酵母菌的观察

酵母菌的观察 酵母菌的形态与观察 郭森 09级生命基地 200900140029 周二下午 第五排 摘要:本实验使用液体培养基和麦氏(Meclary)琼脂培养基对酵母菌进行了6—7天的培养。分别使用美蓝染液水浸片法、孔雀绿-番红复染法对酵母菌进行染色，最终观察到了酵母菌及子囊孢子的形态并区分出了酵母菌细胞的死活。 关键词:酵母菌;子囊孢子;美蓝染液水浸片法;孔雀绿-番红复染法 前言:酵母菌(yeasts)是单细胞真菌，圆形、卵圆形或圆柱形，多以出芽方式进行无性生殖，也有行而分裂生殖的。有些酵母菌是通过子囊孢子的方式进行有性生殖的。子囊内的单倍体子囊孢子可萌发长成新的酵母细胞。通常通过美蓝染液水浸法对酵母菌进行染色观察酵母菌形态和出芽过程并分辨死活酵母菌，通过孔雀绿-番红复染法对酵母菌进行染色来观察子囊孢子。 洁净试管中制作斜面。1 材料和方法 1.2.2酵母菌接种 分别无菌操作，用接种环在酿酒酵母平1.1材料 板培养基上挑取少量酵母菌接种到液体培 养基和麦氏(Meclary)琼脂培养基斜面上。 1.1.1菌种 酿酒酵母(Saccharomyces 1.2.3酵母菌简单染色 cerevisiae)。 1.1.2培养基 液体培养基，麦氏 1.2.3.1美蓝染液水浸法 (1)滴加一滴0.1%吕氏碱性美兰染液(Meclary)琼脂培养基。 于载玻片中央，无菌操作用接种环由酿酒酵1.1.3溶液和试剂 蛋白胨，酵母膏，葡 萄糖，KCl，醋酸钠，琼脂，蒸馏水，0.1%母麦芽汁斜面培养物挑取少许菌体置于染和0.05%美蓝水溶液。 液中，混合均匀。 (2)用镊子取一块盖玻片，将盖玻片一1.1.4仪器和其他用品 锥形瓶，试管， 接种环，玻璃棒，载玻片，盖玻片，显微镜，边与菌液接触，缓慢将盖玻片倾斜并覆盖在双层瓶(内装香柏油和二甲苯)，擦镜纸。 菌液上。 (3)将制片放置3min后，用低倍镜及1.2方法 高倍镜观察酵母菌形态和出芽情况，并根据 细胞颜色区分死活细胞。 1.2.1制作培养基 (4)染色30min后再次观察，注意死活1.2.1.1液体培养基 分别取4g蛋白 胨，2g酵母膏和4g葡萄糖放入约200ml水细胞比例是否发生变化。 中加热融化，待混合均匀后(呈深棕色)将(5)用0.05%吕氏碱性美蓝染液作为对水补充至200ml，然后将其分装到两个锥形照同时进行上述实验。 瓶中，每个锥形瓶中100ml，放入高压蒸汽 1.2.3.2孔雀绿-番红复染法 锅中113?灭菌30min。 除进行孔雀绿染色时不用加热以外， 其他与芽孢染色法相同。 1.2.1.2麦氏(Meclary)琼脂培养基 分别取0.1g葡萄糖，0.18gKCl,0.25g酵母 1.2.3.2.1染色 向载玻片滴加数滴膏，0.82g醋酸钠，1.5~2.0g琼脂和蒸馏水5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位。 100ml于烧杯中进行加热混合，待琼脂熔化1.2.3.2.2脱色 将玻片冷却后，用缓并混合均匀后放入高压蒸汽锅中113?灭菌流自来水冲洗至流出水无色为止。 30min。灭菌结束后，将其取出分装到十个1.2.3.2.3复染 用0.5%番红水溶液 复染2 min。 