[doc] 大鼠蛛网膜下腔注射脂多糖后脊髓神经细胞内肿瘤坏死因子的表达及其动态变化

[doc] 大鼠蛛网膜下腔注射脂多糖后脊髓神经细胞内肿瘤坏死因子的表达及其动态变化 大鼠蛛网膜下腔注射脂多糖后脊髓神经细 胞内肿瘤坏死因子的表达及其动态变化 第l7卷第5期 2007年9月 江苏大学(医学版) JournalofJiangsuUniversity(MedicineEdition) Vo1.17No.5 Sep.2007 大鼠蛛网膜下腔注射脂多糖后脊髓神经细胞内 肿瘤坏死因子的表达及其动态变化 许燕,苏一星,孙湘兰,龚爱华,张志坚,许化溪 (江苏大学1.医学院;2.科学研究院,江苏镇江212013) [摘要]目的:探讨蛛网膜下腔注射脂多糖(1ipopolysaccharide,LPS)后, )在脊髓组织内表达 肿瘤坏死因子(TNF一0【 水平的动态变化及其在神经细胞内的定位.方法:SD大鼠蛛网膜下腔注射LPS后,采用ELISA法检测大鼠脊髓组织 匀浆内TNF—a含量;脊髓组织切片经神经丝(NF)和TNF—a免疫荧光双染色后,在荧光显微镜下观察TNF—a在脊髓神 经细胞内的定位.结果:脊髓组织内的TNF一0【于蛛网膜下腔注射LPS后1h开始升高,6h达到第一个高峰,随后下 降,至24h降至最低但仍高于正常水平,而后又开始上升,在第5天时 达到第二个高峰后再逐渐下降,到第l4天仍略 高于正常水平.结论:脊髓组织内的细胞受LPS刺激后,可产生大量的 TNF-0【,介导神经组织的炎症反应;脊髓灰质 内的神经细胞是LPS的主要靶细胞,可能具有调节脊髓损伤局部炎 症反应的生物学功能. [关键词]脊髓神经细胞;脂多糖;炎症反应;肿瘤坏死因子 [中图分类号]R392.1[文献标志码]A[文章编 号]1671—7783(2007)05—0386—03 DynamicchangeofexpressionanddistributionofTNF-OLinthespinal cordafterinjectionofLPSinsubarachnoidcavity XUYan,SUYi.xing,SUNXiang.1an,GONGAi.hua,ZHANGZhi~ian,XUHua.xi (1.SchoolofMedicine;2.AcadamyofScience,JiangsuUniversity,ZhenjiangJiangsu212013,China) [Abstract]Objective:ToexploretheexpressionofTNF-0 【inspinalcordaftertheinjectionofLPSin subarachnoidcavity.Methods:SDratsweredividedinto12groups.Onegroupservedasnormalcontro1. TherestreceivedinjectionofLPSinsubarachnoidcavityandwerekilledrespectivelyat1h,2h,4h,6h, 12h,24h,3d,5d,7d,and14d.Theextractofspinalcordtissuewasobtainedanda ssessedwiththe methodofELISAtodefinetheconcentrationofTNF-0 【indifferentgroups.Results:TheexpressionofTNF- 0 【startedtoincreaseatthe1sthourafterinjectionofLPSandreachedtothepeakatthe6thhour.Then. theleveldecreasedquicklyandcametothenormallevelatthe24thhour.Thelevelincreasedagainonthe 3rddayafterinjectionandincreasedtothesecondpeakonthe5thday.Duringthe7thtothe14thdayafter