牛磺鹅去氧胆酸钠的提取及与鹅去氧胆酸钠的药理作用比较

牛磺鹅去氧胆酸钠的提取及与鹅去氧胆酸钠的药理作用比较 牛磺鹅去氧胆酸钠的提取及与鹅去氧胆酸 钠的药理作用比较 第24卷第1O期 2007年10月 精细化工 FINECHEMICALS Vo1.24.No.10 0ct.2OO7 簿辩嬲 中药瑷代化技术 牛磺鹅去氧胆酸钠的提取及与鹅去氧胆酸钠的 药理作用比较 公瑞煜,张达,吕志良,都丽萍,张立东,李建蓉,乔学亮 (1.华中科技大学同济医学院药学院,湖北武汉430030;2.华中科技大学同济医学院基础医学院,湖北武汉430030; 3.华中科技大学材料学院,湖北武汉430074) 摘要:以500mL鸡胆汁为基本原料,采用沉淀,过滤,减压蒸馏,真空干燥,抽捉,重结晶法,制得了7.2g结合型 的牛磺鹅去氧胆酸钠(TCDCANa),以TLC及IR法确定其结构.并将其与鹅去氧胆酸钠(CDCANa)进行镇咳,平 喘和祛痰作用对比实验.药理实验结果为:TCDCANa和CDCANa的镇咳作用减咳 5.6)%和 率分别为(29.1? (18.2?6.8)%;平喘作用解痉率分别为(79.9?22.8)%和(73.3-4-22.7)%,祛痰作用酚红排泌量分别为 (1.601?0.391)mL和(1.029?0.308)mL,TCDCANa与CDCANa间存在显着性差异(P<0.01).药理 实验结果明,TCDCANa具有明显的镇咳,平喘,祛痰和抗炎作用,其作用强于 CDCANa. 关键词:鸡胆;牛磺鹅去氧胆酸钠;药理作用;中药现代化技术 中图分类号:TQ464.5文献标识码:A文章编号:1003—5214(2007)10—0975—04 ExtractionofSodiumTaur0chen0de0xych0lateandComparisonof ItsPharmacologicalEffectwithSodiumChen0de0xych0late GONGRui—yu,ZHANGDa,Lt)Zhi.1iang,DULi—ping,ZHANGLi—dong,LIJian— rong,QIAOXue—liang (1.PharmaceuticalSchoolofTongiiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030, Hubei,China;2.DepartmentofPathogenicBiologyofTongiiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceand Technology,Wuhan430030,Hubei,China;3.DepartmentofMaterialScienceandEngineering,HuazhongUniversityof ScienceandTechnology,Wuhan430074,Hubei,China) Abstract:From500mLchickenbile,7.2gsodiumtaurochenodeoxycholate(TCDCANa)wasprepared throughdeposition,filtration,vacuumdistillation,vacuumdrying,extractionandrecrystallization.Its structurewasdeterminedbyTLCandIR.Antitussivetest,antiasthmatictestandexpectoranttestwere madewithTCDCANaandsodiumchenodeoxycholate(CDCANa).Pharmacodynamicresultsgavethe antitussiveratesof(29.1?5.6)%and(18.2?6.8)%,antispasmodicratesof(79.9?22.8)% and(73.3?22.7)%,andexcretionofphenolred(1.601?0.391)p,g/mLand(1.029?0.308) g/mLrespectively.TherearesignificantdifferencesinallthosetestsbetweenTCDCANaand CDCANa(P<0.01).ItisprovedthatTCDCANahasmoreevidentantitussive,antispasmodicand