花生脂肪酶和脂肪氧化酶活力检测技术优化及其对储藏特性的影响（可编辑）

花生脂肪酶和脂肪氧化酶活力检测技术优化及其对储藏特性的影响（可编辑） 花生脂肪酶和脂肪氧化酶活力检测技术优化及其对储 藏特性的影响 独创性声明 本人声明所呈交的是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果,也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同:的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 帆幻肼月踟 研究生虢盈一 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅,可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体 上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 保密的学位论文在解密后应遵守此协议 研究生签名: 时间: 矽/乃年歹月劢/日 么衫 第一导师签名: 时间: 沙‖年月订日摘要 花牛是重要的食用植物油资源和经济作物,其食用植物油年产量占世界总量的近 %,花牛的总产和单产一直位居全国油料作物之首,占油料作物总产的%左右。 花生种子中脂肪含量平均达到%左右,特别是不饱和脂肪酸含量很高,占油脂的 %以上,适宜制造各种营养食品。花生在储藏过程中极易发生氧化、酸败、走油等 现象,脂肪代谢过程是其品质劣变的重要原因。脂肪酶和脂肪氧化酶是种子脂肪代谢 途径的关键酶,能导致脂肪水解反应产牛游离脂肪酸,以及催化不饱和脂肪酸脂质氧 化,对花生的加工、储藏等过程有重要影响。 本文对已有水稻脂肪酶活力比色测定方法进行修改和优化,建立了花生脂肪酶活 为最适试验 力定量测定方法,通过单因素试验确定取样量、底物浓度 条件,该方法具有精确性好、特异性强、重复性好等特点。 利用该方法检测份花生种质资源的脂肪酶活力分布,结果表明不同材料间差 异极显著.。试验筛选出酶活力高低差异显著的材料份高低各份,并 以其中份高脂肪酶活力和份低脂肪酶活力材料于.。、湿度.%的恒温恒湿 箱进行人工加速老化试验,结果表明,随老化时间延长,高脂肪酶活力材料发 芽率下 降较快,而低脂肪酶活力材料发芽率下降较慢,花生脂肪酶活力与其种子活 力呈负相 关,相关系数为一.。 为测定花生中脂肪氧化酶活力,本研究在已有作物一胡萝卜素耦合 比色法基础上进行优化,建立了花生活力定量测定方法,确定最适取样量, 最适测定时间为反应开始后?。利用该方法研究份花牛种质资源的 活力分布,表明材料间酶活差异极显著氏.。对其中活力高低差异明显的 份材料进行扩繁,并在自然条件下进行个月仓储试验,结果表明,花生 活力与其种子活力呈极显著正相关相关系数为.,.,高活力花生 种子储藏寿命也较长。 该研究为进一步探讨脂肪酶和脂肪氧化酶与花生种子储藏特性的相关性提 供了 依据。 关键词:花生;脂肪酶活力;脂肪氧化酶活力;定量测定;储藏特性,%’, % . , %,% , , ., ., ,, . , ., ., .. , .? .% . ?, , 一.. . . .; , ., , . ,. ,. , . 氏. .伍 .,.。 ’.: 目 录 摘要??.??.??.??.??.??.??.??. 目录. 文献综述? .花生简述.影响花生储藏的因素 ..脂肪组成对花牛储藏的影响..水分含量对花生储藏的影响..温度和湿度 对花生储藏的影响? ..人工添加抗氧化剂对:芘生储藏的影响? .脂肪酶的研究进展? ..脂肪酶简述 ..脂肪酶的结构与催化机理 ..脂肪酶对种子储藏的影响 ..脂肪酶活力的检测方法? ..本文选用的脂肪酶活力快速检测技术? .脂肪氧化酶的研究进展..脂肪氧化酶简述? ..脂肪氧化酶的功能 ..脂肪氧化酶对种子储藏的影响? ..脂肪氧化酶的检测方法? ..本文选用的脂肪氧化酶活力快速检测技术引言.课研究意义 .研究内容?.. 材料与方法??.. .材料、仪器和试剂一 ..材料 ..主要仪器及设备. ..主要试剂. .花生脂肪酶活力检测方法.. ..花生脂肪酶活力检测原理??. ..底物微乳液的制备??. ..粗酶浸提液的制备??. ..脂肪酸显色剂的配制?. ..脂肪酶活力的测定??. ..脂肪酸吸光度曲线的绘制. ..脂肪酶活力的定义与计算??. .脂肪酶活力检测方法的优化??.. ..取样量与提取液蛋白质浓度的相关性. ..取样量对脂肪酶活力检测的影响??. ..酶液浓度对脂肪酶活力检测的影响?. ..底物浓度对脂肪酶活力检测的影响?. ..脂肪酶活力检测方法的稳定性. .花生活力检测方法.. ..花生活力检测原理??. ..提取液及反应液的制备? ..活力的检测 ..活力的定义与计算 .活力检测方法的优化 ..取样量与提取液蛋白质浓度的相关性. ..确定活力测定时间??. ..确定活力检测的最适取样量?. ..测定活力检测方法的稳定性?. .脂肪酶活力差异材料筛选.. .人工加速老化试验.. .花生种子酸价的测定??.. .花生种子过氧化值的测定.. .活力差异材料筛选.. . 花生种子常温储藏方法? .花生种子发芽试验 结果与??.. .脂肪酶活力检测方法的优化??.. ..取样量与提取液蛋白质浓度的相关性. ..