【doc】酸性铬蓝K在蛋白质大分子上Langmuir吸附聚集及应用

【doc】酸性铬蓝K在蛋白质大分子上Langmuir吸附聚集及应用 酸性铬蓝K在蛋白质大分子上Langmuir吸 附聚集及应用 第23卷第6期 2004年l1月 分析测试 F~NXICESHIXUEBAO(JournalofInstrumentalAn'alvsis) Vo1.23No.6 44,46 酸性铬蓝K在蛋白质大分子上Langmuir 吸附聚集及应用 何池洋,晏荣青 (安庆师范学院化学系,安徽安庆246011) 摘要:用微相吸附一光谱修正(MPASC)技术研究蛋白质(BSA)与酸性铬蓝K(ACBK)探针分子间的相互作用.通过 pH3.5的介质中蛋白质与酸性铬蓝K反应的光谱研究,测定了结合产物的物理化学参数:结合比为n(ACBK):n (BSA):62:1,平衡常数BK=2.2×l()5.BSA—ACBK摩尔吸收系数E=3.9×lo5L?toolcm,.该吸附 反应用于蛋白质样品测定,结果良好. 关键词:微相吸附一光谱修正技术(MPASC);lmngmuir吸附聚集;蛋白质;酸性铬蓝K 中图分类号:0657.32;Q51文献标识码:A文章编号:1004—4957(2004)06一OO44—03 LangmuirAggregationofAcidChromeBlueKinProteinMacromolecule andItsApplication HEChi—yang,YANRong—qing (DepartmentofChemisto,,AnqingTeachersCollege,Anqing246011,China) Abstract:Inthepresentwork.thecombinationofboththemicro— phaselangmuiradsorptionandthespec- tralcorrection(MPASC)techniquewasusedtoinvestigatethemolecularinteractionbetweenprotein【BSA) andacidchromeblueK(ACBK)aredescribed.Itprovidesaveryhelpfulexperimentalmethodforthestudyof theaggregationofadyeonbiomacromolecules.Inthispaper,theadsorptionofacidchromeblueKonpro- teinsWaSinvestigatedatpH3.5,anditobeyedtheLangmuirmonolayeradsorptionmode1.Theresultshowed thattheratioofACBKtoBSAwas62:1.theadsorptionconstantKWas2.2× 10.andtheirrealadsorptivi— tyise584=3.9×10L?nol 一?cm-..TheresultindicatesthatthisinteractionCanbeeffectivelyasound methodtobeappliedtothequantitativedeterminationofBSA. Keywords:MPASCtechnique;l_angmuiraggregation;Protein;AcidChromeBlueK 蛋白质化学是生物化学家当今感兴趣的前沿研究领域.研究小分子离子在蛋白质 大分子上的聚集 形式以及机理,对帮助人们弄清其污染物及毒物在蛋白质大分子上的结合,在病理 分析,临床检测以及 基因变异方面有重要意义.常用光谱分析方法包括分光光度法…,荧光法0和共振 光散射光谱技术 (RRS)0等.但是,大分子与探针分子间的结合机理仍存在一些尚未解决的问题0. 蛋白质分子由于 复杂的立体构象形成微弱静电场,在其作用下,带电荷的小分子以单分子层形式被 吸附到微相电场表 面.由于生化反应平衡方程与吸附剂在溶液中对吸附质分子的单分子层吸附一致, 故使用l_angmuir单 分子层等温吸附理论解释蛋白质分子与小分子相互作用是可行的0.I_angmuir等 温吸附方程为: 7=N+(KNcL)(1) y是探针L与蛋白质结合比,?是最大结合数,c.是L剩余浓度,K为结合常数.