牛血清白蛋白与三唑酮结合作用的热力学研究

牛血清白蛋白与三唑酮结合作用的热力学研究 牛血清白蛋白与三唑酮结合作用的热力学 研究 化学与生物互程200B,Vo1.25N0.12 Chemistry&Bioengineering 牛血清白蛋白与三唑酮结合作用的热力学研究 童金强.熊泽云.张华新,梅平 (1.长江大学化学与环境工程学院,湖北荆州434023;2.荆楚理工学院化学与药学 院,湖北荆门4480O0) 摘要:在模拟人体生理条件下,采用分子光谱法研究了三唑酮与牛血清白蛋白的 相互作用.结果发现,三唑酮对 牛血清白蛋白的内源荧光有一定的猝灭作用,由Stern—Volmer方程和VantHoff 等压方程分析处理实验数据,得到了 结合作用的平衡常数,结合反应的热力学参数,结合作用力类型等. 关键词:三唑酮;牛血清白蛋白;荧光光谱法;热力学参数 中图分类号:0657.3Q512.1文献标识码:A 蛋白质是生命的基础,生命体内的酸碱平衡,电解 质平衡,遗传信息的传递,物质的代谢和运送等都与之 密切相关.研究有机小分子与蛋白质相互作用而产生 的生理,病理,毒理现象和过程,对于了解人体内的储 存,运输,吸收,分布及代谢过程,指导疾病的科学分 类,疾病的正确诊断及临床上的合理用药等有重要意 义[1].三唑酮(Tradimefon,TDF)属于三唑类,是一 种高效,长效,广谱,低毒的新型内吸性杀菌剂,具有双 向传导功能,以及预防,铲除,治疗和熏蒸作用,且在酸 性和碱性条件下(pH一1,13)均稳定,持效期较长. 作者在模拟人体生理条件下,用荧光光谱和紫外 可见吸收光谱研究了TDF与牛血清白蛋白(BSA)结 合作用的光谱特征,着重探讨了TDF对BSA的荧光 猝灭作用,得到了结合常数,结合作用力类型和热力学 参数等,对了解TDF与蛋白质的结合方式,明确TDF 在动物体内的代谢过程,研究TDF的中毒机制及指导 中毒急救,解毒等方面具有积极意义. 1实验 1.1仪器与试剂 AY一120型电子分析天平,日本岛津公司;LS-55 型荧光分光光度计,美国PE公司;UV一1100型紫外可 见分光光度计,北京瑞利分析仪器公司;SYC-15型超 级恒温水浴(?0.1?),南京桑力公司. 1.0×10tool?LBSA溶液,上海生物化学试 剂厂;0.5mol?LNaC1溶液;pH值7.4Tris—HC1 缓冲溶液;TDF,湖北沙隆达化工有限公司.所用试 , 文章编号:1672—5425(2008)12--0039--03 囡 剂均为分析纯,实验用水为二次蒸馏水,经检测均无荧 光杂质. 1.2方法 在10mL比色管中依次加入0.5mol?LNaC1 溶液2.0,mL,1.0×10mol?IBSA溶液2.0mL, Tris—HC1溶液2.0mL,定容,取一定量混合液并用 TDF溶液滴定,当激发和发射单色器狭缝宽度分别为 15nm,2.5nm,激发波长为282nm时,在一定波长范 围内扫描BSA的荧光发射光谱,BSA在TDF作用下 的荧光发射光谱,同步荧光发射光谱以及紫外可见吸 收光谱. 2结果与讨论 2.1BSA的荧光发射光谱 荧光猝灭指的是荧光物质与溶剂分子或溶质分子 之间所发生的导致荧光强度下降的物理或化学作用, 猝灭过程实际上是与发光过程相互竞争从而缩短发光 分子激发态寿命的过程. 本实验中,BSA是荧光物质,TDF是荧光猝灭 剂.按实验方法扫描了BSA的荧光发射光谱和TDF 作用下BSA的荧光发射光谱(图1)和紫外吸收光谱 (图2). 2.2荧光猝灭作用的描述 荧光猝灭作用因猝灭机制不同可分为动态猝灭和 静态猝灭.在动态猝灭过程中,荧光分子与猝灭剂分 子间的相互作用可用Stern—Volmer方程描述.设C. 为游离荧光体浓度,C.为荧光体总浓度,F为有猝灭剂 收稿日期:20O8一O8—05 作者简介:童金强(1963--),男,湖北荆州人,副教授,主要从事无机化学教学和生物 无机化学方面的科研工作.E-mail:Ton~q63 @126.com. 