20100629Helica黄曲霉毒素B1试剂盒

20100629Helica黄曲霉毒素B1试剂盒 北京博欧实德生物技术有限公司 | www.biostest.com 黄曲霉毒素B1竞争性ELISA检测试剂盒 941AFL01B1 前言 黄曲霉毒素是由多种霉菌如黄曲霉和寄生曲霉产生的有毒代谢物，有致癌性，在谷物，坚果，棉花种籽或其他食品或饲料相关的商品中存在。作物主要被以下四种亚型中的一种或多种污染:黄曲霉毒素B1，B2，G1和G2。黄曲霉毒素B1毒性最强，是主要的检测类型，但如其他类型的浓度很高，同样具有很大的危害性。黄曲霉毒素可导致人罹患肝细胞癌，黄曲霉毒素中毒，瑞氏综合症和其他慢性疾病。动物通过进食被污染的饲料接触到黄曲霉毒素，这些饲料在生长，收获或储藏中被生产黄曲霉毒素的真菌污染。因此，大多数国家都限制食品或饲料中黄曲霉毒素B1的含量。 适用范围 HELICA黄曲霉毒素B1检测试剂盒可用于对谷粒，坚果，咖啡豆，谷物及其加工制品和其他商品及饲料中黄曲霉毒素B1含量进行定量检测。 检测原理 HELICA 黄曲霉毒素B1检测试剂盒原理为固相直接竞争性酶联免疫。聚苯乙烯微孔中包被有对黄曲霉毒素B1具有高亲和力的抗体。采用70%甲醇提取样品中的毒素。将辣根过氧化物酶(HRP)标记的黄曲霉毒素B1和样品提取物混匀，再移取至微孔，二者与包被抗体竞争结合。孵育一定时间后，倾倒微孔中的物，洗涤非特异反应物。随后加入HRP底物—TMB，因为发生酶催化作用，微孔中溶液颜色变为蓝色。颜色强度与和抗体结合的HRP标记黄曲霉毒素B1的量成正比，与和抗体结合的样品或品中黄曲霉毒素B1的浓度成反比。因此随着样品或标准品中黄曲霉毒素B1浓度增加，颜色强度将降低。最后加入酸性终止溶液，终止反应并将微孔中溶液颜色变为黄色。使用酶标仪在450nm下检测微孔中溶液的OD值。比较样品OD值与试剂盒提供的标准品的OD值，即可获得检测结果。 试剂盒 HELICA 黄曲霉毒素B1检测试剂盒由以下产品组成: 96孔微孔板(12条，8孔/条，包被有鼠1袋 包被抗体的微孔板 抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体) 1板 稀释孔(绿色) 96孔未包被抗体的微孔 每瓶1.5 mL，黄曲霉毒素B1浓度依次为: 6瓶 黄曲霉毒素B1标准品 0.0，0.2，0.5，1.0，2.0和4.0 ng/mL，溶 于有机溶剂 25 mL，与辣根过氧化物酶(HRP)结合HRP标记黄曲霉毒素B1结合1瓶 的黄曲霉毒素B1，溶于含防腐剂的缓冲物 液 1瓶 底物试剂 15 mL，稳定的四甲基联苯胺(TMB) 1瓶 终止液 15 mL，酸性溶液，即用型 北京博欧实德生物技术有限公司 | www.biostest.com 需要但没有提供的材料 研磨机 收集瓶:至少125 mL容量 天平:20 g测量能力 量筒:100 mL 甲醇:70 mL/样品 去离子水或蒸馏水:30mL/样品 滤纸:Whatman 1#或等效的 移液器及枪头:100μL和200μL 定时器 洗瓶 纸巾 装载450nm滤光片的酶标仪 注意事项 1. 在使用之前将所有试剂恢复至室温(19?-27?) 2. 于2-8?保存试剂，不要超过有效期后使用，不要冷冻试剂盒组分。 3. 不要将已移取但未使用的试剂转移取回原瓶。检测步骤已明确指出所需的体积。 4. 待检样品的pH 应为7.0(?1.0)，过碱或过酸都会影响检测结果。 5. 遵循操作步骤中的时间和温度条件。 6. 不要用口移取试剂。 7. 标准品是易燃的。小心使用与保存。 8. 终止液含酸。不要接触皮肤和眼睛，如接触，请用清水冲洗。 9. 注意所有接触样品和标准品的材料，容器和设备会被黄曲霉毒素B1污染。在使用此试 剂盒时，请佩戴防护手套和防护眼镜。 10. 