1 2.3.2.4 水洗 用缓流自来水冲洗 至流出水无色为止。 1.2.3.2.5镜检 将载玻片晾干后油 镜镜检。 2 结果与 2.1 结果 用美蓝水染液对酵母菌进行染色(见图2 酵母菌孔雀绿-番红复染法染色显微图1)后，使用低倍镜和高倍镜对酵母菌进观察图 行观察。使用高倍镜进行观察时，在显微镜2.2结果分析 视野中，可以观察到酵母菌细胞较密集的分 布。可以观察到，酵母菌呈椭圆形，内部仿由于酵母菌细胞个体大，一般通过美佛有个浅蓝色的环，有些酵母细胞已经出兰染液水浸法来观察酵母菌形态和出芽过芽，可以明显的看到椭圆形的芽体，有些可程并鉴别酵母菌的死活。美蓝对细胞无毒，看出二分裂痕迹。 氧化型呈蓝色，还原型呈无色。染色后，活 其中有接近三分之一的酵母细胞呈蓝细胞内有较强还原能力，使美蓝由氧化型转色，刚开始染色3min左右时，视野中蓝色变为还原型，由蓝色变为无色，因此染色后酵母菌的数量明显多于染色30min后蓝色酵的活细胞无色。死细胞或代谢能力弱的衰老母菌的数量(约四分之一)。 细胞内还原能力弱，染色后细胞呈蓝色或淡 蓝色。刚开始染色3min后，呈蓝色细胞比 例高于染色30min后的比例。原因是，染色 3min时，有些活细胞还没有来得及把美蓝还 原，新陈代谢较慢，因此显蓝色，而30min 后，大部分活细胞以及衰老细胞已经将美蓝 还原为无色的还原型。 孢子壁较厚，通透性差，因此不易被 染色，因此采用与芽孢染色法相似的染色方 法对其进行染色。因此最后子囊孢子被染成 绿色而周围细胞无色或浅红色。 图1酵母菌美蓝染液水浸法染色显微观察图 3 小结 用孔雀绿-番红复染法(除了加热)对 酵母菌进行染色后，使用油镜进行观察(见进行本实验时有这么几个应该注意的图2)。在显微镜视野中可以观察到实验用酵地方:(1)加热固定时要使用载玻片夹子，母菌大约有三分之二包含子囊孢子，其中的以免烫伤。不要将载玻片在火焰上烧烤时间每个酵母菌包含约2~3个子囊孢子。子囊孢过长，以免载玻片破裂。(2)使用燃料时注 意避免沾到衣物上。(3)用接种环将菌体与子的形状从圆形、椭圆形到五边形、六边形 染液混合时不要剧烈涂抹，以免破坏细胞。 等多边形均有。子囊孢子壁较厚，在 (4)滴加染液要适中，否则用盖玻片覆盖显微镜视野中呈透明状。孢子内部呈 时，然也过多会溢出，过少会产生大量气泡。绿色，有些会有深浅的变化，周围细 (5)盖玻片要缓慢倾斜覆盖，以免产生气胞显浅红色。 泡。 经过本实验，可以明显观察出，吕氏 碱性美蓝染液对酵母菌的作用时间越长，能而且在接种24小时以后才能产生孢子，若观察到的死、活细胞的比例(死/活)越低。培养时间不够或者有其他条件变化的话，都在本实验中，若未观察到子囊孢子，可能与不会产生孢子。 染色技巧有关，也可能是因为培养的环境有 关。酿酒酵母只在醋酸钠琼脂培养基上产孢, 参考文献 [1] 沈萍，陈向东 《微生物学实验》(第4版) 高等教育出版社 2007年11月第4版 [2] 沈萍，陈向东 《微生物学》(第2版) 高等教育出版社 2006年5月第2版 [3] 胡瑞卿 《三株酵母菌子囊孢子形成条件及染色方法的比较》 《微生物学通报》 1990年02期