囫金强等:牛血清白蛋白与三唑酮结合作用的热力学研究/2008年囊12期 fBsA=2×10tool?I,,1,8中CTDF(×10—6tool?I一)依次为 0,1,2,3,4,5,6,7 图1BSA的荧光发射光谱 Fig.1FluorescenceemissionspectraofBSA 1.TDF2.BSA3.TDF—BSA:fTDF—CBSA=2×10tool?I 图2BSA.TDF及TDF-BSA的紫外吸收光谱 Fig.2IRabsorptionspectraofBSA,TDFandTDF-BSA 时的荧光强度,Fn为无猝灭剂时的荧光强度,c.为猝灭 剂浓度,当生成物不发射荧光时,游离荧光体的摩尔分 数等于相应荧光强度的比值(c./c.一F/F.),则有: Fo/f=1+Ksvfq一1+KqroCq(1) 式中:K,,为动态猝灭常数,单位是L?mol一,它 描述了生物大分子与荧光猝灭剂分子在基态或者激发 态彼此扩散和相互碰撞达到动态平衡时的量效关系; K.为动态荧光猝灭速率常数,单位是L?mol?S, 它反映了分子的彼此扩散和相互碰撞对生物大分子荧 光寿命衰减速率的影响;为无猝灭剂时荧光分子的 平均寿命,约为1×10Sl3]. 在不同温度考察了滴加TDF后BSA荧光强度的 变化,由Stern—Volmer方程对实验数据线性拟合,发 现相关性较差(图略).同时紫外吸收光谱(图2)显 示:TDF—BSA体系的紫外吸收光谱与TDF和BSA 的明显不同,也是两者生成新复合物的重要证据__4]. 因此可以认为TDF与BSA之间借助分子问力,彼此 ? 结合形成了具有特殊结构的超分子化合物,导致了荧 光体荧光强度的减弱,主要是生成了复合物的静态猝 Volmer方程修正为: 灭,于是可将Stern— (F0一F)一一Fo一+KF.,C.一(2) 式中K示静态猝灭常数.据此处理实验数据, 得到了各温度下的曲线方程及相关系数,见图3. 1.291K’—Fo--F=....1738+3.704X1.c—1.R一..9994 2.298K’—F o LF..001866+3.913X107C--1~R一..9999 3.3O4K,1 =..()(]2.2H4.149×1.一7c,R=0.9999 4.311K,一....217.+4.354X1._7c,R一..9997 图3修正的Stern-Voimer方程 Fie.3ThemodifiedStern-Volmereouation 2.3热力学参数的求取 当温度变化不太大时,可以将焓变?H.视为常 数.在等压条件下,反应的焓变?H.和熵变AS.可以 由VantHoff方程求算: lnKJ.:+(3) 以lnKB对1/丁作图,如图4所示.得到Vant Hoff方程为lnKLB一一276.3IT+9.400,R一0.9949. 图4VantHoff方程 Fig.4VantHoffplot 由VantHoff方程求出?H.和AS.后即可由吉 布斯一亥姆霍兹方程求得吉布斯自由能AG.. ?G.一AH.一T?AS(4) 各温度下热力学参数见表1. 2.4讨论 小分子和蛋白质等生物大分子之间的结合力主要 有疏水作用力,氢键,范德华力和静电引力等.Ross 等根据大量的实验结果,总结出了判断生物大分子 与小分子结合力性质和生物大分子自身结合力性质的 童金强等:牛血清白蛋白与三唑酮结合作用的热力学~/2008年?12啊 表1不同温度下的热力学参数 Tab.1Thermodynamicparametersatdifferenttemperature 热力学规律,即疏水作用力有可能使体系的?H和 AS.增大,氢键或者范德华力有可能使体系的?H.和 AS.减小,静电作用力使?H.?0,AS.>0.由此可以 认为,TDF与BSA之间的作用力可能主要是疏水作 用力.另外,从热力学观点看,在一定的温度和压力 下,表1中AG.<O,说明TDF与蛋白质的结合是能够 自发进行的. 氨基酸残基的发射波长与环境极性有关l7].色氨 酸残基的特征同步荧光光谱见图5. Wavelength/nm CBSA一2×10tool?L,1,8中CTDF(×10mol?I)依次为 0,1,2,3,4,5,6,7 图5同步荧光光谱(AA=60nm) Fig.5Synchronousfluorescencespectra(=60nm) 田 由图5可见,随着TDF浓度的增加,色氨酸残基 的发射波长略有红移,证明BSA腔内疏水环境的极性 增大,肽链更加舒展,这也从侧面反映了TDF的生物 毒性. 3结论 BSA与TDF发生结合作用生成了新的复合物, 属于静态荧光猝灭,发生了分子内的非辐射能量转移; 在动物体温范围内反应的结合常数较大:与温度的关 系较好地符合Van’tHoff方程;结合作用的?H.