injection.theexpressionofTNF一0 【decreasedtothenormallevelstepbystep.TheTNF-0【wasmainlyloca- tedintheneurons.Conclusion:AftertheinjectionofLPSinsubarachnoidcavity,TNF一0【mayplayapiv- otalroleasanimmunomodulatorycytokineininflammatoryreactions. [Keywords]spinalcord;LPS;inflammatoryreactions;TNF-0【 肿瘤坏死因子.0【(tumornecrosisfactor-0【,TNF. d)是一种重要的炎症性细胞因子,在参与机体炎症 反应和神经系统损伤的修复等方面发挥着重要作 用.TNF.0【主要来源于单核/巨噬细胞和T淋巴细 胞,在中枢神经系统(centralnervesystem,CNS)中, TNF.0【则主要由小胶质细胞,星形胶质细胞和血管 内皮细胞产生,但在神经元内是否有TNF-0【表达仍 不太清楚.脂多糖(1ipopolysaccharide,LPS)作为革 兰氏阴性菌的细胞壁成分,对免疫细胞具有强烈的 刺激作用.本实验通过在sD大鼠蛛网膜下腔注射 [基金项目]国家自然科学基金资助项目(30570981);江苏省高校自然科学基金资助项目(04KJB310020) [作者简介]许燕(1963一),女,江苏无锡人,副教授,主要从事免疫调节方面的研究;张志坚(联系人),副研究员,硕士生导师,E—mail @ujs.edu.cn 第5期许燕,等.大鼠蛛网膜下腔注射脂多糖后脊髓神经细胞内肿瘤坏死因子的表达及其动态变化387 LPS建立脊髓炎症性损伤的动物模型,采用ELISA 法检测LPS刺激后TNF.0【在不同时间表达水平的 变化,,同时,用免疫荧光双染色技术,在荧光显微镜 下观察注射LPS后,TNF.0【在脊髓神经细胞内的定 位情况. 1和方法 1.1试剂 兔抗TNF.0【多克隆抗体,鼠抗NF单克隆抗体, cy3标记的抗兔IgG荧光二抗,FITC标记的抗鼠IgG 荧光二抗及LPS均购自Sigma公司;TNF.0【ELISA 试剂盒购自晶美生物工程有限公司. 1.2实验动物分组及动物模型制作 雄性SD大鼠(江苏大学实验动物中心提供)体 质量200—230g,随机分为三组:(1)LPS刺激组(n = 50),(2)生理盐水组(n=50),(3)正常对照组(n = 5);生理盐水组和LPS刺激组按术后动物存活时 间再分为术后1,2,4,6,12和24h,3,5,7和14d组 (n=5).用2%戊巴比妥钠(40mr/kg)腹腔麻醉 后,将动物俯卧固定,以T12椎体棘突为中心剪毛, 消毒,行背正中切口,分离皮肤及肌肉,显露T11一 L1棘突及椎板,用止血钳咬去T12棘突及椎板,充 分显露脊髓背侧和两侧.于蛛网膜下腔分别注射 LPS和生理盐水,缝合肌层及皮肤. 1.3组织固定,取材与切片 固定和取材:动物麻醉后,经心脏升动脉先灌注 37~C生理盐水300ml冲洗组织内血液,继之灌注 4oC4%低聚甲醛(pH7.4)500ml固定组织,1h后 取脊髓,置4%低聚甲醛中4~C后固定4—6h,25% 蔗糖4~C浸泡过夜或保存供组织切片用. 组织切片制作:用LEICACM1900恒冷箱切片 机,对两份脊髓组织作横切面和纵切面连续切片,切 片厚度20Ixm,分别贴于涂有多聚赖氨酸的圆形盖 玻片上,自然风干供免疫荧光染色用. 1.4组织匀浆提取 取实验动物新鲜脊髓组织,以每克组织加3ml 裂解液冰浴超声匀浆,3000r/rain离心5rain,吸上 清500l,一20?