取样量对脂肪酶活力的影响?. ..酶液浓度对脂肪酶活:力的影响. ..底物浓度对脂肪酶活力的影响. ..脂肪酶活力检测方法的稳定性. .活力检测方法的优化 ..取样量与提取液蛋白质浓度的相关性. .. 活力的测定时间.. ..活力检测的最适取样量? ..方法的稳定性试验??. .花生种子脂肪酶活力差异材料的筛选?一 .人工加速老化后发芽试验一 .人工加速老化后酸价与过氧化值的变化.. .花牛种子活力差异材料的筛选?.. . 活力与发芽率相关性 寸仑?. 结论??一 .花生脂肪酶活力检测方法的建立一 .花牛活力检测方法的建立一 .花牛脂肪酶活力与储藏特性的关系??一 .花生活力与储藏特性的关系??.. 参考文献?. 附录. 附录:个花生资源材料脂肪酶活力? 附录:个花生资源材料脂肪酶活力? 致谢??. 作者简介?. 硕士期间发表的论文??. 文献综述 .花生简述 花生为豆科作物,其在落花以后形成的果针扎入泥土中孕育荚果,故也称落花生 ?。花生发源于南美洲热带、亚热带地区,约十六世纪传于我国,十九世纪末有所发 展,现在和大豆一样有“植物肉”的美誉,是重要的食用植物油和植物蛋白资源。 在世界范围内,花生占食用植物油年产量的%,居世界第四位,植物蛋白资源居第 三位,占世界植物蛋白年产量的%。我国是世界大花生主产国之一,花生种植 面积仅次于油菜和大豆,年种植面积通常在万以上,总产万吨左右, 约占世界总产的%以上,占我国油料作物总产的%左右,其单产、总产和出口 量均居首位。国内以山东省种植面积最大,产量最多】,花生也是安徽省丰要油料作 物之一,全省各地均有种植,主要集中在淮北和江淮丘陵地区,分别占总面积的% 和%左右。 花生仁中的油脂含量仪次二于芝麻,高于大豆,其含量达.?.%【。花生油 中脂肪酸高达种,其中油酸和亚油酸占了约%左右。如下表所示。 表.花生仁中脂肪酸组成 名称 含量%不饱和脂肪酸 ?油酸 懈?亚油酸 饱和脂肪酸 加 ... 棕榈酸 硬脂酸 .?. .一. 花生酸 .?. 花生油酸... 木焦油酸 油酸为单不饱和脂肪酸,影响人体内的众多生理功能,因其在人体内无法合成, 故称为必需脂肪酸,具有降低高血脂症患者血脂水平以及预防心血管疾病的作用。 年专家研究报道,其可降低血清总胆固醇、血压、低密度脂蛋白胆固醇,并保 持高密度脂蛋白胆固醇不降低‘引。花生油在草本植物油中,油酸含量最高,达%一%,是大豆油、葵花籽油和玉米油等其它植物油的至倍。亚油酸为多不饱 和脂肪酸,从营养角度而言,亚油酸具有降低人体血浆胆固醇含量、防止粥状动脉硬 化等生理功能。如果膳食中缺乏亚油酸,胆固醇就会与一些饱和脂肪酸结合, 发生代 谢障碍,从而在血管壁上沉积,逐步形成动脉粥样硬化,引发心脑血管疾病。 .影响花生储藏的因素 花生因其含油量高,在高温、高湿、机械损伤、氧气、日光及生物的综合作用下, 易发生氧化变质,在储藏过程中花生种子腐烂、发霉,花生仁变苦,变辣,的现象时 常发生,不仪降低种子的发芽率,往往也影响其食用品质和商品价值 ,食用变质的 花生也对人体造成伤害,诱发各种病变。 目前延长花牛储藏时间的方法多是控制外界环境条件如含水量、仓库温湿度、气 体成份、微生物和病虫害等等。另外,应用复合抗氧化剂可以阻止或推迟花生加工过 程中的氧化变质,提高花生加工产品的品质稳定性。 ..脂肪组成对花生储藏的影响 花生的不饱和脂肪酸占其油脂的%以上,由不饱和脂肪酸所构成的甘油脂,在 种子呼吸作用下,使脂肪在完全氧化时,可释放出.千卡热量和.克左右的水, 大大高于克糖类物质完全氧化时所释放的热量和水,从而使花生种子比较容易发 热、霉变、出油和酸败,致使花生种子含油量减少,油的品味变苦,在一般贮藏条件 下,容易氧化酸败而衍生出醛类、酮类及其他恶臭味的烃类等?卜】,种子的发芽率大 。 大降低 同时,与理想的脂肪酸组成相比,花生油亚油酸含量偏高,尽管多不饱和脂肪酸 对人体健康有利,但含过多不饱和键的脂肪酸十分容易氧化,不饱和度越高越不耐储 藏。一些研究者将油料作物的亚油酸含量或油酸/亚油酸的比值看作是决定其 贮藏品质的重要因素,值越高,花生、花生油及其他花生制品的耐贮性越好、货 架寿命越长【 。有研究表明,油酸含量随着贮存时间的延长变幅不大,亚油酸随着贮 存时间的延长其含量逐渐增大,导致值逐渐减小。说明花牛贮存时间越长,其亚 油酸含量越高,花生越容易酸败变质】。 ..水分含量对花生储藏的影响 一般作物种子,在。下,含水量不超过其非油部分的%一%时,种子的呼 吸作用即可趋于稳定。新收获的花牛含水量较高,一般达%一%,未成熟的荚果 %左右,成熟荚果含水量%左右【 ,如不及时干燥,极易发生霉烂、变质或遭受 冻害。花生种子内含水量的增高,导致细胞内出现游离水,种子内所含酶的活性增强, 从而呼吸作用增强,同时也提供了真菌繁殖所需要的水分,使花生发牛霉变。实践证 明,安全含水量荚果应在%以下,种子在%以下。有研究发现,含水量.% 的超干花生种子在贮藏过程中,种子内部清除活性氧的酶、、系统仍保持较高的活性,保持了对脂质的过氧化抑制作用,和挥发性醛产生量较低, 说明超干燥在常温条件下能显著地延长种子耐藏期【引。 ..温度和湿度对花生储藏的影响 在自然贮藏条件下,温度越高安全贮藏的时间越短。种子贮藏温度在。时, 每增加种子寿命减少一半。种子含水量%时,在温度低于。的条件下,脂 肪酸变化不大;温度高于。