贵阳腐霉类胰蛋白酶纯化的初步研究

贵阳腐霉类胰蛋白酶纯化的初步研究 Vol . 33 No . 5 第 33 卷 第 5 期 右江民族医学院学报 Jo ur nal of Yo ujiang Medical U niversit y fo r Natio nalities Oct . 2011 2011 年 10 月 ?贵阳腐霉类胰蛋白酶纯化的初步研究 1 2 3 1 1 1段斯亮,于声,苏晓庆,唐荣兰,申海光,马新博 545006 (1 . 柳州医学高等专科学校病原生物学与免疫学教研室 ,广西 柳州 E - mail : dsllzmc @163 . co m ; 2 . 柳州医学高等专科学校检验教研室 ,广西 柳州 545006 ; )3 . 贵阳医学院生物学教研室 ,贵州 贵阳 550004 ( ) ( ) 摘 要 : 目的 对贵阳腐霉 Pyt hium guiyangense类胰蛋白酶 t ryp sin - li ke p rotease , Pr2进行初步的分离 、纯化 。 将该菌诱导 24 h 后获得的粗酶液 ,经过 P E G20000 的包埋浓缩 、透析 ,和两次 Sep hadex G - 100 凝胶层析后 ,进行 SDS - PA GE 电泳检测和分子量测定 。结果 纯化的 Pr2 蛋白酶经 SDS - PA GE 考马斯亮蓝染色显示为单一条带 ,分子量为 31 . 5 kDa 。结论 本研究初步纯化了贵阳腐霉 Pr2 蛋白酶 ,测得分子量为 31 . 5 kDa ,为针对贵阳腐霉 Pr2 蛋白酶的进一 步研究有重要意义 。 关键词 : 贵阳腐霉 ; Pr2 蛋白酶 ;分子量 () 文章编号 : 1001 - 5817 201105 - 0603 - 03 中图分类号 : Q936 ; Q55 文献标识码 : A doi :10 . 3969/ j . issn. 1001 - 5817 . 2011 . 05 . 001 A study on purif ication of trypsin - l ike protea se ( Pr2) of Pythium guiyangense 1 2 3 1 1 1DUAN Si - liang, YU Sheng, SU Xiao - qi ng, TAN G Ro ng - lan, SH EN Hai - guang, MA Xin - bo ( 1 . De p a rt m en t of Pat hogen B iology a n d I m m u nology , L i u z hou M edical Col lege , L i u z hou , Gu a n g x i 545006 , Chi n a E - m ai l : dsl l z m c @163 . com ; 2 . De p a rt m en t of L aborat ory M edici ne , L i u z hou M edical Col lege , L i u z hou , Gu a n g x i 545006 , Chi n a ; 3 . Dep a rt m en t of B iology , Gui y a )n g M edical Col lege , Gui y a n g , Gui z hou 550004 , Chi n a ( ) Abstract : Object ive To Isolatio n and p urificatio n of t ryp sin - like p rotease Pr2of Pyt hium guiyangense . Methods The cuticle - degrading p roteases were induced f ro m ento mopat hogensis f ungus , P. guiyangense fo r 24 ho urs wit h cicada exuviae . Af ter t he crude enzymic fluid underwent embedding , co ncent ratio n and dialysis by using P E G20000 , and af ter finished wit h sep hadex G - 100 gel chro matograp hy t wice , t he SDS - PA GE elect rop ho resis and t he molecular weight of Pr2 deter minatio n were perfo r med. Resul ts The SDS - PA GE coo massie brilliant blue staining had been perfo r med , t he p urified Pr2 p resented as a single band and it s molecular weight was deter mined as ( ) Concl usion The p urificatio n and molecular weight deter minatio n of Pr2 31 . 