小鼠分泌性蛋白的大规模鉴定与分析

小鼠分泌性蛋白的大规模鉴定与 小鼠分泌性蛋白的大规模鉴定与分析 蛋白质在胞浆内合成以后必须被运输到特定的位置才能发挥其功能，这个过程称为蛋白质的分拣(protein sorting)，该过程的实现依赖于蛋白质内部特定的序列组成——分选信号(sorting signal)，如分泌性蛋白的分泌过程有赖于蛋白质氨基端的前导肽(leader peptide) 的介导。根据蛋白质的这种性质，科学家们发展了一些有效的基因克隆系统，如信号肽捕获系统(signal sequence trap system,SST)[1，2];核定位信号筛选系统(Nuclear localization signal trap system,NLST)[3，4]等。 在以往的工作中，我们建立了suc2信号肽捕获(suc2-SST)系统 [5];并用所建立的系统对11天的小鼠胚胎cDNA文库进行筛选。初步的实验结果明:用该系统可以有效的进行分泌性蛋白的筛选 [6]。 然而在工作中我们也发现，虽然相对于其他的信号肽捕获系统来说，用该系统进行分泌性蛋白分子的筛选具有相对较高的效率，但是伴随着后基因组时代的到来，大规模cDNA测序计划的实施，生物信息技术的快速发展，包括小鼠在内的多种模式生物的基因已被(或将被)迅速鉴定，仍然使用单纯的生物学技术进行功能未知的分泌性蛋白分子的鉴定是很不经济的一种做法。本研究尝 试将传统的生物学技术(:ucZ一SST)与新兴的生物信息学技术结合起来，用于分泌性蛋白分子的大规模筛选。该方法首先从公共数据库中寻找用于分析的候选蛋白分子;然后选用两种发展相对完善的生物信息学预测程序对侯选序列进行信号肤和亚细胞定位的预测分析，筛选可能的分泌性蛋白分子;最后用sucZ一SST对预测得到的分子在酵母中进行验证。 预实验中，用计算机从1000多个候选的小鼠假想蛋白(勿Potheticalprotein)中得到了50个可能的分泌性蛋白分子，从中随机挑选13个分子用sucZ信号肚捕获系统进行验证，结果显示所有的分子都各含有一个有功能的信号肤，进一步在哺乳动物细胞中，用激光共聚焦显微镜观察了其中两个分子 (HYP3 2、HYP36)的亚细胞定位，证明这两个分子都定位于细胞分泌途径中。提示用计算机分析结合sucZ一SST的策略是一种可靠的方法， 可以用于分泌性蛋白分子的大规模、快速鉴定。 为了进行分泌性蛋白分子的自动化预测分析，我们与同事合作编写了一个整合的综合分析平台，并对现有公共数据库中的小鼠假想蛋白(勿 Potheticalprotein)进行了系统的分析，从47716条序列中共得到1329个分子携带有潜在的信号肤序列，占所有分析序列的 2.8%左右。 进一步对HYP36和HYP32进行了深入的分析。HYP36基因定位于小鼠第17号染色体C区，约 7.Okb，由n个外显子组成，可以转录生成至少4种转录本。所编码的蛋白质多肤N端含有一个24aa的疏水性信号肤，肤链中含有一个保守的M6P受体结构域，2个N一linked的糖基化位点，序列同源性检索提示该分子为小鼠N一乙酞葡萄糖氨基一1一磷酸转移酶Y亚单位[GlcNAe一l一hosPhotransferase r ehain(GenBank aeeession no.垄丛丝丝肚)』，该基因广泛表达小鼠各种组织、细胞;亚细胞定位分析显示，该分子主要定位于高尔基器;转染NIH一3T3细胞可以诱导细胞产生I一细胞(hiclusion Cells)表型:相差显微镜观察可见细胞中有很多胞质小泡，亚细胞结构观察显示细胞内出现大量脂滴，溶酶体大量增生，生化指标检测显示细胞内溶酶体酶(刀一葡—流。印4件解九,了粼‘而‘夕姗血a拓‘。麟如愉“田勿‘口 排班一举四军互大学俘士学徒论文201X万5萄糖醛酸昔酶和刀一半乳糖昔酶)的含量降低，细胞培养上清中溶酶体酶的含量上升，提示HYP36可能参与了细胞内溶酶体酶的分选过程。 既往研究表明人N一乙酞葡萄糖氨基一1一磷酸转移酶Y亚单位的突变可以导致mC型粘脂病(mucollpidosis)的发生，病人的成纤维细胞中含有很多细胞质小泡，小泡中有大量的未被消化的大分子，这些大分子在正常情况下是由溶酶体降解的.由于N一乙酞葡萄糖氨基一1一磷酸转移酶Y亚单位的突变使得溶酶体酶分子上的甘露糖不能够被磷酸化，导致大多数溶酶体酶(依赖于M6PR进行分选)不能正确地进入溶酶体，从而分泌到细胞外。最终导致卜细胞表型的产生以及外周血中溶酶体酶的水平升高，这与本研究中过表达的结果十分相似 [7];本研究的结果提示对于mC型粘脂病进行基因治疗时，除了要考虑常规基因治疗可能遇到的问题外，还要考虑诸如如何有效的控 制N一乙酸葡萄糖氨基一1一磷酸转移酶Y亚单位的表达水平以及选择哪种剪切拼接体进行表达的问题。 HYP32基因定位于小鼠第17号染色体长臂A 3.3区，全长约1 2.0kb，含有6个外显子，至少可以转录产生4种转录本。所编码的蛋白质分子为I型跨膜分子，N末端含有一段疏水性信号肤，胞外段含有一个免疫球蛋白样结构域，包内段由44氨基酸组成，没有发现ITIM、ITAM结构域。同源性检索提示HYP32与小鼠TREM3分子有较高的同源性，因此命名为mTLT3(TREMsliketransc如t3)。亚细胞定位显示HYP32定位于分泌途径，N。找hem Blot显示H仰32主要表达于脾脏和肝脏组织，Rl’- PCR结果表明HYP32在肾脏、肺脏、心脏和小肠也有低水平的表达，但在两种单核/巨噬 缩略语表5-7中文摘要7-10英文摘要10-14前言和文献回顾14-39正文39-881 实验材料39-452 实验方法45-503 实验结果50-80 3.1 实验流程图50-51 3.2 分泌性蛋白的小规模预测51 3.3 部分分子信号肽编码序列的扩增51-54 3.4 分泌性蛋白分子的验证54-55 3.5 小鼠分泌性蛋白分子的大规模预测55-57 3.6 HYP36的克隆与结构分析57-62 3.7 HYP36的原核表达与抗体制备62-65 3.8 HYP36的组织分布65-67 3.9 HYP36的亚细胞定位67-69 3.10 HYP36功能缺失突变体影响溶酶体酶的分选69-71 3.11 HYP36的过表达可以导致?-细胞样表型71-74 3.12 HYP32的克隆与结构分析74-78 3.13 HYP32的亚细胞定位78 3.14 HYP32的组织分布78-804 讨论80-88 4.1 分泌蛋白的鉴定80-83 4.2 HYP36与?-细胞表型83-86 4.3 HYP32与TREMs家族86-88小结88-89 参考文献 89-99个人和研究成果99-100致谢100