时,温度越高,酶的活性愈强,种子中的游离脂肪酸 含量就愈高,酸价也就随之升高,酸败速度随之加快。当储存环境在温度为. ?时,相对湿度高于%以上种子含水量就会超过安全贮藏水分标准,导致花生霉变 并产生黄曲霉毒素】,该毒素对人体危害极大且具有强致癌性。 ..人工添加抗氧化剂对花生储藏的影响 抗氧化剂是一种重要的食品添加剂,它可用于防止食品在贮藏中因氧化而使营养 损坏、褐变、褪色等,还可以阻止或延缓油脂的自动氧化【?。由于花生油脂中不饱和 脂肪酸含量较高,单独一种抗氧化剂的抗氧化效果并不明显,不同抗氧化剂 复配使用 时,其抗氧化后产牛的游离基会相互作用生成新的酚类化合物,继续发挥抗氧化作用, 可以提高油脂的氧化稳定性,使其抗氧化性能得以增强,效果较好【。有研究表明, 复合抗氧化剂加入增效剂后与脱氧剂一起使用增效明显,比单独使用抗氧剂效果好, 。 可以显著降低储藏后花牛的酸价【 .脂肪酶的研究进展 ..脂肪酶简述 脂肪酶.....全称为甘油三酰酯水解酶,广泛存在于原核生物如细 菌‘和真核牛物如霉菌洲、哺乳动物‘ 、植物等中。植物中含脂肪酶较多的是 油料作物的种子,动物体内含脂肪酶较多的是胰脏和脂肪组织。 脂肪酶是一种界面酶‘,只能在油脂一水界面上发挥作用,其基本功能是催化甘 油酯水解为甘油和脂肪酸,反应不需要辅酶且反应条件温和,副产物少【引。研究表明, 脂肪酶除了能够催化甘油酯类化合物的水解和合成之外,还可以用于催化酯交换反 。 应、生物表面活性剂的合成、多肽合成、聚合物的合成和药物的合成等【 脂肪酶是最早发现的酶之一,早在年就发现兔胰脂肪酶;年发现胃脂 肪酶;年发现植物种子脂肪酶。植物脂肪酶的研究至今已有一百多年的历史, 植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子,如花生、大豆、油菜、芝麻等,广泛存在 于能量贮存组织中【。 ..脂肪酶的结构与催化机理 尽管不同来源的脂肪酶具有不同的氨基酸组成,但由于牛物的同源性和进化过程 的保守性,不同类型的脂肪酶具有非常相似的立体结构。脂肪酶分子由亲水、疏水两 部分组成,活性中心靠近分子疏水端,其氨基酸顺序、残基数目、分子量、三维空间结构等可能有较大的差别,但却具有相似的折叠方式和活性中心。脂肪酶结构有 个特点:脂肪酶催化中心拥有相似或相同的特征区:???? 或?、、、是非特异性的氨基酸残基;绝大多数脂 肪酶的活性中心都由丝氨酸和组氨酸参与组成,正常情况下受个.螺旋盖保护, 与分子表面被一界面所隔开,形成由暴露憎水基包围的由亲水基组成的脂肪酶亲电 区。这种被称为“盖子”的结构有利于催化过程中底物对活性中心亲和力的提高,以 及活性中间体的稳定。一般,当酶处于闭合状态时,活性位点被“盖子”覆盖。当存 在脂质微囊时,酶的构象发生变化,“盖子”打开,含有活性部位的疏水部分就暴露 出来与其结合,催化脂肪水解【 。与其它水解酶不同,脂肪酶只有在油.水界面才能 被活化。关于脂肪酶界面反应的酯交换机理有多种模型,其中以乒乓机制较为合理 图?。 图一油脂酯交换反应过程中脂肪酶在油水界面被活化的示意图 涪 ..脂肪酶对种子储藏的影响 张瑛等认为种子脂肪代谢途径如图”:脂肪酶是脂肪水解代谢中第一个参与 反应的酶,对脂肪的转化速率起着调控的作用,脂肪酶首先攻击脂肪酸链中的酯基, 启动脂肪水解反应【 ,通过脂肪氧化酶能催化细胞膜中不饱和脂肪酸使膜脂过氧化, 导致种子变质。 脂肪酶催化脂肪水解生成大量的游离脂肪酸。一方面,游离脂肪酸增多使油脂酸 败、酸价增高、油脂风味变差,加工过程中的得率减少,损失加大,生产成本增高。 游离脂肪酸发生断裂后,不饱和键形成氧化物,分解为低级脂肪酸和醛类、酮类等物 质。另一方面,游离脂肪酸浓度过高所造成的酸毒害会造成种子发芽率降低 。已有 研究表明,脂肪酶活力与游离脂肪酸含量呈正相关。在对水稻 、小麦胚芽【】、核 桃等作物的研究中均表明高脂肪酶活力可加速脂肪水解,导致种子变质。 甘油酯、糖脂、磷脂 脂肪酶 上 亚油酸和亚麻酸 脂肪氧化酶 亚油酸和亚麻酸的过氧化氢物 裂解酶等 上 醛、酮和其他挥发物 图.脂肪代谢作用途径 . ..脂肪酶活力的检测方法 脂肪酶的天然底物一般是甘油酯类,其水解部位是油脂中脂肪酸和甘油相连接的 酯键。脂肪酶催化在一种非均相体系中进行,由于其底物多不溶于水,反应主 要发生 在底物和水的界面上,不能简单用?学说解释酶与底物间的关系。 由于脂肪酶来源多样,催化反应特殊,其活力测定的方法多种多样,其过程的影响因 素复杂,这也导致了脂肪酶活:匀定义的混乱。脂肪酶的活力检测方法的主要方法有: 浊度测定法:在含有脂肪酶底物的琼脂平板中加入指示剂,点样加入脂肪 酶,由于脂肪酶分解底物使加样点周围颜色褪去或出现透明圈,并根据反应程度判断 脂肪酶活性。此方法主要用于定性筛选产脂肪酶微生物,不能用于定量测定脂肪酶活 力。另外一种浊度测定法根据三油酸甘油酯的乳化基质在脂肪酶的作用下水解出脂 肪酸,从而改变了乳化液的油界面,使其浊度发生变化,变化率与脂肪酶的活力有 关。通过检测体系悬液散射光或浊度下降,测定脂肪酶活力,此方法已成功用于血清 脂肪酶的测定。 平板法‘:将底物的单分子层膜在液相表面展开,并将脂肪酶 加入液相,脂肪酶催化生成的产物造界面张力的变化,利用检测界面张力的仪器感知 表面张力的变化,从而推断脂肪酶的活力大小。此方法虽然灵敏度高,对仪器 技术要 求太高,局限性强,很少推广使用。 