【doc】人A组轮状病毒地方株外壳蛋白VP4的原核表达

【doc】人A组轮状病毒地方株外壳蛋白VP4的原核表达 人A组轮状病毒地方株外壳蛋白VP4的原 核表达 第14卷第1期:6 004J-=F月 生物技术Vo1.14.No.1:6 Feb.2O0_4 酶酶切位点.本研究将TAP—tag片段插入pTRE2hygMCS的 BamH]/NheI之间,重组质粒若用BamH]/NheI或BamH]/NotI切 割,阴性克鹰应出现与插入片段大小相似的条带.如图3(a)所 示,5,6,12,18号克隆均符合上述,初步显示为阳性克隆. 进一步对12,18号克隆用5组双酶切割(图3(b)),BamHFNheI, BamH]/NotI和BamHI/EcoRV组合均显示与其切割片段大小相 适应的条带;而NheI/EcoRV,I,I切割片段小于50bp,应 不出现对应的DNA条带,结果亦是如此.根据pTRE2hyg和 pTRE2hyg—TAP—tag的DNA序列组成,若用EcoRI进行单酶切 割,前者应出现725bp,1035bp和3565bp3个DNA片段,后者应 出现1035bp,1275bp和3565bp的DNA片段.从(c)中看出,12, 18号克隆完全符合这一要求.因此可以认定,12,18号克隆为 TAP—tag片段正确克隆的重组质粒. 3.3CPSF30k.73k,100k克隆结果的检测 本试验将CPSF30k,73k,100k基因克隆在质粒pTRE2hyg— tag上MCS的NheI与EcoRV切点之间,阳性克隆用限制 TAP— 性内切酶BamHI和ItindIII单酶切割,应出现的片段大小见表 1o 从图4(ft.),图4(b)的限制性酶切图谱中可以看出, p'rRE2hyg—TAP—tag—CPSF30k中的3号克隆及100k中的4 号克隆因有多余的条带出现或弥散背景的拖带,不宜视为阳性 克隆外,而30k中的8号克隆,73k中1号和16号克隆,100k中 的17号克隆均与表1中相应的酶切片段相符,可断定为阳性克 隆. 3.4带有TAP—tag标签的CFST基因在Hda细胞中的瞬时表达 重组质粒pTRE2hyg—TAP—tag—CPSF30k.73k,100k在 Hela细胞内瞬时表达后,以CPSF73k,100k蛋白质特异性抗体 进行蛋白质印迹杂交的结果见图5.图中所示的两条杂交带 前者为野生型蛋白,后者为重组型蛋白.因重组型CPSF蛋白 带有一小段TAP—tag片段翻译的多肽,故分子量较野生型为 大.从两种脂质体Lipofeetamine2~和Metafeetene所转导的效 果来看,以前者出现的杂交信号更为清晰,表明Lipo. fectamine2000更适宜于重组质粒向哺乳类细胞的转导. 表1质粒pTRE2hyg-TAP—tag—CPSF 30k.73k.100k阳性克隆的酶切片壁lj pa'Pa:~-TAP? 嚏一四30k 1270.5314 2l17.4467 p1RE2?TAP一 嚏?四73k 670.1931.5306 1573.1867.4461 p'llRUo~-TAP? 嚏?四lOOk 郴.27舶.5306 1162.2476.堋 4结论 试验结果表明,通过PcR扩增的TAP—tag片段和凹sF 30k,73k,100k基因完整,以上片段在真核细胞表达型载体 pTRE2hyg上插入方向正确,插入位置准确无误,所形成的重组 质粒pTRE2hyg—TAP—tag一sF30k,73k,100k可在哺乳类细 胞内完好表达,因而可用作基因转移后永久性细胞系的建立. 参考文献: [1]wal11eE.RueegseggerU.3'一endproce~ngofpre—mRNAineukaryote [J].网MicrobiologyRenews.1999.23(2):277—295. 12】EdmondsM.AhistoryofpolyA8~[1lcncc8:fromfonmtlontofactorstorune— tion[J].1'ro~NudeicAcidl~.esMol阱0I.2OO2.71:285—389. 【3]ManleyJL.Tak8g出Y.Theend0ftherT1e8?ge—motherlinkbetweenyeast andHmrrlrl1al8[J].Seie~e.1996.274(29):1481—1482. 【4]J唧A,Keu口w.Cl~-,g0feDNAencodingthe160kDasubunJtsofthe bo-dnedeavageandpoly.,tenylati~specificityfactor[J].NudeicAcidsRe- search,1995.23(14):2629—2635. 【5JClumfre~G,NobleSM,GuthrieC.E..~tialyeastproteinwithunexpected similaritytosubumtsoflnlu/u~811deavageandpoladellylationspecificityfactor (CPSF)【J].,Science,1996,274(29):1511—1514. 