expectoranteffectsthanCDCANa. Keywords:chickenbile;sodiumtaurochenodeoxycholate;pharmacologicaleffect;modernization technologyofChinesemedicines 收稿日期:2007—02—09;定用日期:2007—03—16 基金项目:国家自然科学基金项目(No.30160083);华中科技大学同济医学院基金项目(No.00MY21—30);华中科技大学基金项目(No. 02022Y一12) 作者简介:公瑞煜(1962一),男(白族),云南大理人,讲师,博士研究生,师从乔学亮教授,主要从事新药开发和高分子分散剂的研究,电 话:027—83657784,E—mail:gongruiyu@163.COB. 联系人:李建蓉,女,博士,副教授,电话:027—83650550,E—mail:irli@mails.tjmu.edu.cno ? 976?精细化工FINECHEMICALS第24卷 Foundationitems:GrantedbynationalnaturalsciencefoundationofChina(30160083);gran tedby ~undationofTon~iMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology(00M Y21— 30);grantedby~undationofHuazhongUniversityofScienceandTechnology(02022Y一12) 牛磺鹅去氧胆酸钠(sodiumtaurochenodeoxy. cholate,TCDCANa)是鸡,鸭等家禽类动物胆汁中的 主要胆汁酸成分,也是蛇胆汁中的主要胆汁酸成分 之一,是一种重要的生化药物.以往报道_l的胆 汁酸药理作用,大多以游离型胆汁酸盐为研究对象, 实际上新鲜的动物胆汁中,几乎不含游离型的胆汁 酸盐,若保存方法不当或肝胆疾病,可使结合型的 TCDCANa分解为游离型的CDCANa.传统的提取 工艺首先将家禽胆汁皂化,经酸化,脱脂,沉淀等步 骤后,得到游离型的鹅去氧胆酸(chenodeoxvcholic acid,CDCA),该法收率低,步骤多,工艺复杂,难以 得到大量纯度较高的成品,且不能得到结合型的 TCDCANa.TCDCANa由于亲水性强J,不易从胆 汁中分离提取,故限制了其药理作用的研究. 作者从新鲜鸡胆汁中,未经皂化直接提取得到 结合型的TCDCANa,对其结构进行了表征,并与 CDCANa进行了初步的镇咳,祛痰,平喘等药理作用 对比研究,如下供同行参考. 1材料 1.1试剂及药品. 乙酸乙酯,乙醇,乙醚,氯仿,甲醇,冰醋酸,正丁 醇均为AR;薄层硅胶G(60型),青岛海洋化工厂生 产;牛磺鹅去氧胆酸对照品购自美国Sigma公司;鹅 去氧胆酸,生物制品,购自上海广茂生化制品有限公 司;新鲜鸡胆汁购自武汉市竹叶山杀鸡场. 1.2动物 小白鼠(昆明种)体重(18,22)g,购自华中科 技大学同济医学院动物实验中心,雌雄兼用,饲养室 温(25?2)oC,按性别分笼,自由饮水和进食. 1.3仪器 LMS一2A型二道生理仪(成都仪器厂); 721型分光光度计(上海分析仪器厂);H'IR红外光 谱仪(SpectrumOne,Perking—ElmerCo.,America). 2方法 2.1牛磺鹅去氧胆酸的提取和纯化 取新鲜鸡胆汁500mL,加入3倍体积的W (C:HOH)=95%的乙醇,搅拌30min,静置24h, 过滤.滤液减压蒸干(?50oC),然后置真空干燥器 抽真空干燥2d,即得鸡胆粉.将鸡胆粉用(乙酸 乙酯):V(无水乙醇)=8:2的混合液,以索氏抽提器 提取30次,冷却提取液,得浅黄色固体,过滤,沉淀 用无水乙醚洗涤,置真空干燥器中干燥4h,用无水 乙醇重结晶,得浅黄色TCDCANa结晶7.2g. TLC检查:硅胶G为吸附剂,以质量浓度为1 mg/mL的样品MeOH液点样5L,以(氯仿):V (甲醇):V(水)=65:28:4混合液为展开剂,展开15 cm,喷洒w(磷钼酸)=5%的乙醇溶液,110oC烘烤 10min显色. IR检查:以KBr压片制样,FFIR红外光谱仪 (SpectrumOne,Perking—ElmerCo.,America)室温扫 描. 2.2牛磺鹅去氧胆酸钠的药理作用 用上述方法提取得到的TCDCANa,质量分数达 92%以上,其药理统计学方法采用t检验分析. 