分光光度法 它是利用物质的分子或离子对某一波长范围的光的吸收

分光光度法 它是利用物质的分子或离子对某一波长范围的光的吸收 分光光度法 它是利用物质的分子或离子对某一波长范围的光的吸收作用对物质进行定性分析、定量分析及结构分析的方法 所依据的光谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的光而产生的吸收光谱。按所吸收光的波长区域不同分为紫外分光光度法和可见分光光度法合称为紫外-可见分光光度法。 1. 紫外-可见分光光度法的特点 A 与其它光谱分析方法相比其仪器设备和操作都比较简单费用少分析速度快 B 灵敏度高 C 选择性好 D 精密度和准确度较高 E 用途广泛。 2. 紫外-可见吸收光谱 2.1 物质对光的选择性吸收 物质对光的吸收是选择性的利用被测物质对某波长的光的吸收来了解物质的特性这就是光谱法的基础。 通过测定被测物质对不同波长的光的吸收强度吸光度以波长为横坐标吸光度为纵坐标作图得出该物质在测定波长范围的吸收曲线。 在吸收曲线中通常选用最大吸收波长λmax进行物质含量的测定。 2.2 有机化合物的紫外-可见吸收光谱 2.2.1 有机化合物的电子跃迁 与紫外-可见吸收光谱有关的电子有三种即形成单键的σ电子、形成双键的π电子以及未参与成键的n电子。 跃迁类型有σ σ、n σ 、π π 、n π 四种。 饱合有机化合物的电子跃迁类型为σ?σn?σ 跃迁吸收峰一般出现在真空紫外区吸收峰低于200nm实际应用价值不大。 不饱合机化合物的电子跃迁类型为n?ππ?π 跃迁吸收峰一般大于200 nm。 生色团是指分子中可以吸收光子而产生电子跃迁的原子基团。人们通常将能吸收紫外、可见光的原子团或结构系统定义为生色团。见表3-1和3-2。 助色团是指带有非键电子对的基团如-OH、-OR、-NHR、-SH、-Cl、-Br、-I等它们本身不能吸收大于200nm的光但是当它们与生色团相连时会使生色团的吸收峰向长波方向移动并且增加其吸收强度。见表3-4。 红移和紫移在有机化合物中常常因取代基的变更或溶剂的改变使其吸收带的最大吸收波长λmax发生移动。向长波方向移动称为红移表3-3向短波方向移动称为紫移。 2.2.2 有机化合物的吸收带 吸收带absorption band: 在紫外光谱中吸收峰在光谱中的波带位置。根据电子及分子轨道的种类可将吸收带分为四种类型。 1R吸收带 2K吸收带 3B吸收带 4E吸收带 3 无机化合物的紫外-可见吸收光谱 3.1 f电子跃迁吸收光谱 镧系和锕系元素的离子对紫外和可见光的吸收是基于内层f电子的跃迁而产生的。其紫外可见光谱为一些狭长的特征吸收峰这些峰几乎不受金属离子的配位环境的影响。 3.2 d电子跃迁吸收光谱 过渡金属的电子跃迁类型为d电子在不同d轨道间的跃迁吸收紫外或可见光谱。这些峰强烈受配位环境的影响。 例如 cu2以水为配位体吸收峰在794nm处而以氨为配位体吸收峰在663nm处。此类光谱吸收强度弱较少用于定量分析。 3.3 电荷迁移光谱 某些分子既是电子给体又是电子受体当电子受辐射能激发从给体外层轨道向受体跃迁时就会产生较强的吸收这种光谱称为电荷迁移光谱。如 苯酰基取代物在光作用下的异构反应。 4 影响紫外-可见吸收光谱的因素 物质的吸收光谱与测定条件有密切的关系。测定条件温度、溶剂极性、pH等不同吸收光谱的形状、吸收峰的位置、吸收强度等都可能发生变化。 4.1.温度 在室温范围内温度对吸收光谱的影响不大。 4.2 溶剂 注意如下几点 1尽量选用低极性溶剂 2能很好地溶解被测物并且形成的溶液具有良好的化学和光化学稳定性 3溶剂在样品的吸收光谱区无明显吸收。 4.3 pH值 5 紫外-可见吸收光谱的应用 紫外-可见吸收光谱除主要可用于物质的定量分析外还可以用于物质的定性分析、纯度鉴定、结构分析。 