单增李斯特菌选择性增菌培养分离的初步探讨_cropped

单增李斯特菌选择性增菌培养分离的初步探讨_cropped ()[摘要 ] 目的 :寻找一种良好的增菌培养分离法 ,提高食品中单增李斯特菌 Lm 的检出率 。方法 :对 F ra se r肉汤增菌法 () 进行改良 ,在自行配制的第一液 H a lf - F ra se r肉汤中添加氯霉素 ,观察其对 Lm 及蜡样芽孢杆菌 B 1cereus的影响 ,确定 加入氯霉素的最佳适宜量 。 160份样品同时采用改良 F ra se r肉汤法 、FDA 法 、国标法增菌培养后 ,用传统生化鉴定 Lm ,比 μ较检出率 。结果 :在 H a lf - F ra se r肉 汤中添加 310 g /m l 氯霉素不 会 对 样 品 中 的 Lm 产 生 明 显 的 影 响 , 但 可 有 效 抑 制 B 1cereus的生长 。 3种增菌培养法以 F ra se r肉汤增菌法总检出率最高 ,尤其对速冻食品的检出率达 100 % , FDA 法对灭菌 μ食品的检出率达 100 % 。结论 : H a lf - F ra se r肉汤氯霉素的最佳添加量为 310 g /m l。不同样品类型要用不同的增菌法 , 必要时用 2种以上方法相结合 ,提高食品中 Lm 的检出率 。 [关键词 ] 单增李斯特菌 ;选择性增菌培养分离 ;探讨 + ( ) [中图分类号 ] R378199 4 文章编号 ] 1004 - 8685 2007 05 - 0854 - 02 [[文献标识码 ] A Iso la t ion an d cu lt iva t ion of L is te r ia W u R u i2y ing, H uang B ao2m ing, L iang J un 2he ( )J iangm en Cen te r fo r D isea se Con tro l and P reven tion, J iangm en 529000, Ch ina [ Ab stra ct] O bject ive: To find ou t a good me thod fo r iso la ting and cu ltu ring and to inc rea se the de tec ting ra te of the PCR rap id ( ) de tec tion on the Lm in the food1M e thod s:D evelop ing frase rs, add ing chlo ramphen ical in the first liqu id se lf - m ade- Ha lf - Fra2 ser, ob se rve its influence on the Lm and B 1cereus and dec ide the mo st app rop ria te amount of chlo ramphen ico l1 In 160 sam le s, we a ll adop ted the imp roved frase r, FDA , in te rnationa l cu ltu ring, and then exam ine the Lm w ith the PCR and compa re the detecting ra te1Resu lts: The re wa s no influence obvious on the Lm of the Ha lf - F ra se r and it can effectively con tro l the grow th of B 1cereus1 In the three m ethod s fo r cultu ring, the h ighest to ta l de tec ting ra te wa s in the frase r, e sp sc ially that on the qu ick - freezed food1The de2 tec ting ra te wa s up to 100% and the de tec ting ra te on the ste rile food tested by FDA wa s a lso up to 100% 1Conc lus ion : The mo st ap2 