红外线光谱学法‘:通过傅立叶转换红外线光谱法,记录反应混合物的红 外光谱特性。脂肪酸酯的红外光谱吸收峰为一,脂肪酸的红外光谱吸收峰为 ~,以此观测整个的脂肪酶催化水解过程,并最终测得酶活力大小。 以天然油脂为底物,测定酶解产物的增加量:这类方法是较广泛被采用的 一类脂肪酶活力测定方法,主要是测量催化反应产生的脂肪酸或甘油,其中经典方法 为滴定法、测值法和测脂肪酸比色法。其它测定方法:免疫学方法【、荧光测定法?、电子传导圈、油滴法 竺 寸 在过去的研究中,对少量样品的脂肪酶的精确定量分析需要分离纯化,且原子显 微镜、荧光测定、免疫学法等技术,步骤复杂,成本昂贵,难以广泛应用。 ..本文选用的脂肪酶活力快速检测技术 张瑛等【发明一种简易、高效的作物种子脂肪酶定性比色法并应用于水稻种子检 测。刘洁等【 在其基础上进一步深入研究,提出了水稻种子脂肪酶活力精确定量分析 技术,可以快速、准确地检测出水稻种子脂肪酶活力。其检测方法的原理是,以橄榄 油作为底物,在给定时间内,脂肪酶酶活高低与其催化水解底物生成的脂肪酸物质的 量成正比,再利用铜离子与脂肪酸形成铜皂,在测其吸光度以鉴定脂肪酶反 应体系生成的脂肪酸量【 。此方法分辨率高、稳定性强,经济适用,并且克服了传统 的碱滴定法灵敏度低的缺点,仪用少量样品即可精确定量分析该样品脂肪酶的活力。 .脂肪氧化酶的研究进展 ..脂肪氧化酶简述 自年首次发现脂肪氧化酶,; ...后,脂氧 酶的研究取得了长足发展‘ 。在动物、植物和微生物中都发现有脂肪氧化酶。 是一个含非血红素铁的蛋白大家族,植物中的存在于细胞的微粒、胞质和 液泡中,除了可溶性的外,在微粒体膜、原生质膜和脂质体也发现了‘。 在真核生物中参与不饱和脂肪酸的代谢,在植物不同发育阶段存在着不同的类 型,广泛参与植物生长发育、成熟、衰老的各个阶段以及植物防御、抗逆等多种作用。 由单一的多肽链组成,分子量为.,是一种含有非血红素铁、不含 硫的过氧化物酶,是球形、无色、可溶性蛋白,其等电点的范围为值.?.。 催化具有顺,顺一,一戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸的双加氧反应,如亚油酸、 亚麻酸、花生四烯酸。氧分子加到戊二烯的任一末端区域专一性,根据氧化的 位置特异性,植物分为类:催化碳链骨架的.和一氧化的分 别称为一和一,至今发现这些都属于亚油酸一亚家族。 ..脂肪氧化酶的功能 脂肪氧化酶可以催化多种氧化还原反应,广泛参与植物生长发育、成熟、衰老的 各个阶段。在植物的发育过程中,细胞内脂肪的成分常常发生改变,氧化不饱和脂肪 酸形成氧合脂类是脂肪变化中主要反应之一。不饱和脂肪酸的氧化可以由化学氧化或 酶催化,都生成过氧化氢不饱和脂肪酸,但反应过程差异很大,其中催化的反 。 应对植物的作用更为复杂 参与的生理过程涉及损伤、病原攻击、种子萌芽、果实熟化、植物衰老、 脱落酸和茉莉酸合成,也在正常的植物生长和生殖生长过程中作为营养储藏蛋 白,参与脂类迁移,以及调节“源”与“库”的分配,响应营养胁迫?。 脂肪氧化酶在不同植物的不同阶段所表现出的作用也不尽相同。在大豆种 子中是储藏蛋白引,但其催化生成的脂肪酸氢过氧化物再经脂肪酸氢过氧化物裂解酶 分解生成短碳链醇类、酮类和醛类等挥发性物质,使大豆制品产牛豆腥味 【圳。 等‘】发现缺失能减少水稻在储藏过程中产生的陈味物质,张瑛等发现 高活力能延缓米糠酸败。在番茄中参与风味物质的合成引,在马铃薯等作物中 。 参与营养生长、植物防御等多种功能【 等经过?一分离成熟的花生后,发现种脂肪氧化酶同 工酶,按洗脱的先后顺序为、、,其中活力最高最适. 。在花生种子储藏过程中,脂肪氧化酶可以催化分解花生种子中的脂肪酸,并在种 唔。研究表明,在种子萌发过程中,有新的脂肪氧化酶 子受真菌伤害的过程中起作用 合成,大量的酶蛋白和相应的累积可以持续几小时甚至几天。子叶中脂肪氧 化酶的作用之一就是破坏细胞内的膜系统,使多种酶与其相应底物结合,启动生长过 程? 。 ..脂肪氧化酶对种子储藏的影响 一直以来,脂肪氧化酶对作物种子的作用都备受关注,国内外对大豆【引、水稻引、 玉米等作物的脂肪氧化酶均展开了广泛而深入的研究。然而在不同的作物中,脂肪 氧化酶与种子劣变的关系不尽相同。在大豆脂肪氧化酶的研究方面,普遍认 为大豆种 子中脂肪氧化酶更多地起到储藏蛋白的作用,与大豆种子劣变无关,更多的研究关注 其催化不饱和脂肪酸氧化,使大豆及其制品具有豆腥味的原因;在水稻脂肪氧化酶 的研究方面,张瑛等发现,的共同缺失有利于延缓水稻种子的衰老, 缺失对仓储害虫如谷蠹等的危害具有明显的寄主抗虫性【;李金库等在玉米种子中发 现,的共同缺失有利于延缓玉米种子的衰老瞵。 ..脂肪氧化酶的检测方法 在脂肪氧化酶的检测方法中紫外分光光度法最为简易,其原理为,使多元 不饱和脂肪酸氧化形成具有共轭双键的过氧化氢物,此化合物在波长处有吸 收峰,峰高度与酶活力有显著的正相关,但此方法无法灵敏度低,只能测总酶活, 不能作为脂肪氧化酶同功酶的:险测手段。 单克隆抗体检测技术是利用检测植物种子的胚与已知抗原的抗体的结合反 应,用抗原抗体的结合体的变化速率代表活性】。聚丙烯酰胺一电泳和簿层 。其他研究脂肪氧化酶的技术 等电聚焦电泳技术也曾被用来分离检测同功酶 包括离子交换和等电聚集层析?‖?,阴离子交换高效液相色谱和快速蛋白液相色谱分析 ,气相色谱技术,印迹法等。