L-天冬氨酸丁酯）的合成及水解降解行为研究

L-天冬氨酸丁酯）的合成及水解降解行为研究 L-天冬氨酸丁酯)的合成及水解降解行为研 究 离子交换与吸附,201I,27(1):10—17 10NEXCHANGEANDADS0RPT10N 文章编号:1001—5493(20tDO10010—08 聚(L一天冬氨酸丁酯)的合成及水解降解行为研究 王勇,2王亦农伍国琳范云鸽马建标 1功能高分子材料教育部重点实验室,南开大学高分子研究所,天津300071 2中国协和医科大学,中国医学科学院生物医学工程研究所,天津300192 3天津理工大学化工学院,天津300191 摘要:以L一天冬氨酸为原料,采用热缩聚法合成聚琥珀酰亚胺.选用醇钠作为亲核试赍1j,开环 反应得到聚(a,p-烷氧基一L一天冬氨酸).该聚合物部分水解制备两亲性聚天冬氨酸 (PAsp—Na/PAsp—R).以聚(nL一天冬氨酸丁酯)为例,利用uV,HNMR等方法研究聚合物的 水解降解行为.通过HNMR中侧链酯基信号的消失和主链游离氨基在紫外光谱中吸光度的变 化,证明水解降解过程包括例链酯键的水解和主链酰胺键的适度裂解两部分,水解过程受环境 温度和缓冲溶液pH的共同影响.水解速率具有温度响应性,环境温度越高水解速率越快(37~C 时的水解速率>25~C时的水解速率).缓冲溶液pH对聚合物降解速率的影响顺序为:pH12> pH4>pH7. 关键词:聚天冬氨酸;降解;两亲性;环境敏感生物高分子 中图分类号:0631文献标识码:A 1引言 生物降解可吸收植入的高分子材料主要包括胶原,甲壳素,纤维素,聚酰胺,聚酯类 如聚乳酸及聚羟基乙酸等.聚氨基酸是一类具有类似蛋白质聚酰胺结构的生物可降解材 料.它可作为药物缓释载体,在药物释放殆尽后会自行分解,无需做手术除去,使用极其 方便.与用作生物医药及组织工程的传统材料相比,通过改变侧基种类或调整亲疏水侧基 之问的比例,聚氨基酸的物理及化学性质可在很宽的范围内发生变化H曲j.改性后的聚氨基 酸作为药物载体,可以人为控制降解速率,使其降解时间满足所包埋药物的要求而具有更 广泛的生物医用价值"】.而控制生物大分子的降解行为对于生物降解材料的应用是非常重 要的.就聚氨基酸衍生物降解过程而言,虽然Allcock等[9-101对该类聚合物的合成及降解性 能进行过研究,并提出了若干可能的降解机理,但对聚氨基酸的亲水性能与降解性能之间 的关系未作探讨,尤其对此类聚合物在生理环境下降解的具体途径并未加以证实. 收稿日期:2010年4月9日 项目基金:天津市自然科学基金(09JCYBJC03400,10JCYBJC26800);973前期研究专项(2009CB626612);高等学校 博士学科点专项科研基金资助课;中央高校基本科研业务费专项资金资助. 作者简介:t~(1973-),女,河北省人,博士.}}通讯联系人E-mail:jbma@nankai.edu.cn 第27卷第1期离子交换与吸附 聚天冬氨酸由于具有良好的生物相容性,生物可降解性,无毒副作用等特点在医药领 域有着广阔的应用前景,已经成为人们研究的热点之一[1卜】.通过在聚天冬氨酸侧链引入 不同的基团或把药物直接键合到聚合物侧链上,改变材料的亲疏水性,荷电性和酸碱性等, 可以调节所载药物的扩散速度和材料自身的降解速度【..在我们的前期工中,将亲 水基团与疏水基团引入聚天冬氨酸侧链,得到两亲性聚天冬氨酸.对聚合物在不同pH值 溶液中形成胶束的性能进行了深入细致的描述. 本文在前期工作的基础上制各了聚(a3.烷氧基一L.天冬氨酸)(PAsp.R),将PAsp.R部分 水解得到两亲性且具有生物可降解性的高分子.与前期制备两亲性聚合物的方法相比,该 制备方法温和简易,成本低廉.目标两亲性聚合物具有良好的生物可降解性.大分子主链 上的酰胺键可以适度裂解(聚酰胺的薄弱环节.酰胺键的断裂最终会形成羧基和胺基),侧 链上的酯键易于水解降解.紫外光谱和核磁谱图的变化说明环境温度及缓冲溶液pH值的 变化会影响聚天冬氨酸丁酯的水解降解行为.' 2实验部分 2.1试剂与仪器 L天冬氨酸,中国医药(集团)上海化学试剂公司.醇钠,实验室自制.其它试剂均 为纯. 核磁共振波谱仪:VarianIplus一400,溶剂为D2O,工作频率为400MHz;傅立 叶红外光谱仪:FTS.6000型,美国BIO—RAD公司,样品采用KBr压片;紫外一可见分光 光度计:UV-2450型,日本岛津公司;凝胶渗透色谱仪:Waters1525/2414型,美国waters 公司. 2.2聚(a3.