利用光谱修正 技术'测定结合体系中的y与c,由y一,c回归线性斜率可计算结合常数K值.式(1)与Pesavento 两相分配经验方程是一致的,y,"由下式计算: 7=力×c×c;1 cL=(1一刁)×c 77=(A一?4)/40 是L的有效反应分率,c是大分子摩尔浓度,c是酸性铬蓝K的初始摩尔浓度. 收稿日期:2003—11—19;修回日期:2004—09—12 基金项目:安徽省教育厅自然科学基金资助项目(2002kj200) 作者简介:何池洋(1968一),男,安徽枞阳人,副教授,博士研究生 (2) (3) (4) 4.为试剂空白 第6期何池洋等:酸性铬蓝K在蛋白质大分子上l~gmuir吸附聚集及应用45 (L溶液)在波长下测量吸光度.当体系L达到一定浓度时,结合比7达到最大值/v.吸附产物的真 实吸光度(|4)应由下式计算: A=(AA一?A)/(1一a)(5) 这里,?4,?4分别是反应平衡体系在峰吸收波长和谷吸收波长下的吸光度测量值,a,是修正 系数,一般为常数.溶液中结合产物的实际摩尔吸光系数e:由下式计算 ),C,1)(6) ,=/,,A/(艿 艿为比色皿厚度(cm). 本文研究了酸性铬蓝K与蛋白质问作用机理.通过pH3.5的介质中牛血清白蛋白(BSA)与酸性铬 蓝K(ACBK)反应的光谱研究,测定了结合产物的物理化学参数和摩尔吸收系数,并将该吸附反应用于 蛋白质样品测定. 1实验部分 1.1仪器及试剂 UV-2501PC紫外可见分光光度计(日本岛津公司);722型分光光度计(上海第二分析仪器厂);pHS一 2L酸度计(上海雷磁仪器厂);牛血清白蛋白溶液:配成1mg?mL储备液,再稀释成0.1mg?mL和 0.02mg?mL操作液,均置于4?下保存;Britton—Robinson(B—R)系列缓冲溶液(pH=2.5,5.8);0.5 mlnol?LACBK溶液;2mo]?LNaC1溶液;10g?LNa2EDTA溶液;所用水皆为二次蒸馏水;试剂均 为分析纯. 1.2实验方法 在l0?1IJ的比色管中加入1mLB—R缓冲溶液,一定量的BSA和2?1IJ的酸性铬蓝K溶液,用水稀 释至l0rnIJ,混匀后放置5min,用1cnl比色皿,以试剂空白为参比,在519,584Bin波长下测定吸光度, 分别计算A77,),,c一等值. 2结果与讨论 2.1吸收光谱分析 ACBK溶液及其与BSA反应的溶液在pH3.5下的吸收光 谱见图1,由图1曲线8可知,ACBK最大吸收位于519Dm,在 ACBK溶液中加入不同浓度的BSA,溶液在519,584nln下吸收 ,比值接近最小且 比值变化曲线见图2.当BSA超过2l11g时 保持常数.因此BSA加入量超过2mg时即可将2mIJ0.50 mlnol?LACBK几乎全部吸附,反应液中不再有游离的 ACBK.由图1曲线c可见,BSA—ACBK结合产物吸收峰位于 530nln.结合物比ACBK吸收峰仅红移11Bin,但由图1曲线b 可见,BSA—ACBK溶液波峰及波谷吸收分别位于584和519 nln.由曲线a和c可计算得a=1.6025,.8=0.2646.因此得 A:1.7362(AA一0.2646AA). 2.2pH和离子强度对BSA—ACBK结合物影响 实验表明.在pH3.0,3.8的溶液中,BSA—ACBK结合物 结合比),最大.本研究使用pH为3.5的BR缓冲溶液作为工 作介质.改变2mol?LNaC1溶液加入量,测量并计算溶液 的7,结果见图3.从图3可看出,BSA—ACBK结合物的结合 比7随离子强度的升高而缓慢减小,这是由于高浓度的cl一也 能被微静电场所吸附,占据了部分微相表面,因此,结合物结 合比随离子强度的升高而减小. 图lACBK和BSA—ACBK的吸收光谱 Fig.1AbsorptionspectraofACBKandits BSAsolutionatpH3.5 a.1.00molofACBK:b.1.00molofACBKand 5.00mgofBSA:c.J.00molofACBKand5.00 mgofBSAcontainingnofleeACBK.a,eagainst waterandbagainstthereagentblankreference m(BS^)/rag 图2m(BSA)一A../A曲线 Fig.2VariationofA519/Ass4ofsolution withBSAamountinitiallycontaimng1.00 "n1olofACBK 第6期石欲容等:手性药物安对映体的毛细管电泳/电化学分离检测研究49 1.0×10,mol/L,回归方程:),=11.3+12.0(~mol/L),检出限为5.0×10..mol/L. 2.6样品分析 按照实验方法对市售心得安药片(天津市力生制药厂)进行了检测,样品电泳谱图见图3. 