这些检测方法大多操作繁琐、步骤复 杂、速度慢且价格昂贵,常常需要较高的实验室条件与特定的专业技术人员方能完成检测,难以作为脂肪氧化酶的常规检测手段。 ..本文选用的脂肪氧化酶活力快速检测技术 吴跃进等自主开发研制了一种简易、高效的植物脂肪氧化酶同功酶快速检测技术 ,张瑛等‘、余海兵等】将其应用于水稻和玉米的检测。其检测原理为, 能偶联氧化一胡萝卜素并产生颜色反应,通过氧化作用漂白一胡萝卜素变成无色, 该反应产物在处有一吸收峰。测定其吸光值变化值可以反映其催化速度,以给 定时间内吸光值下降的量表示活力【。此方法快速简易,稳定性强,经济适用, 并且可以分别测定脂肪氧化酶三种同工酶的活力。引言 .课题研究意义 中国花生资源丰富,是重要的食用植物油资源和经济作物。我国一直很重视花生 的种植和牛产,在田间种植的农作物中,花生仪次于水稻、小麦、玉米、大豆、油菜, 列第六位。由于花生不饱和脂肪酸的含量高,利于人体健康,适宜制造各种营养食品, 故花生的市场需求量也较大,种植花生能给农民带来较高的经济效益,中国几乎每个 省份都有花生种植。 但由于花生自身含油量高,后熟期长,收获后带有较多的霉菌,以及生产中管理 技术不到位,方法不当等因素,花生在储藏过程中常常发霉、变质,严重影响到种子 的出苗率,并使花生丧失食用价值。为了防止花生在储藏过程中品质下降,维护消费 者的健康和农民的经济利益不受到损害,必须保证花生的安全储藏。研究证明,储藏 过程中花生品质下降的主要原因是脂肪的水解氧化,防止脂肪劣变,对花生的保质及 延长花生的储藏期和货架期具有重要的意义,同时也是花生种子的发芽率高、苗壮、 产量高和的重要措施。目前对花生延长储藏期的方法主要集中于对花生储藏条件的控 制,花生种子自身成分的研究也主要集中于/值对花生储藏的影响,而脂肪酶及脂 肪氧化酶活力高低对花生储藏的影响尚鲜有探讨。 根据国内外的研究现状,关于花生自身酶促反应对花生耐储藏特性影响的研究仍 然没有系统性。长期以来,关于油料作物种子脂肪酶的研究主要集中于种子萌发过程 和形成期脂肪酶活性的变化四。张弛等‘和翟征秋等‘分别研究了硒和重金 属铬、 铜对花生种子萌发前后脂肪酶活力变化的影响,申琳等则研究了花生种子萌发过程 中蛋白酶、脂肪酶及、酶活性变化。但对于油料作物干种子特别是储藏过 程中脂肪酶作用的研究尚未见报道。 在花生脂肪氧化酶研究方面,陈静等利用等电聚焦电泳技术,对个品种的 花生进行测定,发现花生脂肪氧化酶呈现三或四条酶带。侯美玲等则利用等电聚 焦电泳技术,对个品种的花生进行鉴定,发现花生脂肪氧化酶同工酶在子叶中呈两 条酶带,在完整种子中呈三条酶带,在种胚中呈六或七条酶带。同时侯美玲等采 用紫外分光光度法对花生种子脂肪氧化酶活力进行了测定,优化了试验条件,但未对 方法进行应用。 本文分别构建了花生脂肪酶和脂肪氧化酶的快速检测技术,对方法进行了 优化和检验,利用优化后的方法对花生种子材料进行了大规模的酶活力检测,并初步 探索脂肪酶和活力差异对花生种子耐储藏性的影响,为进一步探讨脂肪代谢关 键酶影响花生种子储藏特性的作用机制提供了方法和材料的准备。.研究内容 ?花生种仁脂肪酶和活力快速检测技术的建立 水稻种子脂肪酶和活力的快速检测手段现已成熟,已成功应用于水稻耐储 藏种质资源的筛选和新品种的培育,在此基础上,以花生种仁为实验材料,探索、改 进并优化花生脂肪酶和活力快速检测的实验室手段,使之能准确测定出酶活力 大小。 ?大批量筛选花生脂肪酶和活力差异材料 从现有的大约份花生种质资源中,通过脂肪酶和活力的快速检测,得 到各种质脂肪酶和活力,分析不同花生种质的酶活分布,获得酶活力差异显著 的种质。 ?花生储藏过程中种子品质变化分析 选择不同的酶活力差异材料,通过自然老化或人工加速老化处理模拟花生储藏条 件,定期取样检测花生种子的发芽率和酸价、过氧化值等指标,获得花生品质变化趋 势。 材料与方法 .材料、仪器和试剂 ..材料 皖花号:由安徽农业科学院作物研究所提供; 份花生种质资源:由山东省花生研究所提供。 ..主要仪器及设备 型电子天平:上海精密科学仪器有限公司; 型分析研磨机:德国公司; 一型离心机:上海安亭科学仪器厂; 型紫外一可见分光光度计:上海棱光技术有限公司; ?型水浴振荡器:哈尔滨市东联电子技术开发有限公司; 一型脱色摇床:上海琪特分析仪器厂; 一型智能人工气候箱:杭州钱江设备有限公司; 一一型人工气候箱:广东省医疗器械厂; 型冷冻离心机:德国公司; 一型磁力搅拌器::上海雷磁力新泾仪器有限公司; ?型电热鼓风二燥箱:上海实验仪器总厂; 一型旋转蒸发仪:上海越众仪器设备有限公司: ..主要试剂 亚油酸:购自公司,分析纯; .胡萝卜素:购自公司,分析纯; :购自公司,分析纯; 甲醇、乙醚、氢氧化钠、酚酞、盐酸、乙醇、石油醚、冰乙酸、吡啶、醋 酸铜、正辛酸、异辛烷、橄榄油、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、甘油、一均为 国产分析纯。 .花生脂肪酶活力检测方法 根据刘洁等比色法略修改、优化。 ..花生脂肪酶活力检测原理 以橄榄油作为底物,在给定时间内,脂肪酶酶活高低与其催化水解底物生成 的脂 肪酸物质的量成正比,再利用铜离子与脂肪酸形成铜皂,在测其吸光度以鉴 定脂肪酶反应体系生成的脂肪酸量。..底物微乳液的制备 将橄榄油和一按:聊聊混合,经磁力搅拌器搅拌均匀,得底物微乳 液。 ..