【doc】牛胰多肽与CL／PC脂质体作用后二级结构的变化

【doc】牛胰多肽与CL／PC脂质体作用后二级结构的变化 牛胰多肽与CL,PC脂质体作用后二级结 构的变化 一 A 生物物理第ll卷第3期l995年9月 ACTA啪lCASINICAV0LllNo.3Sl995 牛胰多肽与CL/PC脂质体作用后二级结构的变化 —盟杨丽林克椿 …/,af(军事医学科学院国家生物医学分析中心北京1008,C?'(,1 摘要 用傅立叶变换红外光谱(FT—mJ研究了BPP与膜作用后其二级结构的变亿.通过对红外光 谱中酰胺I谱带进行解卷积微分厦曲线拟合等处理,结果表明,BPP与脂膜作用后.其二级鲒 构中一螺旋成分增多,无规卷由成分减少 :牛胰多肽二级鲒构心磷脂, ————,r———一r——一 付利叶变换红外光谱 (bovinepancreaticpolypeptide,BPP)是胰脏分泌的,由36个氨基酸组成的 具有细胞保护作用的活性肽(其氨基酸序列为Ala—Pro—Leu—Glu—Pro—Glu—Xyr—Pm— GIv—Asp—Asp—Ala一"llar—Pro—Glu—Gin—Met—Ala—Gin—Tyr—Ala—Ala—Glu—Leu— Arg—Arg—Xyr—lle—Ash—Met—Leu—Thr—Arg—Pro—Arg—Tyr—NH^):体内实验表明 BPP能预防和治疗由胆酸盐诱发的大鼠急性胰腺炎我们用脂质体作为模型,研究 过它与 脂的相互作用,发现它与膜脂有较强的相互作用,能稳定膜结构,升高脂的主相变温度,抑 制由胆酸钠诱发的脂质分子的alltrans-gauche构象的转变?.最近我们又发现,BPP能抑 制由Ca诱发的CL/PC脂质体的膜融合.为进一步研究BPP结构与功能的关系,我们用国 际上近几年发展起来的斑多肽和蛋白质二级结构的新技术一傅里叶变换红外光谱,研究 了BPP在溶液状态和在膜环境下的二级结构 1材料和方法 1.1材料 牛胰多肽(BPP)为印第安纳州日iLi?y(usAJ产品,心磷脂(Cardiolipin,CL),卵磷 脂(L—phosphatidylcholinefromFro~rleggyolk,PC)从Sigma购得,D,O为北京化工厂 产品,含量99.8% 红外仪器为Bio—RadFTS一65A型傅里叶变换红外光谱仪. 1.2方法 CL,PC两种脂共18~'nol(摩尔比1:1).以0.5mlD水化,超声5分钟制得CLc脂 质体(脂浓度36mmol,,,L).称取BPP0.5rng,与CL/PC脂质体振荡混匀,37?温育2分钟 国家自然科学基盘重点资助项目 第3期牛胰多肽与CL,,'PC脂质体作用后二级结构的变化347 (肽与脂克分子比为1:30). 将以上样品装入CaF,样品池,液层厚度为25,urn,10分钟后室温下测定红外光谱,主要 记录蛋白酰胺I谱带1600cm一1700cm所用器为HgCdTe,分辨率2cm,光谱采 集1024次. 分辨率增强采用B一RadDataStation3200软件,它是按Kauppinen[1的方法设计 的.傅里叶自去卷积采用半高宽参数16cm,分辨率增强因子k23. 谱带拟合采用Bto—RadWirtdov,~软件,这实际是一个高斯一牛顿非线性重复回归程 序112,13].拟合起始,谱带的数目和位置来自酰胺I谱带的二阶微分和去卷积谱.对去卷积谱 以高斯曲线拟台,各谱带的初时半高宽和峰高根据去卷积谱的形状估计.拟合过程中依次 优化峰高,半高宽,最后调整峰位.各组分的含量根据组分谱带的相对面积计算得到= 2结果与讨论 BPP与CL/PC脂质体作用后,其红外光谱1600—1700cm..范围内一带有肩峰的宽谱 带,其中1620-1700cm为酰胺I谱带的位置,此谱带为一螺旋,口一折叠,无规卷曲及 转角等不同结构吸收峰的加合带,彼此严重重叠.为了使各个吸收峰分开,我们首先使用解 卷积软件处理,酰胺I谱带可分离出6个未确定峰位的吸收峰,再对解卷积谱线进行微 分,可进一步确定6个吸收峰的位置拟台谱见rig1(已减去CL/PC脂质体的红外吸 收), Wavenaraber【cm, F.1"l'/lectlrvefnIlgtothedeconvtledspectroscopy .fBPPafterintetacUonwithCLs~~Cliposomes, 一 般来说,一螺旋的红外光谱吸收 峰位在1650—1660cm..范围,口一折叠 分别在1623o3a,.1632ca'n和1675o3a.. 附近有3个吸收峰.无规卷曲常出现在 1643—1649cm范围,而1665crn..和 1680crn附近的两个峰常被认为是转角 结构5,61o1612cm..附近的吸收峰是由于 蛋白或多肽的侧链吸收.BPP与脂作用 后酰胺I谱带的各分离峰的数据见 T曲kl口 其中,1656can处的峰为z一螺旋 的吸收峰,口一折叠结构的吸收峰分别为 1626cm.1635o3a和1675crn1o 1646can被认为是无规卷曲的吸收峰位置,而转角的峰位则在1666cm.依各个分离峰的 面积折算出各自结构的相对百分含量为:39%的口折叠,2O%的一螺旋,35%的无规卷 曲和6%的转角. 