丁氧基一L一天冬氨酸)共聚物的合成 以L.天冬氨酸为反应单体,按文献【1采用热缩聚法制备得到聚琥珀酰亚胺(PsI). 称 取0.291g(3mmo1)PSI,溶于5mL二甲基亚砜(DMSO)中,磁力搅拌,待其全部溶解后, 将溶有3mmol醇钠的DMSO溶液5mL滴加到反应体系中,磁力搅拌8h.将反应液倒入大 量的丙酮中沉淀洗涤3次,最后将产物在40?下真空干燥24h即可. 本文中以丁醇钠作为开环试剂制备得到聚(丁氧基.L一天冬氨酸)(PAsp—B)为例,说 明两亲性聚合物的合成过程及水解降解行为与环境温度及pH值之间的变化关系.以下无 特别说明的情况下,所合成的聚合物疏水性侧基为羧酸丁酯. 2.3天冬氨酸含量工作曲线的测定 分别量取0.3mmol/L的标准天冬氨酸溶液0mL,0.2mL,0.4mL,0.6mL,O.8mL,1.0mL 于试管中,用水补足至lmL.各加入lmLpH5.4,2mol/L醋酸缓冲溶液,再加入lmL茚 IonExchangeandAdsorption2011年2月 充分摇匀后,盖住试管口,在100~C水浴中加热15min,冷却后加入三酮显色液, 3mL60% 乙醇稀释,充分摇匀,用紫外.可见分光光度计测定OD57omn. 以OD5o为纵坐标,氨基酸含量为横坐标,绘制标准曲线.通过线性回归得到天冬 氨酸摩尔浓度与吸光度关系的计算方程. 2.4聚丁氧基.L.天冬氨酸)共聚物的水解降解 将聚(6【一丁氧基一L一天冬氨酸)(PAsp—B)(Mw=32832)分别溶于0.2mol/L的磷酸氢二钠/ 氢氧化钠缓冲溶液(pH=12),磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4),醋酸盐缓冲溶液(pH=4)中,样 品浓度为0.2wt%.分别在37~C和25?下在水浴恒温振荡器中保存不同时间,上层清液用 紫外一可见分光光度计测定吸光度. 将测定所得吸光度值代入浓度一吸光度方程,计算得出游离氨离子的摩尔浓度.以 摩尔 浓度的变化来说明主链酰胺键的裂解程度. 水解反应在37?和25?分别恒温12h,ld,2d,3d,5d,7d,10d,14d,21d后,终 止水解反应.将水解3d和21d后的溶液透析(透析袋截留分子量1000),冻干.测定聚( 丁氧基一L.天冬氨酸)水解降解前后的HNMR谱图,比较聚合物侧链上烷氧基质子信号峰 的变化,以此判定聚合物侧链酯基的水解程度. 采用凝胶渗透色谱法(GPC)测定样品的数均分子量(Mn),重均分子量(Mw)以及分 子量分布.取初始未降解样品粉末和降解21d后样品冻干粉末溶于二次蒸馏水,采用Waters 凝胶渗透色谱仪(色谱泵:Waters1525BinaryHPLCPump;监测器:Waters2414型示差 折光监测器)进行测定,聚乙二醇作为参比,二次蒸馏水为流动相,流速0.6mL/min,测 试温度25+_1?,数据采用Breeze软件处理. 3.1反应路线及水解降解示意图 3结果与讨论 O + O 一 RONa ~ IN一CI_IO上~hy:Imbtle. ,差一吐 Fig.1SynthesisRouteofPSI,PAsp—RandPAsp—Na/PAsp—R 心 HO CC — H 一一 一x]??1?._]OC H0 C?C— H 一一一 第27卷第1期离子交换与吸附?13? 图1为制备两亲性聚天冬氨酸的反应路线.在前期的研究D5]中,我们改性聚天冬氨酸 采用的方法是聚合物侧链羧基部分酯化.与原来的方法相比,此反应路线的优点在于可以 明显提高疏水性链段在聚合物中的含量,便于调整聚合物的亲疏水比例,保持聚合物分子 整体反应路线可以分成3步:第一,L一天冬氨酸通过热缩聚链的亲水一疏水平衡. 法制备得 到聚琥珀酰亚胺;第二,以醇钠作为亲核试剂,聚琥珀酰亚胺发生亲核取代反应,得到 聚(,烷氧基一L一天冬氨酸);第三,聚(,烷氧基一L一天冬氨酸)通过水解反应,部分侧链 上的酯基水解为羧基,得到侧链既有疏水性酯基,又有亲水性羧基的两亲性聚合物. 聚氨基酸的酰胺主链是由C—N键和C—C键共同组成,酰胺键CONH是整个链的薄弱 环节,它的离解能较低(约为276kJ/too1),分子链易于在此处断链;降解过程的初期以侧 链酯基水解为主,丁基从聚合物侧链上脱除,疏水性烷氧基链段逐渐被亲水性羧基侧链所 替代.聚氨基酸侧链的亲疏水性对其生物降解过程有着重要影响.