μp rop ricte amount of chlo ramphen ico l in the Ha lf - Fra se r is 310g /m l1D ifferent type s of samp le need diffe rent cultu ring and one e2 ven needs two o r mo re than two m e thods when nece ssa ry to inc rea se the de tec ting ra te of Lm in the PCR rap id de tec tion1 [ Key word s] L isteria m onocy togenes; Cho sen iso la ting and cu ltu ring; Exp lo ra tion (()) 单核细胞增多性李斯 特菌 L 1m onocy togenes, Lm 是 一 种 样芽孢杆菌 B 1cereus由本实验室保存 。 () 重要的人畜共患疾病的病原体 ,因其在 4? 能生长繁殖且感 11112 培养基 单增李斯特菌选择性增菌肉汤 LB, LB、 1 2 () 单增李斯特菌选择性琼脂帄板 MMA 、含 016 % 酵母膏的胰 染该菌后病死率高 ,因而在公共卫生和食品卫 生安全中越来 ( ) ( ) 越受到重视 。现 有 的 Lm 的 快 速 检 测 方 法 有 免 疫 酶 染 色 法 , 酪胨大豆琼脂 TSA - YE 及其肉汤 TSB - YE ,均购于北京 ( ) V IDA S全自动荧光免疫分析法 ,基因探针法 ,聚合酶链反应法 陆桥生物技术公 司 。单 增 李 斯 特 菌 增 菌 肉 汤 L EB 、含 5 % 2 [ 2 ] [ 3 ] 等 。但由于各种原因 ,如食品中的 Lm 数量低于 10cfu / g,或 () 兔血李斯特菌 琼脂 LMBA , 参照 FDA 方 法 和 M a rfin的 受生产 、包装 、贮存 、运输等条件的影响而导致 Lm 的毒力缺失 选择性复苏试剂盒自行配制 。 F ra se r肉汤增菌法以 H a lf - F ra2 或变异 、核糖体退化 、酶活性减弱等 , 均可限制 快速检测法在 se r肉汤为第一增菌液 ,由本实验室配制 , F ra se r肉汤为第二增 食品中 Lm 的检出率 。因此要准确检出 Lm ,就要有效地将样 菌液由梅里埃公 司提供 。MMA 分离 培养基由北京陆桥商 检 品中含菌量少的或受损的李斯特氏菌进行增菌复苏 。良好的 技术公司提供 。鉴定试剂 三糖铁 、半固 体及系统生化培养基 (增菌培养基是提高检出率的重要手 段 , 为找出 一种理想的增 MR - V P试验 、硝酸盐还原试 验 、过氧化 氢酶试验 、甘露醇 、 [ 1 ]) 菌培养法 ,我们对 F ra se r肉汤增菌方法 进行改良 ,并与 FDA鼠李糖 、七叶 苷 、溶 血 试 验 、协 同 溶 血 试 验 由 本 实 验 室 依 据 法和国标法进行比较 ,结果如下 。GB478930 - 94配制 。 11113 化学试剂 吖啶黄 、萘啶酮酸 、放线菌酮 、七叶苷 ,均购 于北京陆桥生物技术公司 ;丙酮酸钠 、巯基醋酸钠购于佛山化 1 材料与方法 学试剂公司 ;氯霉素购于珠海银科生物技术研究所 。 111 材料 11114 样品 各类熟食 、生肉 、速冻食品 、盒装消毒奶由公卫 11111 标准菌株实验用的 2株单增李斯特菌标准株由卫生 科到各大市场采样 。 部食检所提供 , 4株分离株由本实验室从食品中分离得到 ,蜡 112 方法( )[基金项目 ] 江门市卫生局课题 04B012 11211 F ra se r肉汤的优化试验( ) [作者简介 ] 吴瑞英 1970 - ,女 ,学士 ,副主任技师 , 主要从事 ()1121111 氯霉素对李斯特菌 以 Lm 为指标 及 B 1cereus的抑 微生物检测工作 。 ()菌作用 :将 Lm 标准菌株 或分离株 和 B 1cereus分别接种于自 μH a lf - F ra se r肉汤培养液中 ,调整细菌浓度为 行配制的第一液 内呈阳性 。说明在 H a lf - F ra se r肉汤中添加 310 g /m l 的氯 5 μ霉素不 会 对 样 品 中 的 Lm 产 生 明 显 的 影 响 , 并 有 效 抑 制10cfu /m l左右 ,将 150 l 混有细菌的肉汤分别加入到 96 孔 μ( ) B 1cereus的生长 。