【6]Jerin~,A,SebasfiaLM,Pi~erPJ,da/.St珂llencesimilaritybt蚋e肌73一 Kilodaltonproteinoflnlu/u~811CPSFand8sul:~lrfitofyeastpolyadellylationfae— totI[Jj.Sdmee,1996,274(29):1514—1517. 17jRigautG,ShevehenkoA,RutzB,da/.A固cproteinpurificationmethod forproteincomplexeharaeterizationandproteomee~loration[Jj.Natllioteclm- ol,1999.17(10):103o一1032. 【8]Puig0,Cs~'yF,Rigaut,G,da/.etluldt~rnaffmitypurification(TAP) method:.generalprocedureofproteincomplexpurification[J].Method,2001, 24(1):218—229. 人A组轮状病毒地方株外壳蛋白VP4的原核表达 王明忠,朱进 (1.南京师范大学江苏省资源生物重点实验室,江苏南京210024;2.南京军区军事医 学研究所,江苏南京210(102) 摘要:目的:制备轮状病毒外壳蛋白VP4.方法:从病人粪便中分离的毒株中提取病 毒dsRNA为模板,经RT—PCR获得编码 VP4截短蛋白基因片段cDNA(1—1253bp),将VP4基因片段克隆于pG?一4T一 2融合表达载体中,经d0t印迹筛出阳性重组子,重 组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3).工程菌经lYrG诱导,11%聚丙烯酰胺凝胶电泳.结果:Western印迹表明,工程菌能正确 表达VP4蛋白片段,且具有良好的抗原性.结论:为研制轮状病毒重组疫苗,亚单组 疫苗,转基因植物口服疫苗做了前期准备. 关键词:轮状病毒;VP4蛋白;Western印迹 中围分类号:R373文献标识码:A文章编号:1004—3tlX(2004)01一OOO6—02 ProkaryoticExpressionofGroupAHumanRotavirusVP4She1IProtein WANGMing—zhong,ZHUJin2 (1.KeylabofJian~Ru?Biology,NanjingNormalUnivea'sity,N阴jil1g21o024; 2.MilitaryMedicalInstituteofN蚰jingNilit~Area,Najing210002,P.R.Claim) A;h:Ob~iecttve:P~parationofrotavirusVP4protein.Methods:RNAofrotavirmWereextra ctedfrompatientsfaecesandwegetranscribed intoeDNAbyRT—PCR.TheVP4genefragmentabout1253bpsWillsclonedintopCEX一 4T一2.andlx~itivebaeteriawegesdectedbydotblot. VP4proteinwege懿 presBedwit}IGSTinE.co/iBI21inducedbylYrGandanalysisedby10%SDS— PAGE.Results:VP4proteinhadfinebio— looealactivitytestedbywl~telTiblot.C41lldl~oll:Thisstudyprovidesignificantbasementsf orrotavirusvaccineresearch. KeyWOI~-"rotavirus;VP4protein;Westernblot A组轮状病毒是婴幼儿腹泻的主要病原,尤其是在发展 中国家,本病的发病率和病死率较高.每年可造成87万人死 亡.即使在美国每年也有5.5万一7万病人住院.因此安全有 效的轮状病毒疫苗的研制成为一个急需解决的问题….轮状 病毒基因组由11个节的双链RNA组成,编码6种结构蛋白和 5种非结构蛋白.VP4基因全长2359bp,编码775个氨基酸,分 子量8okoL.国内外的大量研究表明VP4蛋白能诱导产生型 收稿日期;2003—05—09;修回日期:2OO3—08—22 基金项目:江苏省资源生物重点实验室开放研究基金项目(sD0o12)资 助 作者简介:王明忠(1947一),男,江苏扬州人,副教授,从事分子遗传教 学与研究,现工作单位:江苏教育学院生物系,南京市北京西路l5号, 二栋505室,Tel:(025)3758339,E—mail:wrm47@sohu.c0fIl.发表论着2 部,论文lO多篇. 