冻存备用. 1.5免疫荧光染色 将组织切片放人24孔培养板中,PBS清洗3 次后用含1%BSA和0.3%TritonX.100的PBS 37~C封闭1h后用兔抗TNF.0【多克隆抗体和鼠抗 NF单克隆抗体(用PBS以1:100稀释)37~C孵育3 h,PBS充分漂洗3次,用cy3标记的抗兔IgG荧光 二抗和FITC标记的抗鼠IgG荧光二抗(用PBS以 1:300稀释)37~C孵育1h,甘油封固后用荧光显微 镜观察. 1.6ELISA检测 脊髓损伤后不同时间取脊髓组织匀浆及不同浓 度品各100l//孔,加入已平衡至室温的ELISA 反应孔中,用封板胶纸封住反应孔,37?孵育90 rain,以配套洗涤液洗板4次,加人生物素化抗体工 作液100l//孔,封板37?孵育60rain,洗板4次, 加入酶结合物工作液100l//孔,封板37~C孵育30 rain,洗板4次,加显色剂100l//孔,避光37~C孵育 15rain,加入终止液100l//孔,混匀后即刻在酶标 仪上,于450nm波长处以阴性对照孔调零后检测各 孔D(45Onm)值,根据标准液结果得出标准曲线, 求出各组浓度值. 2结果 2.1脊髓组织免疫荧光染色结果 脊髓组织切片经兔抗TNF.0【多克隆抗体免疫 荧光染色后,用荧光显微镜观察发现,脊髓灰质内有 大量的TNF.0【染色阳性细胞(图1A),经神经细胞 特异性标志蛋白NF的单克隆抗体免疫荧光双染色 后(TNF.0【呈红色荧光,NF呈绿色荧光),证明TNF一 0【主要定位于神经细胞(图1B—D).LPS刺激后 荧光强度明显增强. 2.2ELISA测定结果 动物经LPS刺激后存活不同时间,取脊髓组织匀 浆进行TNF.0【检测.结果显示:脊髓组织匀浆中 TNF.0【于LPS刺激后1h迅速升高,6h达到第一个 高峰,随后下降,至第24小时降至最低但略高于基础 水平;随后,逐渐上升,至第5天出现第二个峰值又开 始下降,但即使下降至第14天仍高于正常水平.LPS 组TNF.0【表达高于生理盐水组的表达水平,同时,生 理盐水组的表达水平高于正常对照组(图2). : 重: 口LPS组 口生理盐水组 1h2h4h6h12h24h3d5d7d14d 时间 图2LPS刺激后脊髓组织匀浆中TNF-n含量的变化 Fig2ExpressionofTNF-ninsp.malcordafter themiee~onofLPS 388江苏大学(医学版)第17卷 3讨论 TNF—Ot是一种重要的细胞因子,有广泛的生物 学效应,主要来源于单核/巨噬细胞和T细胞,TNF— Ot既可在外周循环中产生也可在CNS的小胶质细 胞,星形胶质细胞和血管内皮细胞产生,在CNS免 疫炎性反应中发挥重要作用.TNF—Ot具有双重的生 物学效应,适量的TNF可激活免疫系统,产生抗菌 抗病毒的作用;过量的TNF—Ot可介导炎症反应,导 致机体发热,休克,并参与疾病的病理过程.在炎症 状态下TNF—Ot显着升高,目前认为TNF—Ot在化脓性 脑膜炎中可趋化中性粒细胞由外周血进入蛛网膜下 腔,TNF.Ot可能参与了化脓性脑膜炎局部炎症反应; 在脑创伤后可引起脑水肿,神经细胞损坏等炎症反 应1工j.中枢神经系统创伤性神经坏死多由继发性 炎症引起.可见不论内源性还是外源性的中枢神经 系统损伤,TNF—Ot都发挥着重要作用.尽管这些机 制尚不清楚,但某些作用确实可引起神经细胞损害, 如TNF—Ot可诱导CNS中某些重要神经毒性分子如 花生四烯酸及其代谢产物,氮氧化物的释放,从而引 起神经细胞坏死.因此控制神经组织的炎症显得十 分重要. 本实验通过蛛网膜下腔直接注射LPS,观察大 鼠TNF—Ot表达的变化情况.结果显示:在注射1h 后TNF表达上调,6h达到第一个高峰,随后下降, 24h降至最低但仍高于正常水平,随后又升高,在 第5天到达第二个高峰,然后逐渐下降,到第l4天 降至略高于正常水平.同时,生理盐水组TNF—Ot表 达亦高于正常对照组.我们推测TNF—Ot表达产生 第一个高峰主要是由中枢神经系统固有免疫产生, 第二个高峰主要与全身免疫系统激活有关.根据 IJiu等报道,巨噬细胞内TNF—Ot反应迟于神经细 胞.