导致误拿，或者降低工作效率。因此，统一编号是非常重要的。 在此，我介绍一种本人长期使用的编号方法。这也是《医学科研导论》一书中推荐使用的方法。优点是:可编1~999之间的号码，且标志明显，易学易用，对于统一编号很有参考价值。适合于小鼠、大鼠、豚鼠的编号。 如图，以小鼠为例。以俯视图来看，右侧为个位，耳朵下示“,”，右前肢表示表示“,”，右腹侧表示“,”，右后肢表示“,”;同样，左侧表示十位，其余与右侧一样;中间表示百位，两耳之间表示“,”，两前肢中间表示“,”，背正中表示“,”，尾椎处表示“,”。其余数字由上述数字进行组合，如:,,,，,，,,,，,，,,,，,，,,,，,，,,,，,。但“,”不能由“,，,”来表示，因为本身就有。因此，不可能出现耳朵和前肢同时有标记的现象，也不可能出现在同一侧有三处标记的现象。 如:48，则在左侧耳下及腹部各标一点，在右侧前、后肢各标一点。 我想，大家应不难根据上述规则读出下图最右侧图中标记的小鼠的编号。 此法的优点就是清晰易辩，可编号码数多;缺点就是因涂染点较多，故涂染时要牢固，如不太清晰，隔一定时间要加染。 有人喜欢把每一笼中的动物分别标为,，,，,，,等等。个人觉得这样不可取。 一则，这样的标号肯定是没有进行随机分组的。二则，做实验时一不小心就全乱套了。 2双色涂染法 双色涂染法是采用两种颜色同时进行染色标记的方法。例如用苦味酸(黄色)染色标记作为个位数，用品红(红色)染色标记作为十位数。此法略嫌烦杂。一般不太用。 3直接标号法 直接标号法是使用染色剂直接在实验动物被毛、肢体上编写号码的方法。偶用。 染色法虽然简单方便，不会给实验动物造成损伤和痛苦，但是长时间实验会使涂染剂自行褪色，或由于实验动物互相嬉闹、舔毛、摩擦、换毛、粪尿和饮水浸湿被毛等原因，易造成染色标记模糊不清。因而用于慢性实验时，要注意不断地补充和加深染色。一般而言，半个月左右加深一次效果不错。当然，也可以视情况随时补充。 另外，常用染色剂的毒性对实验动物的影响也是需要注意的一个问题。 STZ配置 1.柠檬酸缓冲液的配制: 柠 檬 酸(FW:210.14) 2.1g加入双蒸水100mL中配成A液 柠檬酸钠(FW:294.10)2.94g加入双蒸水100mL中配成B液 链脲佐菌素配制液:用时将A、B液按一定比例混合(1:1.32也有按1:1的)，PH计测定ph值,调节ph=4.2-4.5,即是所需配置STZ的柠檬酸缓冲液。 注射时用柠檬酸缓冲液以1%的浓度溶解STZ，按空腹体重注射相应的STZ， 在30分钟内注射完毕。? STZ容易失活, STZ快速称取后仍要求干燥避光，推荐用干燥铝箔(或锡箔)纸。 2.STZ的保存方法 2-8?，干燥避光保存。(注:本品易潮解,如需反复取量过程中，应避免接触其受水受潮，受潮后30分钟后失效，这和注射时要求其快速注射是一个道理，即其水溶液不稳定)。 3.多次称取STZ时的操作方法和注意事项 如确实需要多次称取，要严格按照避免受潮的原则操作和存放。 操作方法:操作环境、盛装容器、分装工具都必须保证干燥。无需冰浴，分装后用封口膜密封瓶口，用铝箔纸(或锡箔，即避光)将瓶子包好，放入干燥罐里(干燥剂，即保持干燥状态)， 并2-8?冷藏，可长期保存。本品保质期为3年半。 链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)对机体组织毒性相对较小，动物存活率高，是目前国内外使用较多的制备糖尿病动物模型的药物。