2.2.1镇咳作用 采用浓氨水引咳法,选取(20?2)g健康小鼠, 雌雄各半随机分组.将小鼠放于密封的钟罩内,用 玻璃雾化器喷入浓氨水,1min后,立即取出小鼠, 置烧杯内观察,以小鼠腹肌收缩,张口为咳嗽指标, 记录1min内咳嗽次数(无咳嗽或咳数少于30次的 为不敏感,弃之),立即灌胃给药.空白对照组给生 理盐水0.5mlM只;阳性对照组给可待因注射剂0.5 mlM只;实验组分别给TCDCANa和CDCANa水溶液 (质量浓度为10mg/mL)0.5mlM只.1h后,依上 法再次给予氨气刺激,记录给药后的咳嗽次数. 2.2.2平喘作用 选取(300-4-20)g健康豚鼠,随机分组.急性 处死后,剪下自甲状软骨下至气管分叉处的一段气 管后,在通以V(O:):V(CO:)=95:5混合气体的38 ?克氏液中,细心剥离气管周围结缔组织.将气管 软骨环问横切为5,6段,用棉线将各段结扎成链 状.将此标本置于盛有38?克氏液的浴管中,连通 二道生理仪.当气管链基线稳定后,向20mL浴管 中注入3×10mol/L乙酰胆碱(Ach)0.1mL,促 使气管链痉挛收缩.当气管链收缩幅度达到峰值 时,加供试液.空白对照组给生理盐水1mL,以W (氨茶碱)=5%的水溶液0,4mL为阳性对照 (Aminophylline),实验组分别给80mg/mL的 TCDCANa和CDCANa的水溶液1mL.观察它们对 Ach的抵抗作用. 2.2.3祛痰作用 选取(20?2)g健康小鼠,随机分组.分别灌 第10期公瑞煜,等:牛磺鹅去氧胆酸钠的提取及与鹅去氧胆酸钠的药理作用比 较?977? 胃给药,2次/d,连续3d,实验前先将小鼠禁食12 h,只供饮水.空白对照组给生理盐水0.5mL/只; 实验组分别给10mg/mL的TCDCANa,CDCANa水 溶液0.5mL/只.最后一次给药0.5h后,皮下注射 2.5g/L的酚红溶液0.4mL/只.又过0.5h,将小 鼠颈椎脱臼致死,仰位固定于木板上.切开颈正中 皮肤,找出气管,在其下穿一根线备结扎用.将6号 针头从小鼠喉头刺入气管0.3cm.用1mL注射器 抽取50L的NaHCO水溶液0.4mL,抽洗3次, 将冲洗液注入小试管中.如此再重复操作4次,将 5次冲洗液混合,并用P(NaHCO)=50g/L的水溶 液稀释至3mL,1500r/min离心分离.5min后,小 心分取上清液,于波长540nm处,以P(NaHCO)= 50L的水溶液为空白,进行比色,将所得吸光度 代入酚红标准曲线回归方程?J,求出小鼠气管酚红 排泌量 3结果与讨论 3.1TCDCANa的提取及结构表征 作者以新鲜或冷冻鸡胆汁为原料,经沉淀,过滤, 减压蒸馏,真空干燥得鸡胆粉,然后将鸡胆粉以乙酸 乙酯一无水乙醇混合溶剂为提取液,在无水环境下抽 提,制得TCDCANa粗品,经无水乙醇重结晶,制备了 TCDCANa,经TLC检测,除主斑点之外无其他可见斑 点,且R值与对照品TCDCANa(Sigma公司产品)一 致,表明其W(TCDCANa)?92%.TCDCANa和 CDCANa的IR谱图分别示于图1和图2. 图1TCDCANa的红外光谱图 Fig.1IRspectrumofTCDCANa TCDCANa的IR结果,cm一:3421(/20H+ /2NH),2932(/2cH),2867(/2cH),1643(/2c—o), 1548(NH),1446(.cH),1373(.cH),1208 (/2一.),1049(.).与对照品的红外光谱一 致.由此可知,3421cm的强峰为伯胺N—H键 和羧基0一H键的伸缩振动吸收峰,且仲胺基 (1548cm),酰胺基(1643cm),磺酸基 (1208,1049cm)等特征吸收峰的存在,显示其 结构中有酰氨基(一C0NH一)和磺酸基,TCDCANa 为结合型胆汁酸.本法的主要特点是未经皂化,保 持了TCDCANa的结合形式,使其更接近体内的生 理状态 图2CDCANa的红外光谱图 Fig.2'IRspectrumofCDCANa 3.2TCDCANa与CDCANa的药理作用比较 动物性药物是中药的重要组成部分,具有资源 丰富,疗效好的特点.在新药开发研究中,人们已倾 向于应用现代生化实验技术手段从动物性药物中分 离提取出各种有效成分,并对其药理作用进行深入 细致的研究. 3.2.1镇咳作用比较 作者以浓氨水引咳法,将TCDCANa与其游离 型CDCANa进行了镇咳作用比较.