粗酶浸提液的制备 选取新鲜饱满、表皮光滑、无病斑和损伤的花生果数粒,剥壳去皮去胚,将子 叶 粉碎。称取优化过程见结果..,用研钵研碎,加入?缓冲液研磨 成匀浆后转移至试管中,再用缓冲液冲洗研钵两次,并将缓冲液转移至 试管中。 ..脂肪酸显色剂的配制 称取乙酸铜,溶解于去离子水中,再加吡啶,混匀即得脂肪酸 显色剂。反应生成的游离脂肪酸与醋酸铜溶液形成的铜皂加入吡啶后,随着 溶液 值的增大,铜皂的吸光度大大增加,在.?.范围内,铜皂的吸收最强。因此, 必须控制醋酸铜一吡啶的在.处。 ..脂肪酶活力的测定 将微乳液底物加入试管与粗酶浸提液混合,在.型水浴振荡 器中?,用封口膜封口,转水浴振荡。反应完毕后,把反应液转移到 具盖试管中并加入异辛烷,将试管置一型脱色摇床充分振荡。其后 把试管置试管架上静置,待其分层后,移取上层有机相分装于、两只 离心管中,各。每只离心管中分别加入.脂肪酸显色剂,在一型 脱色摇床上充分振荡混匀,使其显色后,离心。合并、两管 淡蓝色上清液,在处测定吸光度。上清液吸光值的高低对应于脂肪酶活力的 高低。对照管试验方法同上,用.的?缓冲液代替酶液。比色 时,脂肪酶活性管和对照管均用纯水调零。 ..脂肪酸吸光度标准曲线的绘制 配制一系列不同浓度的正辛酸/异辛烷溶液等量分装于只离心管中, 各加.脂肪酸显色剂,于一型脱色摇床充分振荡混匀。离心后取两 管上层有机相合并后在以异辛烷作参比测定吸光度,试验重复次,以平均 吸光度作为结果。用 进行数据处理,绘制脂肪酸标准曲线如图?所 示。 图脂肪酸吸光度标准曲线.该标准曲线相关系数较好,数据偏差很小,回归方 程... 可以代表吸光度和游离脂肪酸浓度之间的关系。 ..脂肪酶活力的定义与计算 假设用上述方法测得某样品管值为,对照管值为查标准曲线可得 该反应体系中游离脂肪酸浓度的变化,以上述反应条件下样品中含的脂肪酶 在 内消化底物所生成.脂肪酸作为一个酶活力单位,则该样品的脂肪酶活力 一././.,单位为。 由于底物橄榄油亦可以在水浴过程中分解生成游离脂肪酸,所以应设对照管排除 橄榄油的本底干扰作用。用脂肪酶活性管与对照管的差值代表产生的脂肪酸引 起的吸光度变化,即脂肪酶的相对活力。将?代入上述回归方程可得该样品管中 游离脂肪酸浓度的变化量,再根据本文中对脂肪酶酶活的定义可以得到样品脂肪酶的 总活力。 .脂肪酶活力检测方法的优化 ..取样量与提取液蛋白质浓度的相关性 取皖花号花生粉.、、、、、和,加?缓冲液研 磨成匀浆,离心后取.上清液,加.缓冲液.稀释,在波长 和处分别测吸光度。 .一. 蛋白质浓度 式中和分别是蛋白质溶液在和波长下测得的吸光度, 处理数据。 是溶液的稀释倍数。试验重复次,取平均值。用 ..取样量对脂肪酶活力检测的影响 分别取皖花号花生粉、、、、、和,底物浓度为, 其他试验步骤同上。另设一组对照管,每个浓度梯度各设个平行酶活性管,取测定 平均值,以酶活性管与对照管的值代入计算该样品脂肪酶的活力。 ..酶液浓度对脂肪酶活力检测的影响 称取皖花号花生粉加?缓冲液研磨成匀浆后离心得到粗 酶液,再分别用缓冲液稀释、、、和倍,即设置粗酶液浓度分别为.、、.、、和浓度梯度,底物浓度为,其他试验步骤同上。另 设置一组对照管,每个浓度梯度各设个平行酶活性管,取测定平均值,以酶活性管 与对照管的值代入公式计算该样品脂肪酶的活力。 ..底物浓度对脂肪酶活力检测的影响 的微乳 分别配置底物橄榄油的微乳液浓度为、、、、和 液,称取皖花号花生粉,其他试验步骤同上。每个浓度梯度各设个平行酶活 性管,取测定平均值,另设一个对照管,以酶活性管与对照管的值代入公式计算 该样品脂肪酶的活力。 ..脂肪酶活力检测方法的稳定性 分别取皖花号花生粉,其他试验步骤同上,对脂肪酶活力进行次测定, 结果使用软件进行相对标准偏差统计计算。 .花生活力检测方法 ..花生活力检测原理 能偶联氧化一胡萝卜素并产生颜色反应,该反应产物在处有一吸 收峰。测定其吸光值变化值可以反映其催化速度,以给定时间内吸光值下降 的量表示 活力。 ..提取液及反应液的制备 取甘油和. 一加.的磷酸缓冲液定容至,经磁力 搅拌器搅拌均匀,得提取液。将.的磷酸缓冲液、纯水、亚油酸钠和饱和 的胡罗卜素一丙酮溶液按:::肜聊混合,得反应液。 ..活力的检测 选取新鲜饱满、表皮光滑、无病斑和损伤的花生果数粒,剥壳去皮去胚,将子 叶 粉碎。称取,用研钵研碎,加入 提取液研磨成匀浆后转移至离 心管中,再用 酶提取液分次冲洗研钵,并将其转移至离心管中,将离 心管置摇床充分振荡后于试管架上静置,待充分提取后, 离 心,取.上清液为粗酶浸提液。 将粗酶浸提液加入 反应液混合均匀,在处测定吸光值。反应开 始时开始计时,以吸光值变化量表示活力。比色时,用纯水作为参比调零。 .. 活力的定义与计算 假设用上述方法测得某样品反应开始后值为,反应开始后值 为,以每分钟增加.吸光值所需要的活力作为花生的一个活力单位,则 该样品的活力?/.,单位为。根据取样量与提取液蛋白质浓度的 关系曲线详见..可计算出每份样品中蛋白的毫克数,则该样品的 比活力/.. 】,单位为/,式中为取样量。 .活力检测方法的优化 ..取样量与提取液蛋白质浓度的相关性 取皖花号花生粉.、、、、、、和,加提取液 研磨成匀浆,离心后取.上清液,加提取液.稀释,在波长 和处分别测吸光值。蛋白质浓度.一.式中 和分别是蛋白质溶液在和波长下测得的吸光值,为溶液的稀释 倍数。