特异性中和抗体,而抗VP4的中和抗体在预防轮状病毒(aV) 感染的疾病中起重要作用【3】.本实验将腹泻病人中分离的 毒株VP4基因片段eDNA在原核细胞中得到正确表达,为口服 疫苗的研制奠定了基础. 1与方法 1.1试剂:限制性核酸内切酶和其它工具酶分别购自Takara 生物工程公司和公司,核酸纯化试剂盒由Qiagen公司 提供. 1.2细菌,载体及病毒株 大肠杆菌TG1用于载体的增殖与目的的基因克隆,BL21 (DB)用于重组质粒的表达,载体pG?一4T一2由本室保存, 人A组轮状病毒为江苏省2001年流行季节某儿童医院腹泻病 人粪便标本分离,抗G1,G2,G3型RV的抗血清由东南大学医 学院流行病室惠赠.羊抗鼠酶标抗体为Sangon公司产品. 2OO4年2月植物蔗糖酶结构和作用研究进展7 1.3病毒核酸的提取 将收集的培养细胞冻融数次,用等体积氯仿/异戊醇处 理,剧烈振荡15s,冰浴5min,上清加入1/40体积的10%SDS, 55?孵育30min,再依次用酚,氯仿/异戊醇抽提2次,上清加入 2倍体积的冰乙醇沉淀,75%乙醇漂洗1次,沉淀在真空中干 燥后,溶于50去离子水中. 1.4逆转录PCR扩增VP4基因 RT—PCR反应参照文献.50体系中,加入5RVdsRNA (200ng),一对引物各l,95?变性3min,冷却后再加入2tll 5mMdNTPs,5Taq酶缓冲液,AMV逆转录酶2u,TaqplusI2u, 补DW至终体积50,混匀后加入适量矿物油,42~C温育30rain 后,95?3min灭活AMV逆转录酶,94?50s,56?50s.72? lmin,28cycles结果后,72~C延伸7min,冷却至室温. 1.5质粒DNA的制备,目的基因片段的纯化,限制性内切酶 反应,去磷酸化,连接反应,感受态大肠杆菌的制备等,参见文 献. 1.6重组子的筛选及鉴定:重组克隆载体通过蓝白斑筛选鉴 定,重组表达载体的鉴定利用PC11方法进行. ?一 - 簟 ??簟 图lpETVP4在:~lilIFI'G浓度的诱导表达 1,2,3,4,5的WIG浓度分别为0,0.1, 0.5,1.0,20,5.OmM;1:蛋白Manker 1.7目的蛋白的表达及I活JJ生检测 挑取单个工程菌菌落接种于5mlLB(氨苄10orrd)液体 培养基中,37?12—16h后,按l:50稀释培养2h后,加入终浓 度0.1ml~l的IFrG置37?培养5h,诱导目的蛋白表达.取 1.5ml诱导后的细菌,收集菌体,行10%SDS—PAGE凝胶电 泳.Sestembolt印迹检测样品SDS—PAGE电泳后,经电转移至 硝酸纤维膜上,用抗血清和酶标抗体检测,DAB显色. 1.8动物免疫实验 用纯化的病毒蛋白与等体积的弗氏完全佐剂免疫BALA/ c小鼠,每次0.5t,-d只,每隔lOd免疫一次.用与第一次相同的 蛋白量和弗氏不完全佐剂混合,进行第二,三次加强免疫.第 三次免疫后两星期,采取免疫动物血清. 2结果 2.1参照人A组轮状病毒sAll株VP4基因核酸序列设计引 物 为了便于克隆和表达,5'端和3'端引物外侧分别加有 内切酶BamHI和EcoRI识别序列,所设计的引物序列如下: Forward5'一CGCGGATCCC,CGGGCTATA从ATGGcr一3': Backward5'CCGG从TTCCCAATGATACGAAATC一3'. 2.2目的基因片段的扩增及重组子构建 A组轮状病毒sAll株VP4(1—1253bp)基因的PI'一PcR 结果与设计相同,为1291bp.分别用内切酶BamHI,EcoRI酶切 质粒pCEX一4T一2DblA和VP4eDNA,纯化VP4基因片段,插 入原核表达载体pCEX一4T一2,构建重组载体pCEXVl'4. 2.3目的蛋白表达与Sesternblot检测 筛选出的工程菌经培养,IFrG诱导表达,SDS—PAGE电泳 染色后考马斯蓝染色,在分子量72kD处有明显的表达条带, 28kI)处GSI"蛋白条带消失,而对照(空载体)则在28kI)处有一 条清晰的GSI"蛋白条带,WesternNoting印迹检测,NC膜上有 一 条印迹带,表明pCEXVP4表达的VP4蛋白片段具有天然反 应原性. 2.4用纯化的蛋白免疫动物三次后,获得较高的抗体效价,滴 度达l:1600.实验表明VP4具有较高的免疫原性,其免疫保 护性还有待实验的进一步研究. 3讨论 病毒亚单位疫苗是用病毒的裂解物或利用基因工程高效 表达的目的蛋白作为免疫源.如将VP4和VP7的eDNA插入 可以口服,在被免疫动物体内无毒复制的适当表达载体(如标 状病毒,猴病毒4o,大肠杆菌质粒,重组牛痘病毒等)中表达重 组蛋白.1987年Meccrea等将VPTe编码基因中的不同区段分 别与pEX重组,结果只有pEX3/8/5一种重组方式较为理想,经 转化,诱导后可高产量地合成8一Cal—VPTe融合蛋白,用之免 疫动物产生特异的高滴度的免疫抗血清.