反应板中 ,分别加入 20 l 各种浓度 100 ,10 m g /L 的氯霉 213 FDA 法 、国标法和改良 F ra se r肉汤培养法对不同样品单 素使其最终浓度为 10,1 m g /L , 30 ? 培养 24 ,48 h,每隔 4 h 于酶标仪上测 OD值 ,试验同时设不加抗生素的阳性对照和 增李斯特菌的检出结果 490 改良的 F ra se r肉汤培养法对食品样品的总检出率最高 ,尤不加细菌的阴性对照 。根据上述结果确定加入氯霉素的最佳 适宜量以改善 H a lf - F ra se r液对杂菌的抑制作用 。 其是对速冻食品的检出率达到 100% ,对消毒牛奶 、熟食及生 1121112 增菌效果试验 : 将 Lm 标准菌株接种于改良 的 H a lf猪肉的检出率 也分别达到 7510% , 8010% , 6617 % ; FDA 法对 6 μ- F ra se r肉汤中 ,调整菌液浓度为 10cfu /m l,把 20 l 混有细 食品的帄均检出率为 7718% , 对灭菌食品的检出率 最高 , 达 100 % ;而国标法对各类食品的检出率均低于 FDA 法和改良的菌的肉汤加到 96孔板中 ,并做 10 倍递减稀释 ,使其最终浓度 5 () F ra se r肉汤培养法 见 1。为 10,10 cfu /m l, 30? 培养 12 ,48 h,每隔 4 h 观察 1 次结 果 ,根据李斯特菌能水解七叶苷生成葡萄糖和 七叶素与二价 表 1 不同增菌法对不同样品的单增李斯特菌检出率 ( %)的比较 铁离子反应生成黑色化合物这一生 化特性 , 判 断肉汤变黑为 阳性 。 样品 数量 单增李斯特菌检出总 计Fra se r肉汤法 FDA 法 国标法 11212 样品中单增李斯特氏菌的分离鉴定 ()()()生猪肉 50 3 2 6617 2 6617 1 3313 () 1121211 样品处理 : 25 m l 或 25 g样品 ,液体摇匀直接加入 ,速冻食品 ()()()50 6 6 10010 5 8313 4 6617 各类熟食 (固体于无菌搅拌器中搅拌均匀后加到 225 m l 增菌肉汤中 详 ()()()20 5 4 8010 3 6010 2 4010 盒装消毒) 见 1121212增菌方法 。 ()()()40 4 3 7510 4 10010 2 5010 奶 合计 1121212 增菌方法 :对同一样品同时用 3 种方法进行增菌培 ()()()15 8313 14 7718 9 5010 160 18 养 : ?国标法 :先将样品加到 LB肉汤中 30?培养 24 h,取出 1 ( ) 内为检出率011 m l加入 10 m l LB增菌液中进行二次增菌 , 48 h 后接种到 2 ( MMA 琼脂 。 ? FDA 法 : 样品加到 L EB 肉汤 含 0125% 丙酮3 讨论 ) 酸钠和 0101 % 巯基乙酸钠 中 30? 预增菌 8 h,加入选择性 由于蜡样芽孢杆菌和单增李斯特菌同属革兰阳性需氧杆 试剂 Y啶黄 、萘啶酮酸 、放线菌酮 , 30?培养 24,48 h,将增菌 菌 ,在营养要 求 上 有 很 多 共 通 点 , 蜡 样 芽 孢 杆 菌 广 泛 分 布 于 肉汤接种到 LMBA 琼脂 。 ? 改良的 F ra se r增菌法 : 样品直接 水 、土壤 、尘埃 、淀粉制品 、乳及乳制品等食品中 , 该菌对外抵 加入到改良的 ha lf - F ra se r肉汤 , 30 ? 培养 12 h,后取增菌液 抗力较强 ,在食品检测过程中常成为主要的 杂菌 。单增李斯 011 m l加入到 F ra se r肉汤中 , 30? 培养 24 h 见黑色后将肉汤 特菌和蜡样芽孢杆菌对氯霉素都较为敏感 。选用蜡样芽孢杆 转种到 MMA 琼脂 。 菌作为对照菌 ,通过反复试验摸索氯霉 素加入的有效浓度是 1121213 鉴定 :挑取可疑典型菌落 ,分别进行革兰染色 、显微 非常必要的 。 镜下观察动力及传统生化方法鉴定 。 本文对 F ra se r肉汤增菌法进行改良 ,实验结果表明 ,在其 μ中自行配制的第一液 H a lf - F ra se r肉汤加入 310 g /m l 的氯 2 结果 霉素可以有效地抑制蜡样芽孢杆菌等杂菌的生长 , 而不会对 211 氯霉素对 Lm 和 B 1cereus的抑菌作用Lm 产生明显的影响 ,可以检出 1,10 cfu /m l浓度的 Lm 菌 ,通 结果显示 ,在 30? 