侧链中如果含有亲水性 羧基或羟基,聚合物在体内体外都会以较快的速度降解.换句话说,聚氨基酸酯的水解脱 酯过程又会促进主链酰胺键的断裂.以下分别用核磁和紫外一可见分光光度法来检测水解降 解过程. 3.2聚合物核磁谱图分析 (A) 6 2 o(B) Jnb J Fig.2HNMRSpectraofPAsp—B(A)inD2OandPSI(B)inDMSO—d6 图2(A)为聚琥珀酰亚胺经过开环反应得到聚(,丁氧基一L一天冬氨酸)的HNMR谱 图.通过HNMR可以确定聚合物结构与组成,其结果如下:8=4.5—5.5ppm为聚酰胺主链 上次甲基-CH的信号峰,靠近低场归属为6【一CH,靠近高场则为/~-cn;通过计算反一CH与 /~-CH质子峰面积之比,可以得出开环反应制备聚合物中聚a.氨基酸与聚一氨基酸的比例 为1:0.67.8=2.53.5ppm为主链上亚甲基.CH2的质子峰;而8=3.7,8=1.6,8=1.35和8=0.6 的4组信号峰则依次对应于聚合物疏水侧链上丁基中的4种不同质子一CH2一CHz—CH2一CH3. PAsp-B由PSI开环反应制备得到,为证明聚合物已经全部开环,作为对比,我们给出聚琥 珀酰亚胺的HNMR谱图见图2(B).从图2(B)可以看出,PSI聚合物HNMR中只有两 IonExchangeandAdsorption2011年2月 种不同的质子信号峰,5=5,6ppm的次甲基和8=2.5,3.5ppm的亚甲基.如果聚合物没有完 全开环,则所制备聚合物主链上的次甲基会有3种不同的化学环境,反映到核磁谱图中则 存在3个次甲基质子信号峰(聚酰亚胺环.CH,开环后聚酰胺主链上—CH,p-CH).从图 2(A)和图2(B)的对比可以说明PSI已经完全开环,证明得到的聚合物为PAsp—B. 为说明PAsp—B水解降解过程中结构的变化,碱性水解3d后得到聚合物核磁谱图如图 3所示.与图2(A)相比,可以明显看出,聚合物侧链酯基中质子信号峰已经非常微弱, 几乎检测不到.从HNMR谱中侧链酯基与主链亚甲基两种质子信号峰相对强弱变化可以 发现,随着降解的进行,酯基含量逐渐减少,这说明聚合物降解时发生了酯水解反应,丁 氧基已经变成小分子从PAsp.B侧链上脱除,从其结构上证明了聚氨基酸酯降解的过程. Fig.3HNMRSpectraofltydrolyticDegradation ProductofPAsp—B 30002O001000 Wavenumber(ca-n) Fig.4IRSpectraofPAsp—BandDegradation ProductsatpH12 3.3PAsp—B降解前后的红外光谱分析 为证明聚合物水解降解前后的结构变化,我们还利用了红外光谱来观察聚合物中各特 征吸收峰的变化(图4).图4中各特征吸收峰为:酰胺A(3300cm)和酰胺B(3080cm), 脂肪族聚酯的酯键:v.(1740cm.).随着水解降解的进行,共聚物中酯基在1740cm处的 吸收峰的强度逐渐变弱,同时在16001300cm区间出现一系列较弱的吸收峰,这是降解 过程中有部分酰胺基水解为羧基所致.结果说明确实发生了降解反应. 3.4紫外.可见分光光度计测定聚合物主链酰胺键裂解与温度,pH值之间的关系 茚三酮显色法可以应用于氨基酸含量的测定.茚三酮溶液与氨基酸共热,生成氨,氨 与茚三酮和还原性茚三酮反应,生成紫色化合物.该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成 正比,可以通过测定570nm处的吸光度,测定氨基酸的含量.在聚氨基酸降解实验中,主 链酰胺键的裂解会体现在游离氨基摩尔浓度的变化上,所以通过茚三酮显色反应可以来追 图5(a)是我们以不同浓度L一天冬氨酸溶液绘踪聚氨基酸主链酰胺键裂解过程. 制的标准 第27卷第1期离子交换与吸附?15? 曲线.经过线性回归处理,得到浓度与吸光度关系的方程为:y_一0.0437+0.2501X. 图中B 为不同浓度标准氨基酸对应吸光度值,而直线为线性拟合后所得结果,线性相关系数为 R=0.99959. O12345 CX10(mol/L) 1.2 蚕Q8 墨 《0.4 55060o Wavelength(nm) Fig.5TheStandardCurveofL—asparticAcid(a)andAbsorbencyTraces(b)ofPAsp—BDegraded forDifferentPeriodsofTime(fromatof:0,3d,5d,10d,14d,21d) 图5(b)给出了PAsp—B聚合物溶液在pH=12缓冲溶液中水解降解不同时间后的紫外吸 光度曲线.