试验重复次,取平均值。 ..确定活力测定时间 取皖花号花生平行试验:次,自吸光值开始下降时开始计时,每记录一次 吸光值,后停止记录,结果取平均值,其他试验步骤同上。 ..确定活力检测的最适取样量 分别取皖花号花生粉、、、、、和,其他试验步骤同上。每个 质量梯度设个平行酶活性管,酶活力值取测定平均值,将测得酶活力除以酶 蛋白质 量得到的比活力。 ..测定活力检测方法的稳定性 分别取皖花号花生粉,其他试验步骤同上,对活力进行次测定, 结果使用软件进行相对标准偏差统计计算。 .脂肪酶活力差异材料筛选 以个花生种质资源为材料,按田间编号分为组,每组加入皖花号作为 对照,利用优化后的方法进行脂肪酶活力检测,每个样品测定设置个重复,取 平均 值,另设置一对照管,以酶活性管与对照管的值代入公式计算该样品脂肪酶 的活 力。 .人工加速老化试验 选取扩繁后的份高脂肪酶活力和份低脂肪酶活力材料各,装入尼龙纱 网袋中,设个重复,于.。、湿度.%的恒温恒湿箱进行人工加速老化。在、 、、和,每次,定期取样进行发芽试验。 .花生种子酸价的测定 按照/.?中规定的酸价测定方法。 .花生种子过氧化值的测定 按照/.?中规定的过氧化值测定方法。 .活力差异材料筛选 以份花生种质资源为试验对象,利用优化后的方法进行活力检测,每个样品 测定设置个重复,结果取平均值。 .花生种子常温储藏方法 按照.所检测的活力分布随机抽取份花生种子,于年冬季在海 南进行扩大种植,月份收获后选取新鲜饱满、无病斑损伤、活力正常的种子,在日 光下翻晒使种质平均含水量达到%以下,装入尼龙纱网袋,放置于背光、干燥、通 风处进行常温常湿实仓储,自年月至 年月,共个月,并定期检查 翻仓,使不同样品储藏环境一致。 .花生种子发芽试验 采用/.?中规定的纸问法【,选用滤纸作为芽床,在培养皿 中铺层滤纸后将种子置其上,再在种子上覆盖层滤纸。将芽床用纯水充分润湿, 放于恒温培养箱中,恒定温度。,保持芽床湿润,干时加水。每处理粒种子, 次重复。每天观察记载发芽种子数,当胚根长?种长时视为发芽种子,结果取次 重复的平均值。试验期间如有发霉种子将其取出,发霉严重时更换芽床,置床后 统计发芽率。 发芽率正常发芽种子数/种子总数×%。 结果与分析 .脂肪酶活力检测方法的优化 ..取样量与提取液蛋白质浓度的相关性 由图?可见,在取样量增加到时,提取液的蛋白浓度与取样量仍为正比 关系恹.,说明试验中使用的取样量未超出缓冲液的提取能力范围。 一?一日。一葛扫。。量。芑芑?扫戈? 曲 图.取样量对提取液的蛋白浓度的影响 嘻..取样量对脂肪酶活力的影响 由图.可知,花生取样量少于时,酶活力与花生取样量呈正比。当取样量 达到后酶活力逐渐趋于平稳,上升幅度变缓。表明花生中的酶量在内 可以将绝大部分底物彻底分解。因此,最适取样量为。 、, 蚤 ’; 。 譬 ? 器 .争 一图取样量对脂肪酶活力的影响. ..酶液浓度对脂肪酶活力的影响 由图.可知,酶浓度低于.时,酶活力与酶浓度呈正比。当酶浓度达 到. 后酶活力逐渐趋于平稳,上升幅度变缓。表明当酶浓度达到. 以后,在内可以将绝大部分底物彻底分解。因此,酶液浓度应小于. 使酶活力与酶浓度始终保持正比关系,. 的酶液所用样品粉约. 左右,与上述结果基本一致。 兮 、一 蚤 :三 芑 内 譬 盛 图.酶液浓度对脂肪酶活力的影响 ...底物浓度对脂肪酶活力的影响 从图?可以看出,底物浓度增加,脂肪酶活力也增加,在底物浓度低范围内, 时,酶活基本稳定不 脂肪酶活力与底物浓度呈正比,当橄榄油浓度增加到 。 再增加,最适底物浓度为 譬 苦 苗 啊 譬 墨 一图.底物浓度对脂肪酶活力的影响...脂肪酶活力检测方法的稳定性 应用优化得到的最适条件对皖花号脂肪酶活力检测平行试验次,测得酶活力 分别为.、.、.、.、.、.和.。对结果进 行统计计算后得到相对标准偏差为.%,小于%,证明该方法稳定性好、重 复性好,可以作为花生脂肪酶活力检测的基本方法。.活力检测方法的优化 ..取样量与提取液蛋白质浓度的相关性 由图?可见,在取样量增加到时,提取液的蛋白浓度与取样量仍为正比 关系.,说明试验中使用的取样量未超出缓冲液的提取能力范围。 一?暑 ~??王 。;芑。。。图?取样量对提取液的蛋白浓度的影响 ... 活力的测定时间 由图可知,吸光值自反应开始前略有波动,待酶液与底物反应液充分接 触后后开始匀速下降,后下降趋于平缓直至停止。反应开始后?内, 吸光值下降速度曲线斜率基本相同,在此时间内吸光值下降幅度均可以准确 代表 酶活力大小。因此,确定为活力的测定时间。 三 寸 寸 ’寸 图吸光值僵随时刨的耍七 . ..活力检测的最适取洋量 由图?可知,花生取样于时,比活力基本稳定不变。当取样量 达到后比活力随花生取样量增加逐渐呈下降趋势,可能是由于取样量大于 时,粗酶提取液中蛋白浓度较高,导致反应体系中酶提取液中的蛋白量过高, 与底物配比不合适,导致测定结果不准确。当取样量小于等于时,反应体系能 准确地测定出花生中活力的大小,因此,最适取样量为。 曲 图.取样量对比活力的影响 .? ..方法的稳定性试验 应用优化得到的最适条件对皖花号活力检测平行试验次,测得酶活力 分别为.、.、.、、、.和。对结果进行统计计算后得 到相对标准偏差为.%,小于%,证明该方法稳定性好、重复性好,可以作 为花生活力检测的基本方法。 .花生种子脂肪酶活力差异材料的筛选 利用优化后的脂肪酶检测方法测得个花生资源材料脂肪酶活力见附录。