5.1 定性分析 5.2 纯度的鉴定 用紫外吸收光谱确定试样的纯度是比较方便的。如蛋白质与核酸的纯度分析中可用A280/A260的比值鉴定其纯度。 5.3 结构分析 紫外-可见吸收光谱一般不用于化合物的结构分析 但利用紫外吸收光谱鉴定化合物中的共轭结构和芳环结构还是有一定价值。例如某化合物在近紫外区内无吸收说明该物质无共轭结构和芳香结构。 6. 朗伯-比尔定律 6.1 吸光度和透光度 设入射光强度为I0吸收光强度为Ia透射光强度为 It反射光强度为Ir则 I0 Ia It Ir 由于反射光强度基本相同其影响可相互抵消上式可简化为 I0 Ia It 透光度透光度为透过光的强度It与入射光强度I0之比用T表示 即 T It/I0 吸光度: 为透光度倒数的对数用A表示 即 Alg1/TlgI0/It 6.2 朗伯-比尔定律 朗伯-比尔定律当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时溶液的吸光度与吸光物质浓度、液层厚度乘积成正比即 A κ cl 式中比例常数κ与吸光物质的本性入射光波长及温度等因素有关。c为吸光物质浓度l为透光液层厚度。 朗伯-比尔定律是紫外-可见分光光度法的理论基础。 6.3 吸光系数 当l以cmc以g/L为单位κ称为吸光系数用 a表示。A a cl a的单位为L/g.cm 摩尔吸光系数 当l以cmc以mol/L为单位κ称为摩尔吸光系数用 ε表示。 ε的单位为L/mol.cm它表示物质的浓度为1mol/L液层厚度为1cm时溶液的吸光度。 比吸光系数 比吸光系数是指百分含量为1 l为1cm时的吸光度值用 表示。 6.4 1入射光为非单色光 2溶液的不均性。 实际样品的混浊偏离朗伯-比耳定律的因素 加入的保护胶体蒸馏水中的微生物存在散射以及共振发射等均可吸光质点的吸光特性变化大。 3光程的不一致性。 光源不是点光源比色皿光径长度不一致光学元件的缺陷引起的多次反射等均造成光径不一致从而与定律偏离。 7. 紫外-可见分光光度计 7.1 主要部件的性能与作用 基本结构: 光源?单色器?吸收池?检测器?信号 1光源 在紫外可见分光光度计中常用的光源有两类热辐射光源和气显示系统 样品 体放电光源 热辐射光源用于可见光区如钨灯和卤钨灯气体放电光源用于紫外光区如氢灯和氘灯。 2单色器 单色器的主要组成入射狭缝、出射狭缝、色散元件和准直镜等部分。 单色器质量的优劣主要决定于色散元件的质量。色散元件常用棱镜和光栅。 3吸收池 吸收池又称比色皿或比色杯按材料可分为玻璃吸收池和石英吸收池前者不能用于紫外区。 吸收池的种类很多其光径可在0.110cm之间其中以1cm光径吸收池最为常用。 4检测器 检测器的作用是检测光信号并将光信号转变为电信号。现今使用的分光光度计大11cmE111.0cmrEM多采用光电管或光电倍增管作为检测器。 5信号显示系统 常用的信号显示装置有直读检流计电位调节指零装置以及自动记录和数字显示装置等。 8 紫外-可见分光光度计的类型 按其光学系统可分为单波长分光光度计和双波长分光光度计。 8.1 单波长单光束分光光度计 目前国内广泛采用721型分光光度计。具有结构简单、价格低廉、操作方便、维修也比较容易适用于常规分析。 单波长单光束分光光度计还有国产751型、XG-125型、英国SP500型和伯克曼DU-8型等。 8.2 单波长双光束分光光度计 单波长双光束分光光度计有国产710型、730型、740型、日立UV-340型等就属于这种类型。 8.3 双波长分光光度计 双波长分光光度计的优点是可以在有背景干忧或共存组分吸收干忧的情况下对某组分进行定量测定。 国产WFZ800-5型、岛津UV-260型、UV-265型等。