5 kDaare successf ul and 31 . 5 kDa . t he result s play impo rtant roles fo r f urt her st udy. Key words : Pyt hium guiyangense ;t ryp sin - like p rotease ; molecular weight 昆虫病原真菌在侵染昆虫体壁表皮时 ,会分泌一系列昆虫 ( ) Pyt hium guiyangense 可以高效地 、特异地杀灭 义 。贵阳腐霉 1 5 体壁降解酶 :蛋白酶 、几丁质酶 、酯酶 、脂酶 、淀粉酶等。研究 蚊幼虫 —孑孓 ,有效切断经蚊虫传播疾病的途径。通过研究 表明它们是入侵昆虫机体的重要因子 。其中蛋白酶包括 Pr1 、 发现 ,与其它昆虫病原真菌一样 ,该菌株在侵染孑孓体壁过程 Pr2 、Pr3 、Pr4 4 类 。Pr2 是一种丝氨酸蛋白酶 ,具有等电点偏酸 ( ) 中也会分泌蛋白酶 Pr1 、Pr2 蛋白酶、几丁质酶和脂酶等水解 5 酶。 性和底物特异性 特 点 。在 菌 丝 侵 染 昆 虫 表 皮 的 时 候 , 检 测 到 1 与方法 2 Pr2 活性要比 Pr1 活性早。这说明 Pr2 可能与清除营养素或 3 1 . 1 材料 释放肽类诱导 Pr1 产生有关。St . L eger 等研究发现 Pr2 可能 ( ) 在细胞控制机制 、催化特定的蛋白质水解和失活过程及控制入 1 . 1 . 1 菌株 贵阳腐霉 P. guiyangense菌株 ,实验室保存 ,接 侵机构的分化过程中起着重要作用 。大多昆虫病原真菌都分 种于 SF E 和 KP YG2 琼脂平板上 ,常规转种 、传代 ,培养温度为 3 ,4 ( 泌 Pr2 类 蛋 白 酶, 如 : 金 龟 子 绿 僵 菌 Metar hizium anisopli2 () 25 ?1?。 ( ) ( ) ae、白 僵 菌 Beauveria bassiana 、蜡 蚧 轮 枝 菌 Verticillium 6 1 . 1 . 2 培养基KP YG培养基 , SF E 培养基 , 基本盐培养 ) ( ) 2 lecanii、菜 氏 野 村 菌 No muraea rileyi。这 对 了 解 昆 虫 —病 原 基 ,诱导培养基 。 Ben - Phe - Val - Arg - NA 购自 Sigma 公司 。低分子量 ( ) 物 性峰 ,即命名为 ?峰和 ?峰 ,分别收集 ?峰的样品 第 15 管和 ( 蛋 白 97 . 2 kDa 、66 . 4 kDa 、44 . 3 kDa 、29 . 0 kDa 、20 . 1 kDa 、 () ?峰的样品 第 53 管。其中 ?峰和一个蛋白含量峰重叠 。 ( ) ) 14 . 3 kDa、购自 Taraka 公 司 。十 二 烷 基 硫 酸 钠 SDS、Tris - 分别将收集 ?峰和 ?峰的样品进行 SDS - PA GE 检测 ,经 βbase 、- 巯基乙醇 、NN’N’N’ - 丙烯酰胺 、NN’ - 亚甲基双丙 烯酰考马斯亮蓝 G - 250 染色显示结果 。结果发现 ?峰样品呈一单 胺 、过硫酸铵购自 AM R ESCO 公司 。其余试剂均为进口或 国产() 带 , ?峰样品杂带较多未达到电泳纯 图 3。 纯试剂 。 1 . 2 方法 7 1 . 2 . 1 Pr2 蛋 白 酶 的 活 性 测 定 参 照 St . L eger 等 人的 方 法 ,底物为 Ben - Phe - Val - Arg - NA ,浓度为 1mmol/ L 。 8 1 . 2 . 2 蛋白质浓度测定 参照 Bradford 方法,以牛血清蛋 ( ) 白 bovine serum albumin ,BSA为标准 。 1 . 2 . 3 粗酶液的制备 切取 1cm ×1cm 在 SF E 培养基上培养 5 天的贵 阳 腐 霉 菌 块 , 转 入 100ml 的 KP YG液 体 培 养 基 中 , 2 26 ?