根 据脂肪酶活力做直方图图.,可以发现脂肪酶活力呈曲线分布,变幅为?, 最大峰值落在附近,主要分布区域在.。 巧 如 笛 加 埒 ?口?‘ ‘ 图不同花生种子材料脂肪酶活力分布 .?由表?可得,样品平行组内重复的无差别的概率..,说明平行组 间差异不显著,结果较为稳定,重复性较好:样品间的无差别的概率.., 说明不同材料问差异极其显著,其脂肪酶活力有很大差异。综合考虑试验组别、平行 司稳定性等因素后,筛选得到特异性脂肪酶活力材料见表?。 表.不同花生种子脂肪酶活力差异的显著性分析表?中左侧个材料花生种子酶活较高,右侧个材料花生种子酶活较低, 组平均酶活力相差超过倍,为比较不同脂肪酶活力材料在储藏中的变化差异打下良 好的基础。 表花生特异性脂肪酶活力差异材料的酶活力.人工加速老化后发芽试验 选取脂肪酶活力高的花牛种子号和号,脂肪酶活力低的花牛种子号 和号扩大种植,收获后经人工加速老化,按国标纸间法进行发芽试验,发芽率结 果如图。 从图可以发现,脂肪酶活力高的花生种子号和号在人工加速老化过 程中的发芽率下降趋势更大,明显高于脂肪酶活力低的花生种子号和号的下 降趋势。在人工加速老化后,高脂肪酶活力材料发芽率下降至%左右,而低脂 肪酶活力的材料号发芽率仍保持在%,号材料仍保持了.%的高发芽 率。在人工老化后,高脂肪酶活力材料发芽率下降至%左右,而低脂肪酶活力 的材料发芽率仍保持在%左右,为高脂肪酶活力材料发芽率的倍。软件相 关性分析表明,花生脂肪酶活力与人工加速老化种子发芽率的平均值呈负相 关相 关系数为一.。加 ? 踟 ? ? 装一舞口。口昌署。 加 图 .?、相对湿度.%的高温、高湿人工加透老化试验 .? .%..人工加速老 化后酸价与过氧化值的变化 测人工加速老化过程中花生的酸价和过氧化值,酸价结果如图.,过氧化值结 果如图.。 从图?可知,种花生初始酸价相近,在人工加速老化前酸价缓慢上升。 在老化后,脂肪酶活力高的花生种子号和号酸价迅速上升,且幅度很大; 脂肪酶活力低的花生种子号和号仍保持缓慢上升,直到老化结束时酸价上升 幅度较小。 加 ? ? ? ? 加 ? 图?人工加透老化对砭生酸价的影响 .从图? 可知,种花生初始过氧化值相近,在人工加速老化过程中种花生的 过氧化值基本保持匀速上升,其中脂肪酶活力高的花生种子号过氧化值上升 速度 较快。在老化结束时,脂肪酶活力低的花生种子号和号的过氧化值均低于脂 肪酶活力高的花生种子号和号的过氧化值。 . 一。?。。曲一?一;??【。。山 图 人工加速老化对花生过氧化值的影响 . .花生种子活力差异材料的筛选 利用上述优化的检测方法获得个花生资源材料活力见附录。根据 活力做直方图图?,其酶活力呈曲线分布,变幅为?,最大峰值落在 附近,主要分布区域在.?.。 蚕 吾 曼 山. 图不同花生种子材料活力分布 .. 由表?可得,样品平行组内重复的无差别的概率..,说明平行问 差异不显著,结果较为稳定,重复性较好:样品间的无差别的概率.., 说明不同材料间差异极其显著,其活力有很大差异。 表.不同资源材料花生活力差异的显著性分析 ?. 活力与发芽率相关性 将储藏个月后的份花生种质资源取出,按国标纸间法进行发芽试验,将发 芽率和储藏前的活力进行相关分析,结果如表?。可以发现,活力低 于.时,发芽率均在%以下;活力高于时,发芽率基本达到% 以上号材料除外,其中号材料特别突出,仍保持了%的高发芽率。 软件相关性分析表明,花生脂肪氧化酶活力与常规储藏个月后的种子平均 发芽率呈极显著正相关俨.,相关系数为.。 表?花生种子活力与发芽率的相关性 编号活力 发芽率%. %%% . %% . % . %%% . % . % . % . %% . %% . %% . % . % . % 一????????????????????????????????????????????????????????一 . % %%一????????????????????????????????????????????????????????一讨 论 脂肪酶和脂肪氧化酶活力高低是影响脂肪代谢的关键因素之一,不仅影响储 藏中 花生的品质,而且影响种子活力,准确测定酶活力成为对其研究的关键。 目前对脂肪酶的研究大都使用传统的碱滴定法,但滴定法使用样品量大、灵 敏度 低的缺点直接影响到检测的效率和准确性。本研究选用以比色法为基本原理的脂肪酶 活力快速检测技术,并对试验条件进行了优化,使其能快速、准确地测得脂肪酶活力, 适用于大规模材料的筛选。 在脂肪氧化酶活力检测方面,已有的花生脂肪氧化酶检测方法大都操作复杂、速 度慢、成本高。其中较常用的等电聚焦电泳技术容易导致酶失活,亚基解体,从而很 难准确区分脂肪氧化酶同工酶的种类,无法测得酶活力大小;紫外法灵敏度低,只能 测总酶活,无法测得脂肪氧化酶各同工酶的活力,难以作为脂肪氧化酶同工酶的常规 检测手段。本研究首次将比色法应用于花生种子的活力检测,其具有分辨率高、 稳定性强,经济适用,方便推广的优点。 研究表明,在人工加速老化条件下,脂肪酶活力高的花生种子的发芽率下降趋势 明显高于脂肪酶活力低的花生种子,其酸价与过氧化值上升速度也明显高于脂肪酶活 力低的花生种子;种子经过个月常规储存后的发芽率与活力呈极显著正相 关。本文通过对不同酶活力材料耐储藏性的检测,发现酶活力的高低对花生 储藏性有 显著影响