从图中可以看出,随着水解裂解时问的延长,聚合物溶液的吸光度逐渐增大, 说明溶液中氨离子的摩尔浓度逐渐增加,而氨离子浓度的增加则是由于聚合物主链上酰胺 键的断裂引起. 宴 县 n.一 × U O510l52o Time(day) 5 一 皇 星4 3 2 05lO152O Time(day) Fig.6FreeAmmoniaMolecularConcentrationChangesofDegradingPAsp—BforDifferentPeriodsofTime inDisodiumHydrogenPhosphate/sodiumHydroxideBuffers(pH=12),PhosphateBuffers( pH=7.4), AcetateBuffers(pH=4)(a)andatDifferentTemperature(b) 为考察水解降解体系pH值对降解速率的影响,设定了3种不同的pH值缓冲溶液, 图6(a)是聚合物在37"C7J~恒温条件下,在酸性,碱性和中性缓冲溶液中的氨离子摩尔 浓度随时间的变化曲线.从图中看出随着时间延长,聚合物溶液中的氨离子浓度逐渐增加, 963O OOO ^.uaqJ0?《 ? l6?IonExchangeandAdsorption2011年2月 聚合物降解遵从的规律为pH12>pH4>pH7.4.为考察温度对水解性能的影响,我们测 定PAsp—B在碱性缓冲溶液中(pH=12)37"C和25~C条件下经过不同降解时间氨离子浓度变 降解速率加快.因为降解反应是吸化情况.结果如图6(b)所示.可以看出温度升高, 热 反应,降解过程需要一定的活化能,温度升高,降解加快.而温度升高,分子链的运动加 快,分子链更易伸展开,这样链内的薄弱环节易于暴露出来受其它基团作用而降解. 3.5GPC测定聚合物PAsp.B降解前后分子量变化 为验证聚合物降解行为的发生,我们利用GPC测定了聚合物PAsp—B在37?,不同 pH缓冲溶液中降解前后的分子量及分子量分布,结果如表1所示.从表1中我们可以看 出,聚合物PAsp—B在pH=12和pH=4缓冲溶液中的降解速率远远大于其在pH=7.4中的降 解速率.同时,由于降解后聚合物侧链上丁氧基会以小分子丁醇的形式被透析除去, 所以 降解后聚合物的分子量分布会有所变窄. TableITheAverageMolecularWeightsofPAsp—BPriortoDegradationandatDifferentpHofDegradation 4结论 以L一天冬氨酸为原料,利用热缩聚合成聚琥珀酰亚胺.通过聚琥珀酰亚胺开环反应, 制备得到聚天冬氨酸丁酯,详细考察聚氨基酸丁酯的水解脱酯和主链酰胺键断裂过程与温 度和pH值之间的关系.聚合物的水解降解过程分为两步,第一阶段以侧链酯基水解为主, 第二阶段则以主链酰胺键的裂解为主.无论是酯基水解速率还是酰胺键的裂解速率,都与 环境温度和pH值有关.聚合物的降解规律为:水解降解速率pH12>pH4>pH7-4;37*C 结果可用H或OH'在酯的水解过程和酰胺键的断裂中起不同增速作用>25?. 来解释.此 类两亲性生物可降解高分子预期在药物缓释控释领域有广阔的应用前景. 参考文献 【1】LimYB,KimSM,LeeY,eta1.JAmChemSoc[J].2001,123(10):2460-2461. 【2】LynnDM,AmijiMM,LangerR.AngewChemIntEd[J].2001,1l3(9):1757—1760. 【3】AkincA,LynnDM,AndersonDG,eta1.JAmChemSoc[J].2003,125(14):5316—5323 [4]ObstM,SteinbuchelA.Biomacromolecules【J】_2004,5(4):1166—1176. 第27卷第1期离子交换与吸附?17? 【5】WuDC,LiuY,JiangX,eta1.Biomacromolecules【J].2005,6(6):3166—3173. 【6】WuDC,LiuY,HeCB.Macromolecules【J].2008,41(1):18—20. 