3机理探讨R, — CD是由7个D.吡喃型葡萄糖基通过a.(1—4)糖苷键连接 而成的环状低聚糖,其外腔上宽下窄,其2.,3一位仲羟基及6一位 伯羟基分别位于锥筒空腔的大,小口端,—CD的空腔内表面只有 氢原子和带孤对电子的糖苷氧原子,所以一CD腔内疏水,腔外 亲水的两性分子,因此可以与一些有机化合物形成主一客体包容 型络合物(包合物).当对映体的分子大小及憎水性与.CD腔 体匹配,且和腔体周沿的基团发生3点作用,形成不同稳定常数 的包合物,就可以达到拆分对映体的目的.心得安对映体与一 CD相互作用时,疏水性较强的苯基与环糊精内腔发生分子间作 用力,而手性中心的羟基将与环糊精外缘的羟基以氢键力相互 作用,R型与S型由于空间位置的差异,从而产生稳定性差 图3心得安药片CE—SWAD电泳谱图 Fig.3TheCE—SWADelectropherogram ofpropranololmedicinetablets conditionsarethesanleasinFig.1 别.在酸性介质中,心得安因质子化而带正电,—cD则几乎呈电中性,带正电荷的包合物朝着负极(检 测端)迁移,与电渗流方向相同,包和物愈稳定朝着负极迁移速度愈大,出峰时问愈短. 4结论 与文献报道的紫外可见(uV)检测器的结果相比,SWAD的检出限和灵敏度均有较大的改善,表明毛细 管电泳/方波安培检测法作为一种新型灵敏的分离分析手段可望在手性药物对映体分离分析中有所作为. 参考文献: 【1]邱宗荫,王凌志,赵华,等.二乙酰酒石酸酐柱前手性衍生化反相高效液相色谱法拆分心得安对映体【J】.分析化 学,1995,23(3):268—272. 【2】XIAYQ.BAKHTIARR,FRANKLINRB.Automatedonlinedual—columnextractioncoupledwithteicoplaninstationaryphase forsimuhaneousdeterminationof(R)一and(S)-propranololinratplasmausingliquidchromatography—tandemInassspectrometry 【J1.JChromatogr.B,2003,788(2):317—329. 【3JKHALEDAA,BRIANJC,KEVINDA.Enantiomericpuritydeterminationofpropran ololbycapillaryelectrophoresisusingdual cyclodextrinsandapolyacrylamide—coatedcapillary【J】.Electrophoresis,1999.20(13):2723—2725. 【4】朱军,邹汉法,施维,等.填充毛细管电色谱手性分离….中国科学(B辑),1999,29(5):418—425. 【5】谢天尧,李娜,唐亚军,等.毛细管电泳方波安培检测法研究【J】.高等学校化学,2003,24(3):410—413. 0007!0,,,,,.,;\!,0,,.,,,,!,i,;\!,;\,;,! (上接第46页) 【5】郜洪文,陈运生.探针体在蛋白质大分子上Langmuir吸附聚集及应用——蛋白质/, - 4+ ,"光桃红B(PB)结合反应研究【J】. 高等学校化学,2002,23(5):825—827. 【6】郜洪文,訾言勤,李玉成.多色蓝在核酸分子上的Langmuir聚集吸附【J】.物理化学,2002,18(6):540—544. [71SCATCHARDG,SCHEINBERGIH,ARMSTRONGSH.Physicalchemistry=ofprotei nsolutions.?.Thecombinationofhuman Sel31malbuminwithchlorideion【J】.JAmChemSee,1950.72(1):535—540.