在使用后请妥善处理所有材料，容器和设备。 样品制备 注意:必须依据正确的采样技术收集样品。 1. 制备提取溶液(70%甲醇)(以单个待测样品为单位):向70mL试剂级甲醇中加入30mL 蒸馏水或去离子水。 2. 研磨代性样品至速溶咖啡颗粒大小(50%可通过20目筛)。 3. 称取20g研磨好的样品，加入100mL提取试剂(70%甲醇)。 注意:样品与提取试剂的比值为1:5(w/v)。 4. 密闭振荡2分钟以混匀，或利用搅拌机。 5. 待颗粒物质沉淀后，用Whatman1#滤纸(或等效的)过滤5-10mL提取物，收集滤液待 北京博欧实德生物技术有限公司 | www.biostest.com 测。这就是用于检测的样品溶液。 检测步骤 注意:推荐使用多通道移液器，如果使用单通道移液器，建议样品和标准品总量不要超过16个(2组检测条)。 1. 在使用之前将所有试剂恢复至室温。 2. 每个标准品和待测样品(包括平行样品)都需要一个稀释孔，取出相应数量的稀释孔置 于微孔架上，再取出相同数量包被抗体的微孔置于另外一个微孔架上。 3. 向每个稀释孔移取200μL酶标记结合物 4. 使用新的枪头向加有结合物的稀释孔移取100μL标准品或样品(每一次移取均采用新枪 头)，并通过轻柔吸打混匀，至少吸打3次。注意:全程每一个标准品和样品的位 置 5. 从每个稀释孔的内容物中移取100μL，转移至相应的抗体包被微孔中(每一次移取均使 用新枪头)。室温孵育15分钟。 6. 孵育完成后，将微孔中内容物倒入废液缸，采用将蒸馏水或去离子水注满孔再倒出的方 法洗涤微孔。重复4次，总共5次洗涤。 7. 在最后一次洗涤后，翻转的微孔板置于纸巾上并拍打以去除残留的洗涤液。 8. 计算所需要的底物试剂的体积(1mL/条或120μL/孔)，置于单独的容器内。再向每个孔 移取100μL。室温孵育5分钟。 9. 计算所需要的终止液的体积(1mL/条或120μL/孔)，置于单独的容器内。再以与底物添 加相同的顺序和速度向每个孔移取100μL。 10. 使用酶标仪在450nm下读取每个微孔的OD值，完成后记录。 结果解释 利用未修正的OD值或% OD值与标准品中黄曲霉毒素B1的浓度构建剂量反应曲线(未修正的OD值或% OD值为纵坐标，标准品浓度的对数值为横坐标，推荐用% OD值):% OD值为所获得的标准品或样品的OD值与第一个标准品(0标准)的OD值的百分比，0标准等于100%。再利用构建的标准曲线读出样品中黄曲霉毒素B1浓度。 标准品(或样品)的OD值 × 100 = %OD值 0标准的吸光度值 标准品瓶标签所示意的含量为标准品的含量。然而，样品已被70%甲醇5:1稀释，因此标准品的黄曲霉毒素B1含量应乘以5才能指示每g样品中黄曲霉毒素B1的实际含量(ppb)，最高标准品浓度为4.0 ng/mL，相当于样品中浓度为20 ppb，如果样品浓度高于20 ppb，应用70%甲醇适当稀释再检测。并在最终的结果计算中应考虑额外的稀释步骤。 北京博欧实德生物技术有限公司 | www.biostest.com 标准品(ng/mL) 样品(ppb) 0.0 0.0 0.2 1.0 0.5 2.5 1.0 5.0 2.0 10.0 4.0 20.0 附录 性能数据 批内差异 样品(ppb) 平均OD CV% 0.0 1.835 1.9 1.0 1.626 1.5 2.5 1.283 1.0 5.0 0.720 2.4 10.0 0.338 1.0 20.0 0.147 1.0 批间差异 样品(ppb) B/B% CV% 0 0.0 82.6 3.0 2.5 60.6 5.1 5.0 33.6 4.8 10.0 16.6 6.0 20.0 7.7 7.8 检测限 玉米:, 1.0 ppb n = 10 花生:, 1.0 ppb n = 10 交叉反应 B1-100%