【7]ShimokufiT,KanekoT,AkashiM.MacromofBiosci【J].2006,6(11):942—951. [8】JaegerRD,GleriaM.ProgPolymSci【J].1998,23(2):179—276. [9】AllcockHR,FullerTJ,MackDP,eta1.Macromolecules【J].】977,10(4):824—830. [10】AllcockHR,PucherSR,ScopelianosAG.Macromolecules【J1.1994,27(1):l一4. 【ll】YangJ,WangF,FangL,eta1.EnvironPollut【J】.2007,149(1):125—130. [12】JunY,LiF,TanTW.JApplPotymSci[J].2006,102(1):550—557. [13】JeongJH,KangHS,YangSR,eta1.PolymerfJ].2003,44(3):583—591. 【l4】WeiC,ChenHR,HuJH,eta1.Colloids"A【J1.2006,278(1):60—66. 【15]WangY,WangYN,WuGL,FanYG,MaJB.ColloidsS"矿B[J】.2009,68(1):13—19. 【16】NeffAntoniGBenvenutiEeta1.JMedChem【J】_1973,16(8):893—897. SYNTHESISANDHYDROLYTICDEGRADATIoNoF POLY(a,fl-BUToXY?L-ASPARTATE) WANGYong'WANGYinongWUGuolinFANYungeMAJianbiao . TheKeylaboratoryofFunctionalPolymerMaterials(MinistryofEducation) InstituteofPolymerChemistry,NankaiUniversity,77anjin3ooo71.China 2.InstituteofBiomedicalEngineering.PekingUnionMedicalCollege&ChineseAcademyof MedicalSciences,Tianjin300192,China 3.SchoolofChemist~andChemicalEngineering,77anjinUniversityofTechnology Tianjin300191,China Abstract:Novelpoly(a,fl—alkoxy—L— aspartates)weresuccessfullysynthesizedbynucleophilic substitutioninpolysuccinimidewhichwasthethermalpolycOndensatiOnproductofL— aspartic acid.AmphiphilicpolymerPAsp—Na/PAsp—Rcouldbeobtainedbypartiallyhydrolysisof poly(a,alkoxy—L—aspartates).Hydrolysisprocessofpoly(a,fl-butoxy—I一 aspartates)(PAsp—B) wasstudiedbyUVspectroscopyandHNMR.Theresultsshowedthatthedegradationof PAsp— Bincludedtherapideliminationofbutylsidechainsandthemoderatecleavageofpeptide linkagesinbackboneaswellasthatthehydrolyticpropertiesofPAsp—Bwerecontrolledby hydrolyticenvironmentssuchastemperatureandpHvalue.ThehydrolysisrateofPAsp— Bin aqueoussolutionsdecreasedintheorderofpH12>pH4>pH7andincreasedwithincreasingthe environmentaltemperature(forexample,thehydrolysisrateofPAsp-Bwashigherat37~Cthan thatat25.C,. Keywords:Polyaspartate;Degradation;Amphiphiles;Stimuli—responsivebiopolymer.