脑组织损伤后单核巨噬细胞的渗出在伤后24 , 72h才出现j,这从另一方面支持了上述结论. 本研究发现,脊髓灰质神经细胞内含有大量的TNF— Ot,由此推测,神经细胞可能具有固有免疫功能,关 于神经细胞如何调节脊髓损伤局部的炎症反应,有 待进一步研究. (本文图1见插图) [参考文献] [1]Lopez—ConesLF,Marquez—ArbizuR,Jimenez—Jimenez LM.eta1.Cerebrospinalfluidtumornecrosisfactor—al— pha,interleukin一1beta,interleukin-6,andinterleukin一 8asdiagnosticmarl(ersofcerebrospinalfluidinfection inneurosurgicalpatients[J].CritCareMed,2000,28 (1):215—219. [2]JainM,AnnaS,MehtaG,eta1.CSFinterleukin一1be— ta,tumornecrosisfactor—alphaandfreeradicalsproduc— tioninacutebacterialmeningitis[J].IndianPediatr, 2000,37(6):608—614. [3]?uT,ClarkRK,McDonnellPC,eta1.Tumornecrosis factor—alphaexpressioninischemicneurons[J]. Stroke,1994,25(7):1481—1488. [4]SoaresHD,HicksRR,SmithD,eta1.Inflammatory leukocyticrecruitmentanddiffuseneuronaldegeneration areseparatepathologicalprocessesresultingfromtrau— maticbraininjury[J].JNeurosci,1995,15(12):8223 — 8233. [收稿日期]2007—05—18[本文编辑]郭欣 中华临床医师杂志(电子版)征稿,征订 由中华人民共和国卫生部主管,中华医学会主办,中华医学电子音像出版社出版的中华临床医师杂志 (电子版)ISSN1674-0785CN11-9147/R于2007年正式创刊,月刊,以光盘附纸质导读形式面向全国公开发 行. 主要栏目有:专家笔谈,论着,短篇论着,综述,临床研究,临床经验,实验研究,病例,视频讲座,经典 术式,动态影像等.投稿信箱:北京市100035-50信箱邮编100035编辑部收 电子邮件:Lcdoctor@163.con电话:010—62219211传真:010—62234701 网址:www.clinicmed.cn 重要视频稿件请务必刻录成光盘邮寄至投稿信箱. 本刊设立继续教育栏目,参加继续教育学习,并答题可申办中华医学 会继续教育?类学分,本刊内容实 用,图文声像并茂,阅读收藏价值大,欢迎订阅.联系电话:010—62237337 许燕,等.大鼠蛛网膜下腔注射脂多糖后脊髓神经细胞内肿瘤坏死因子的表达及其动态变化 (正文见386—388页) 图1LPS~J激后TNF—a在脊髓灰质神经元内的表达(免疫荧光双标记) 李大鹏,等.免骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨修复材料体外构建组织工程骨的实验研究 (正文见389—392页) 图1原代兔骨髓问充质干细胞(倒置显微镜X100)图2第3代兔骨髓问充质干细胞(倒置显微镜X100) 陈建华,等.Livin在乳腺癌中襄其与Caspase一3,Ki67表达的关系(正文见415—418页) Ii]1Livin蛋白在乳腺癌细胞胞质表达m2Livin蛋白在乳腺癌细胞胞质表达 (SPX40)fsPX1001 1i]4casDase一3在乳腺癌细胞胞质表达 (sPX1000) ;