实验证明此种疫苗 安全,有效,与重组疫苗交替使用可成为其加强剂. A组轮状病毒两个主要的外壳蛋白VP4和VIy7是诱导中 和抗体的主要成分,而VP4又是主要的中和性抗原,国内外的 许多研究已得到证实.作为中和抗原,VP4不需要糖基化,亦 不需特殊的三维空间结构,而且具有较多的交叉保护作 用.由于VP4属线性抗原,在原核细胞表达系统中仍具有 较好的抗原性,因此VP4基因蛋白的克隆和表达,在轮状病毒 基因工程多肽疫苗的研究中有重要的地位. 本实验用A组轮状病毒南京地方毒株的daRNA做模板,经逆 转录一PCR获得编码VP4蛋白的基因片段,克隆pCF~X一4T一2表 达载中,得到正确的表达,并具有较好的抗原性.完整VP4基因 较长,2359kb,在原核生物中表达量极低,因此本实验截取VP4基 因的片段(1—1253)进行表达,获得了理想的结果,为下一步工作 即将VP4基因导入植物细胞中表达奠定了基础. 轮状病毒疫苗的研究主要可分为两个方面,首先是对不 引起临床症状的减毒动物病毒株和人,动物病毒重组株作为 疫苗的研究,但结果不令人满意;其次是用基因工程表达一 个或多个病毒蛋白作抗原.外壳蛋白VP4作为同型抗原具有 良好的抗原性和免疫原性,但并不能诱导产生异型性中和抗 体,而外壳蛋白,在诱导异型性中和抗体方面发挥着重要 作用.Redmond等用牛轮状病毒C486株的VP4,VP6和VIy7装 配的病毒样颗粒免疫动物产生的抗体,可低抗同型和异型病 毒的攻击.这些研究表明,需要VP4和vIy7联合表达,来 研制确实有效的轮状病毒重组疫苗.本实验正是为此类工作 做了前期准备J. 参考文献: [1]黄英.轮状病毒感染的免疫保护机制[M].国外医学病毒学分册, 1997,4(3):67. [2]EsterMK,ClassIlL.SimianmtavirusSAllreplicationincelleultur~[J] .J.Viroi.1997,31:474. [3]彭秀玲,袁汉英,谢毅,等.基因工程实验技术[M].湖南科学技术 出版社,1997. [4]EsterMK,CohenJ.Rotavimsgenomestructureandfunetion[J].Mierobio1. Rev.,1989,53:40. [5]GorzigliaM,LarraldeG,IC~piki.nAZ.Antigenicrelationshil~amonghuman rotavirusasdeterminedbyoutercapsideproteinVP4[J].Proe.Nati.Aead. USA.1991.87:7155. [6]SueCE,NarieL,JeanC.da/.Characterizationofrims—likeparticlespro— ducedbylineexpressionof1"o~n18capsidproteinininsecleells[J].J.VLroi., 1994,68(9):5945. [7]NishikawaK,FukrharaN,LipmndiF.eta/.VP4proteinofporciner~.avirus strainOSUexpresssedbyabaeulovimsrecombinantinducedI跏菌ng8nti— bodles[J].Virology,1989,173:631. [8]RedmondMJ,Lj-,.blK.ParkerMD,etn2.As,se~lyofrecombinantmlavims proteinintovirus—likepartiat[J].Vael:ina,1993,11:273. [9]ANdrewME,Boyle加,CouparBE.eta/.Vaccinavirusrecombinantsex. pressingtheSA1lrotavirusVP&glyeoprote~ngeneinduce8erotypespecificnell— tralizing8ntibodles[JJ.J.?r01.,l987,6l:l054. 1lO~LjazMK,Attah—PokuSK,R~ondMJ,eta/.Heterptypicalpassivepro— tectioninducesbysynthenticpeptidescorrepondingtov1andVP4ofbovine rotavirusUJJ.J.viro1.,2ool,161:2458. 1llJTattiKM,C,entschJ,ShiehWJ.eta/.1olecularandimmundo+~iealmeth. odstorotavimsinformalin—fixedtissudJ].JViroiMethods,2OO2,105(2): 3o5—3l9. 112JCunlifieNA,BreveJS,HartCA.RotavinJsvaccines:developmentcurrent issue~andfutureprospects[JJ.JInfect,2OO2,45(1):l一9.