、100r/ min 振荡培养 4 天 。用高压灭菌的滤纸过滤菌体 , 并用无菌水洗涤 2 次 ,再次过滤 ; 滤纸吸干多余水分后 , 将 1g Pr2 蛋白酶活力 ??蛋白含量 ———() 湿重的菌丝转接至 100ml 诱导培养基中 , 26 ?、110r/ min 振 图 2 第二次 Sep hadex G - 100 凝胶过滤层析图 荡培养 24 h 。取培养液于 4 ?、10 000 ×g 离心 10min ,收集上清 9 ,10液 ,即可制得粗酶液 。粗酶液 , 经 P E G20000 包埋 浓 缩 透 析 后 采用 0 . 02mol/ L 1 . 2 . 4 Sep hadex G - 100 凝胶过滤层析 备用 。 ( ) Tris - HCl 缓 冲 液 p H8 . 0 洗 脱 , 洗 脱 速 度 为 0 . 2ml/ min , 1 . 5ml/ 管分步收集 ,收集 Pr2 蛋白酶活性部分 , 透析浓缩后备 用 。 ( ) 1 . 2 . 5 SDS - 聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS - PA GE和分子量测 11 定 参照郭尧君的方法,分离胶 15 % ,浓缩胶 4 % ,低分子 ( 量标准蛋白 97 . 2 kDa 、66 . 4 kDa 、44 . 3 kDa 、29 . 0 kDa 、20 . 1 kDa 、 ) 14 . 3 kDa与样品在同一条件下电泳 ,电泳完毕后 ,凝胶用考马 斯亮蓝染色显带 。计算 R值 。以已知标准蛋白分子量的常用 f 对数值为纵坐标 , R值为横坐标绘图 , 求得 其 回 归 曲 线 方 程 。 f 1 . ?峰 ;2 . 低分子量标准蛋白 ;3 . ?峰 测定未知蛋白的 R值 ,求出其分子量 。 f 图 3 ?峰和 ?峰 SDS - PA GE 图 2 结果 8 2 . 1 蛋白标准曲线的绘制 按 Bradford 方法,绘制的标准 () 测得 ?峰样品的分子量为 31 . 5 kDa 图 4。从表 1 中可以 曲线 。蛋白标准曲线的回归曲线为 y = 0 . 1214x + 0 . 0114 ,回 看出 , Pr2 蛋白酶提纯了 3 . 86 倍 , 回收率为 1 . 4 。纯化步骤比 2 较简单 ,纯化倍数和回收率都比较低 ,蛋白损失量过大 。 归后的标准曲线相关系数 R= 0 . 9965 。 2 . 2 Pr2 蛋白酶的纯化 粗酶液 400ml ,经 P E G20000 包埋浓 μ缩 、透析脱盐 、0 . 22m 滤膜过滤 ,进行第一次 Sep hadex G - 100 () 凝胶层析 ,用 0 . 02mol/ L Tris - HCl 缓冲液 p H8 . 0洗脱 ,利用 Pr2 的专一底物 Ben - Phe - Val - Arg - NA 检测 , 结果如图 1 ( ) 所示为两个活性峰 ,收集 Pr2 蛋白酶活性较高 > 60 . 0u部分 的酶液 ,浓缩透析后备用 。进行第二次 Sep hadex G - 100 凝胶 层析 。 1 . Pr2 ;2 . 低分子量标准蛋白 图 4 贵阳腐霉 Pr2 SDS - PA GE 图 表 1 贵阳腐霉 Pr2 蛋白酶的纯化 ———Pr2 蛋白酶活力 ??蛋白含量 蛋白含量 总蛋白 比活力 纯化 回收率 纯化步骤 ( ) ( ( ) ( ) ) % mg/m lmgu/ mg倍数 图 1 粗酶液 Sep hadex G - 100 凝胶过滤层析图 0 . 013 5 . 36 4701. 49 100 . 00 粗酶液 0 . 057 0 . 685 2719 . 3 0 . 6 7 . 30 P E G20000浓缩 将收集到 Pr2 酶液再次用 Sep hadex G - 100 凝胶层析 ,用 0 . 032 0 . 146 3871. 90 0 . 8 2 . 24 ()Sep hadex G - 100 1 () 0 . 02mol/ L Tris - HCl 缓冲液 p H8 . 0洗脱 ,以 Pr2 的专一底物 () Sep hadex G - 100 20 . 006 0 . 019 18158 . 13 3 . 86 1 . 40 Ben - Phe - Val - Arg - NA 检测 ,结果如图 2 所示 ,仍有 Pr2 活 — 604 — 2011 年 右江民族医学院学报 第 5 期 () p hys ,1987 ,258 1:123 - 131 . 