培养 10 h 后添加大于 410 m g /L 氯霉 过与 FDA 法和国标法相比较 ,改良的 F ra se r肉汤培养法对各 素的 H a lf - F ra se r肉汤中 , Lm 标准菌株和分离 菌株均受到明 种食品 Lm 的总 检出率明显高于国 标 法 , 同 时 也 略 高 于 FDA 显的抑制 ,但 20 h 后含 410 m g /L 氯霉素的 H a lf - F ra se r肉汤 法 。在第二增菌液 F ra se r肉汤是否需要添加氯霉素 ,还有待日 中 Lm 标准菌株 和 分 离 菌 株 有 明 显 生 长 , 吸 光 度 A分 别 为 490后探讨 。 01213 , 01195 , Lm 分 离 菌 株 在 含 510 m g /L 氯 霉 素 的 H a lf - 本试验结果显示 , 3 种增菌法以改良 F ra se r肉汤培养法对 F ra se r肉汤中亦有明显生长 , A为 01148 ,添加氯霉素浓度小 490速冻食品中的单增李斯特菌的检出率最高 , FDA 法对消毒食 于 315 m g /L 的 H a lf - F ra se r肉汤中 Lm 标准菌株和分离菌株 () 品 如经巴氏消毒的盒装奶 的检出率最高 ,这说明 F ra se r肉 在 10 h培养后的 A分别为 01223, 01198,在 20 h培养后 A490490 汤培养法对速冻食品中的 Lm 增菌效果显著 , 而 FDA 法对于 (分别为 01420 , 01391 阴性和阳性对照 A分别为 0109, 0131 490消毒食品中受损的 Lm 的修复效果更明显 。提示我们在实际 ) 左右 ,这说明在 410 m g /L 以下浓度的氯霉素会延长 Lm 的生 检测中 ,不同的食 品 类 型 , 要 用 不 同 的 增 菌 法 , 必 要 时 可 用 2 长速度 ,但不会抑制其生长 ,而 B 1cereus对于氯霉素十分敏感 , 种以上的方法相结合 ,以提高 Lm 菌在快速检测中的检出率 。 不同添加浓度培养时间的 A均小于 0108。 490 参考文献 ] [212 改良的 F ra se r肉汤对单增李斯特菌和 B 1cereus增菌效果 μ分别在 H a lf - F ra se r肉汤中添加 215 , 310, 315 g /m l的氯 [ 1 ] 温瑞荣 ,符振华 ,王少明 , 等 1V IDA S自动免疫分析系统快速检测 μ 霉 素 , 含 315 g /m l 的 氯 霉 素 的 H a lf - F ra se r 肉 汤 可 以 使( ) 食品中的李斯特氏菌 [ J ] 1中国卫生检验杂志 , 1999 , 9 1 : 4912 10cfu /m l 以 上 浓 度 的 单 增 李 斯 特 菌 在 48 h 内 呈 阳 性 , 而[ 2 ] A n thony DH1B ac terio logica l ana lytica l m anua l[M ] 18 th Ed ilion. R evi2 4 B 1cereus 的 浓 度 则 要 在 10cfu /m l 以 上 才 显 阳 性 ; 含sion A , 19981Chap te r 101 μ310 g /m l氯霉素的 H a lf - F ra se r肉汤可以使 10 cfu /m l 以上 [ 3 ] L ain M an in, Stan ley E1R ap id de te rm ina tion of L isteria m onocy togenes in food s u sing a re su sc ita tion / se lec tion / k it system de tec tion [ J ] 1J 浓度的 Lm 标准菌株和分离菌株在 48 h 内呈阳性 ,而 B 1cereus 2 AOAC In te rna tional, 1993 , 76: 632 - 6361 μ的浓度则要在 10cfu /m l以上才显阳性 ;含 215 g /m l的氯霉 0 ()收稿日期 : 2006 - 11 - 14 素的 H a lf - F ra se r肉汤可以使 10cfu /m l的 Lm 标准菌在 48 h