镇咳作用以减 咳率表示.按下式计算每只小鼠的减咳率: 减咳率=越慧簇.% 结果见表1. 表1胆汁酸对熏氨小鼠咳嗽的影响 Table1Influenceofbileacidsonmicecoughedbyammonia 由表1可见,TCDCANa和CDCANa对熏氨引咳 的小鼠,均有明显的镇咳作用(P<0.01),且 TCDCANa的作用强于CDCANa(P<0.01). 3.2.2平喘作用 采用乙酰胆碱引喘法,考察TCDCANa与 CDCANa的平喘作用,结果见表2.解痉率按下式 计算: 解痉率=.% ? 978?精细化工FINECHEMICALS第24卷 表2 Table2 TCDCANa,CDCANa对Ach引喘豚鼠解痉率的影响 EffectofTCDCANaandCDCANaonantispasmodic rateoftracheaofguineapigwithAch 结果表明,TCDCANa和CDCANa对Ach引起的 气管链痉挛具极明显的解痉作用(P<0.01),且 TCDCANa的作用强于CDCANa(P<0.01),显示 TCDCANa比CDCANa有明显的平喘作用. 3.2.3祛痰作用 祛痰作用采用酚红排泌法,结果见表3. 表3对小鼠气管酚红排泌量的影响 Table3Influenceonexcretionofphenolredofmice 结果表明,TCDCANa,CDCANa均能显着增加小 鼠气管酚红排泌量(P<0.01),且TCDCANa比 CDCANa作用强(P<0.01),显示TCDCANa比 CDCANa有明显的祛痰作用. 4结论 本文以新鲜鸡胆汁为原料,经沉淀,过滤,减压 蒸馏,真空干燥,抽提,重结晶等步骤,未经色谱法提 纯,即可制得TCDCANa,质量分数?92%.药理实 验x41%研究结果表明,TCDCANa和CDCANa均具有 明显的镇咳,平喘和祛痰作用,且TCDCANa的作用 强于CDCANa.鸡胆,蛇胆,熊胆等天然胆汁中主要 含结合胆汁酸,游离胆汁酸含量极微或没有,本研究 结果提示,这些动物胆汁对镇咳,平喘和祛痰起主要 作用的是结合胆汁酸.胆汁酸盐是一类表面活性 剂,当其分子中结合了水溶性氨基酸后,亲水性明显 增强,其表面活性也相对增强,它对生物膜的通透性 及膜的表面结构将产生更大的影响. 参考文献: [1]公瑞煜,李建蓉,张亚,等.牛磺胆酸钠的制备及与胆酸的药 效的对比[J].精细化工,2002,19(8):482—485,488. 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[7]徐淑云.药理实验方法学[M].第2版.北京:人民卫生出版 社.1991.714—1167. 第十二届亚太化.T.联盟大会暨q-E.T.展览会 招展 经国务院批准,由亚太化学工程联盟[APCCHE],中国大连市人民政府,中国化工学会[CIESC],中国化工企业管理协 会[CCEMA]联合主办的"第十二届亚太化工联盟大会暨化工展览会(中国?大连)",定于2008年8月4,613在大连世界 博览广场举行.《精细化工》编辑部是承办单位之一. 会议期间,将有美,英,日,澳大利亚,新加坡,泰国,韩国,马来西亚,印度尼西亚,菲律宾等13个国家和地区的化学工 程学会(协会)的专业展团,及欧洲化学工程联盟,北美化学工程联盟,国际腐蚀协会等多家国际知名机构与会.国际知名 协会(学会)的组织,政府的直接参与,千余名世界知名专家,学者的莅临,铸就这一会展的权威性,国际性,届时将有约800 家国内外知名企业参展,有近两万平米展览面积,展会,研讨相得益彰,盛况空前,是相关企业寻求外向发展及H~'t-企业来 华发展的绝佳良机. 参展范围:口精细与专用化学品;口染料,颜料;口食~32,1t,;口农用化学品;口流程工业与生物技术;口制药工业装备 与技术;口塑料橡胶工业;口环境保护,水处理设备与技术;口养护和质量保证体系;口化工科技及化工园区;口磷化工;口 化学矿;口化工装备与自动化设备;口化工设备和工厂建设;口煤化工,表面处理与涂料涂装;口基本有机,无机化工原料; 口实验和分析技术,包装和存储技术;口生产控制系统及工控设备;口石油石化装备,产品与技术;口安全,防护,应急救援 设备及用品;口资源发展. 联系方法:《精细化工》编辑部薛桂芬;电话:0411—84699773,84685669;传真:0411—84685669;E—mail:finechem@