我们曾经用同一仪器在相同条件下研究过BPP在D'o水溶液中,由红外光谱酰胺I谱 带经去卷积和曲线拟台得出的二级结构各组分的相对百分含量(Table2J,比较Table1与 Table2.可见,BPP与CL,1oC脂质体相互作用后,其二级结构中一螺旋明显增加,无规 ?0ec 生物物理1995每 卷曲相应碱少,总的口一结构含量变化不大.另外,我们用圆二色方法(CD)也曾研究过 BPP与CLc脂质体作用前后二级结构的变化,结果表明.BPP水溶液与CL,,'PC脂质体作 用前,z一螺旋含量为l18%,作用后升至178%.总的变化趋势与f『r一瓜结果相似(有关 CD详细资料本文未发表) Table1Theso~31K]at3,strt~ureofBPPafterinteractionwithCL/PC~kJesbyFT—IRspectroscopy Tzlile2Thes~ondarystoJ~lql~ofBPPinD^ObyFT—IRspectroscopy 分析BPP分子的氨基酸排列顺序,C端区富含三个脯氨酸残基(2,5,8位),每问隔 三个氨基酸残基出现一个pro,使它们处于同一侧面,致使这一段处于较伸展的状态,不能 形成一螺旋.中央段则出现疏水性一亲水性基团交替规律的分布,加之其中的疏水性侧 链与N端区的pro残基相互作用,使BPP分子外表的一侧表现为极性,另一侧为疏水性 这样的结构特点使其易于形成两性螺旋(amphipathichelix}. 一 般认为,?一螺旋成分增多表示多肽与膜相互作用的程度增强,这种增强可能是由于多肽 部分插入膜的结果.本实验中红外光谱所得结构表明BPP与CL!PC脂质体作用后一螺旋 由1O%增加到20%.这提示BPP可能是部分插入膜,即BPP分子的两性螺旋部分,非极性 一 侧插入膜的疏水区,极性一侧位于膜的亲水表面.此种楔形插膜方式,使多肽通过疏 水区的分子间作用力及亲水区的静电相互作用,稳定膜结构,使脂双层不易发生由L^一H.. 的转变. 我们也注意到,在红外光谱给出的口一折叠的结果中,BPP与脂作用后,其1626cm 附近的峰降低【由l8%一6%),而1635cm附近的峰升高(由l5%一26%).一般认为 1623cm附近的峰代表分子间折叠结构,1632cm附近的峰代表分子内口折叠结构 BPP分子单体由于具有广泛的疏水面,在溶液状态下易于自身缔台,形成多聚体.当其与膜 作用时,原来呈聚合状态的分子散开,适应与膜结台的需要.一般认为大多数口一折叠不能 第3期牛胰多肽与CLfl:'C脂质体作用后二级结构的变化349 像一螺旋一样插入脂膜,而是铺在膜表面,主要通过与脂分子问的静电作用稳定膜结 构,起到保护膜的作用. 总之,用Fr—m的方法研究BPP与CL/PC脂质体相互作用后二级结构的变化,结 果表明BPP与膜作用后其二级结构发生了明显改变一螺旋增多,无规卷曲成分减少, 口一折中的叠中的不同成分发生改变),而这很可能正是BPP实现其抑制脂质体由双层向非 双层转变,从而稳定膜结构,抑制融合,嗍最终达到细胞保护的结构基础.有关这方面的研 究至今未见有其它文献报导,关于BPP分子的插膜程度及其抑制脂多型性转变,我们正准 备用单层膜技术以及P—NMR等其它方法进一步研究证实 参考文献 TM.LJn:6r.蝌inHormone~dbvBGeorge.JerryGlassRavenPros,1980,275—306. 顾增发等:生理.198335:219- 聂橙青等:生物物理.19884(3):205—210 聂橙青等:生物物理.1989208—213 ThomasPAbbott,Waiter,wolf,YVictorWu,RoydmO:Buter~dandR.6KleonanAppS~Spe ctrc~opy, 199l45:1665—1671 6JagdeeshBandekar:BiochiraBioph~Aeta.1992,l】20.123—143 7EwanMTytLemPsL,Richa~MEpand,Song—QirIgNie.RqFEpand,VinodKMishm.YV 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secondarystructureofproteinsandpolypeptideswasus.d.Afterthetreatmentsof deconvolution,derivationandcurvefittingtotheamideIband,theIBultsIevea埘thatt}le structureofBPPvali~whenitinteractedwit}lthemembrane.i.e.theamountof一helices increased,andtheproportionofthedifferentkindsoffl--structurechanged. KeyWords:BovinePancreaticPolypentide(BPP)Secondarystructure CL/PCvesicleFT—IRSp~troscopy 本文于1995年1月19日收到