3 讨论 5 Pyt hium isolated f ro m Su Xiao - Qing. A new species of Pr2 是一种丝氨酸蛋白酶 ,具有等电点偏酸性和底物特异 mosquito lavae and it s I TS regio n of rDNA J . M ycosys2 12 性特点 。侵染结构产生的 Pr2 已经通过免疫染色检 测 到, () tema ,2006 ,25 4:523 - 528 . 4 YU Sheng , DUAN Siliang , SU Xiaoqing. A St udy o n In2 6 虽然活性只有 Pr1 的 1/ 4。在 Pr2 产量调节的研究中 , Pater2 ( ) ductio n Co nditio ns for A Tryp sin - li ke Protease Pr2 of (so n 发现三种含蛋白的不可溶物质 昆虫表皮 ,弹性蛋白和胶原 Pyt hium guiyangense Su J . Journal of Gui yang Medical 3 () College ,2008 ,33 3:221 - 224 . ) ( ) 蛋白和两种可溶蛋白 牛血清白蛋白 ,明胶可以诱导 Pr2。 St . L eger RJ , Charnley A K , Cooper RM . Characterizatio n 7 Pr2 在菌丝侵染昆虫表皮的时候 ,检测到 Pr2 活性要比 Pr1 活 of cuticle - degrading p roteases p roduced by t he ento2 2 mopat hogen Metar hizium anisopliae J . Arch Biochem Bio 2 性早。这说明 Pr2 可 能 与 清 除 营 养 素 或 释 放 肽 类 诱 导 Pr1 3 ,4 () p hys ,1987 ,253 1:221 - 232 . ,如 :金龟子绿僵菌 、白僵菌 、蜡蚧轮枝菌 、菜氏野村菌 。 酶3 产生有关。St . L eger 等研究发现 Pr2 可能在细胞控制机制 、 8 这些现象表明 Pr2 与毒力相关 。因此 , Pr2 基因可作为提高昆 汪家政 ,范明 . 蛋白质技术手册 M . 北京 : 科学出版社 , 催化特定的蛋白质水解和失活过程及控制入侵机构的分化过 虫病原真菌杀虫效果的工具基因 。 目前已纯化的昆虫病原真2000 :42 - 47 . 9 F. 奥斯伯 . 精编分子生物学实验指南 M . 北京 : 科学出 菌分泌的昆虫体壁降解蛋白酶 程中起 着 重 要 作 用 。大 多 昆 虫 病 原 真 菌 都 分 泌 Pr2 类 蛋 白 13 ,15 版社 ,1999 :373 - 376 . 比较多 。国内外有关 Pr2 的纯化与功能研究相对较多。 10 在 Pr2 蛋白酶纯化过程中发现存在两个活性峰 , 即 ?峰 和 ? 赵永芳 . 生物化学技术原理及应用 M . 北京 : 科学出版 峰 ,两者很可能为一组同工酶 ,其中 ?峰样品经纯化后得到了 社 ,2002 :101 - 117 . 11 单一电泳纯条带 。其分子量约是 31 . 5 kDa ,与 St . L eger 和裴炎 郭尧君 . 蛋白质电泳实验技术 M . 北京 : 科学出版社 , 13 ,15 等同类研究相比 , 分子量相差不大 。但是所得蛋白酶的 2005 :92 - 118 . 纯化倍数和回收率都比较低 。这可能与诸多因素有关 ,例如 : 12 St . L eger RJ , Joshi L , Bidochka MJ , et al . Biochemical 诱导后收集的粗酶液中的蛋白含量很低 ,远低于国内外报道的 characterizatio n and ult rast ruct ural localizatio n of t wo ex2 16 () 其它产碱性蛋白酶菌种 株。贵阳腐霉自然菌株产生蛋白 t racellular t ryp sins p roduced by Metar hizium anisopliae in 酶的量很低 ,这就给分离纯化带来诸多不便 。在蛋白酶分离纯 infected insect cuticles J . Enviro n Microbiol , 1996 , 62 化过程中 ,蛋白酶被降解以及其自身水解 ,使粗酶中蛋白质成 () Appl:1257 - 1264 . 13 17 ,18 分十分复杂 。这些问给纯化带来一定困难。由于条件 Screen S , Bailey A , Charnley A K , et al . Isolatio n of a ni2 所限 ,纯化工作的温度没有控制在 4 ?左右 。