>O, AS.>O,AG.<O;二者主要靠疏水作用力结合;同步荧 光光谱表明TDF对BSA的结构有一定的影响. 参考文献: [1]张华新,颜承农,黄星,等.小分子配体与蛋白质作用的荧光法研 究进展rJ_.化学与生物工程,2005,22(9):4-6. [2] [3] [4] [52 [6] JenniferLPerry.Transportandtoxicityofochratoxina[D1 DukeUniversity,2003. 童金强,颜承农,周志鹏,等.二氯喹啉酸与牛血清白蛋白结合作 用的荧光光谱研究[J].西南师范大学学报(自然科学版),2005, 30(4):695-698. SulkowskaAnna.Interactionofdrugswithbovineserumandhu— manserumalbumin[J].JournalofMolecularStructure.2002. 614(卜3):227-232. KlajnertB.BryszewskaM.FluorescencestudiesonPAMAMden— drimersinteractionswithbovineserumalbumin[J].Bioelectro— chemistry,2002,55(卜2):3335. RossPD,SubramanianS.Thermodynamicsofproteinassociation reactions:Forcescontributingtostability[J].Biochemiszry,1981, 20(】】).3096—3]02 [7]ZhangHua—Xin,HuangXing,MeiPing,eta1.Studiesonthein teractionoftricyclazolewithfl-.cyclodextrinandhumanserumal buminbyspectrosc0py[J].JFluoresc,2006,16(3):287—294. ThermodynamicStudiesontheBindingInteractionBetween TradimefonandBovineSerumAlbumin TONGJin-qiang,XIONGZe-yunz,ZHANGHua-xin,MEIPing (1.CollegeofChemicalandEnvironmentalEngineering,YangtzeUniversity,Jingzhou434023,China; 2.CollegeofChemicalandPharmaceuticalEngineering,JingchuUniversityof Technology,Jingmen448000,China) Abstract:Theinteractionoftradimefontobovineserumalbumin(BSA)wasstudiedusingmolecularspec— troscopybyimitatinghumanbodyphysiologyenvironment.Theresultshowedthatthiscompoundhadapow— erfulabilitytoquenchtheBSAfluorescence.ByanalyzingthespectraldatawithStern—Vo lmerequationand Van’tHof{equation,thestaticfluorescencequenchingbindingconstant,thethermodynamicparameters,and thebindingpowerwereobtained. Keywords:tradimefon;bovineserumalbumin;fluorescencespectrum;thermodynamicparameter 五?口口H00目0l0;=