在纯化过程中要 ( ) t rogen respo nse regulator gene nrr1 f ro m Metar hizium () anisopliae J . Gene ,1998 ,221 1:17 - 24 . 保持低温 、减少样品反复冻融 ,纯化的样品尽可能分装保存于 14 Smit hso n SL , Paterso n IC , Bailey AM , et al . Clo ning and - 70 ?冰箱中 。因此 ,在以后实验中应结合其它的纯化方法 , characterizatio n of a gene encoding a cuticle - degrading 进一步提高纯化倍 数 和 回 收 率 , 摸 索 一 套 重 现 性 好 的 纯 化 方 p rotease f ro m t he insect pat hogenic f ungus Metar hizium 案 。 () anisopliae J . Gene ,1995 ,166 1:161 - 165 . 15 参考文献 : 裴炎 ,冀志霞 ,杨星勇 ,等 . 绿僵菌分解昆虫外壳蛋白酶 1 Robert A , Messing - Al - Aidf roos K. Acid p roductio n by ( ) MA P - 21 的纯化与特性 J . 微生物学报 , 2000 , 40 3: Metar hizium anisoplia : Effect s o n virulence against 306 - 311 . mosquitoes and o n detectio n of in vit ro amylase , p rotease 16 蒋咏梅 ,章文贤 ,谢必峰 . 黑曲霉黄色变株 A - 2580 产耐 and lipase activit y J . Invertebr Pat hol ,1985 ,45 :9 - 15 . 温碱性蛋白酶发酵条件的优化 J . 福建师范大学学报 : 2 St L eger RJ , Durrands P K , Cooper RM , et al . Role of ex2 t racellular chymoelastase in t he virulence of Metar hizium 17 () 自然科学版 ,2002 ,18 4:73 - 76 . anisopliae for manduca sexta J . Invert br Pat hol ,1988 ,52 : Gup ta SC , L eat hers TD , EL - Sayed GN , et al . Relatio n2 285 - 293 . ship amo ng enzyme activities and virulence parameters in Paterso n IC , Charnley A K , Cooper RM , et al . Partial char2 3 Beauveria bassiana infectio ns of Galleria mello nella and Tri2 acterizatio n of specific inducers of a cuticle - degrading p ro2 18 choplusia ni J . Invertebr Pat hol ,1994 ,64 :13 - 17 . tease f ro m t he insect pat hogenic f ungus Metar hizium aniso2 Barillas - Mary CV . cDNA and deduced amino acid se2 ( ) pliae J . Microbiolo gy ,1994 ,140 Pt 11:3153 - 3159 . quence of a blood - meal induced t ryp sin f ro m gene in t he 4 St . L eger RJ , Cooper RM , Charnley A K. Dist ributio n of mosquito J . Aedes ae gyp ti Insect Biochem , 1991 , 21 chymoelastases and t ryp sin - li ke enzymes in five species of () 8:825 - 831 . ento mopat hogenic deutero mycetes J . Arch Biochem Bio 2 收稿日期 :2011 - 07 - 06