实时荧光定量RT-PCR检测原发性肝细胞癌中Dicer

实时荧光定量RT-PCR检测原发性肝细胞癌中Dicer 实时荧光定量RT-PCR检测原发性肝细胞 癌中Dicer ? 842?第 Aca 二 d 军医学2oo6A ug;27AcadJSecMiMedUniv(8)l…, ? 论着? 实时荧光定量RT-PCR检测原发性肝细胞癌中DicermRNA的达 王玉兰.,王爱华,陈允硕,侯丽娜.,王华梁 (1.第二军医大学东方肝胆外科医院检验科,上海200438;2.上海市市东医院,上海200090) [摘要]目的:建立DicermRNA表达量检测的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(reversetranscriptasepolymerasechain reaction,RT—PCR)系统,检测肝癌细胞系与2O例原发性肝细胞癌(primaryhepatocellularcarcinoma,PHC)组织中DicermR— NA的表达水平.方法:根据DicermRNA的全序列设计特异性引物,结合荧光染料SYBRGreenI,RT-PCR扩增目的片段 并实时检测产物的荧光强度,进行熔解曲线排除非特异性扩增,根据品绘制标准曲线,由软件自动计算出待测样品 DicermRNA的准确含量,并以DicermRNA和18SrRNA含量的比值作为Dicer表达水平的指标.结杲:该方法检测的线性 范围为5×10.,5×10.copies/~l,样本的批内变异系数与批间变异系数为4.13,19.72和6.25,18.76.DicermR— NA在HBV阳性肝癌细胞系HepG2.2.15和HBV阴性肝癌细胞系HepG2的表达 水平明显低于正常肝细胞系WRL-68(P< 0.05);在PHC组织的表达水平明显低于癌旁配对组织(P<O.05).结论:该方法具 有较好的灵敏度,特异性和重复性.Dic— ermRNA表达量在肝癌细胞系和PHC组织中的检测为以后更好的研究PHC的发 病机制奠定了理论基础. [关键词]Dicer;癌,肝细胞;实时荧光定量RT—PCR [中图分类号]R735.7[文献标识码]A[文章编号]0258—879X(2006)08—0842—03 RealtimefluorescentquantitativeRT-PCRindeterminationofDicermRNAinprimaryhepatocellularcarcinoma WANGYu-lan,WANGAi—hua,CHENYun-shuo.,HOULi—na,WANGHua— liang(1.ClinicalLaboratory,Eastern HepatobiliarySurgeryHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200438,China;2.ShanghaiShidongHospital, Shanghai200090) [-ABSTRACT]Objective:Todeveloparealtimefluorescentquantitativereversetranscriptasepolymerasechainreaction(RT— PCR)systemfordeterminingtheexpressionofDicermRNAinhumanhepatomacelllinesand20samplesofprimaryhepatocel— lularcarcinoma(PHC)tissues.Methods:Thespecificprimers,designedaccordingtothecompletesequenceofDicermRNA, andthefluorescencedyeSYBRGreen1wereusedforRT— PCRamplification.Thefluorescencewasmonitoredinarealtime manner.TheexpressionlevelsofDicermRNAinsampleswerecalculatedaccordingtothestandardcurveandthenonspecific amplificationswereexcludedbymeltingcurveanalysis.ThemRNAlevelsofDicerwerepresentedastheratiosofDicermRNA to18SrRNA.Results:Thelineardetectionrangeofthissystemwasfrom5×10.to5× 10.copies/~landthecoefficientofvaria— tionvaluesforintra— experimentalandinter-experimentalreproducibilityrangedfrom4.13to19.72andfrom6.25to 18.76,respectively.TheexpressionlevelsofDicermRNAinHBVpositivehepatomacelllineHepG2.2.15orinHBVnega— tivehepatomacelllineHepG2weresignificantlylower(P<O.05)comparedtothoseofthenormallivercelllineWRL一68;and thoseinPHCtissueswerelowercomparedtothoseinthecorrespondingadjacenttissuesofPHC(P<O.05).Conclusion:Real timefluorescentquantitativeRT— PCRhasgoodsensitivity,specificityandreproducibilityindeterminingDicermRNAlevels. DeterminationofDicermRNAlevelsinhepatomacelllinesandPHCtissueslaysagoodtheoreticalfoundationforfurtherstud— yingthemechanismofPHC. [-KEYWORDS]Dicer;carcinoma,hepatoceIlular;realtimefluorescentquantitativeRT— PCR [AcadJSecMilMedUniv,2006,27(8):842-844] 原发性肝细胞癌(primaryhepatocellularcarci— noma,PHC)是指肝细胞发生的肿瘤,为我国常见恶 性肿瘤之一,其死亡率在消化系统恶性肿瘤中列第 三位,仅次于胃癌和食管癌.本病可发生于任何年 龄,以40,49岁多见,男女发病之比为(2,5):1. 肝癌的致病因素因不同地区而异,但大多有乙型肝 炎病毒(HBV)感染的背景.近年报道,我国PHC 患者中HBsAg阳性的约为63.2],HBV阳性 PHC患者占多数. 在RNasellIDicer的酶切产物之中,有一类 miRNA约含有22个核苷酸,这类miRNA数量很 多并且高度保守,构成一个调节RNA体系,miR— NA的表达有一定特异性.越来越多的实验证明这 [作者简介]王玉兰,硕士生. 'Correspondingauthor.E-mail:hlwang2@163.com 第8期.王玉兰,等.实时荧光定量RT—PCR检测原发性肝细胞癌中DicermRNA的 表达?843? 些调节RNA量的改变与人类肿瘤的发生有关_3]: 如miRNAlet一7与非小细胞肺癌有关,miR一15, miR-16与慢性淋巴细胞白血病有关,miR一143,miR一 145与人结肠癌有关.在非小细胞肺癌当中miR— NAlet一7的表达量是下降的,并且产生miRNAlet一 7的上游酶RNasemDicer的表达量也是下降的,这 种患者预后差,生存率低].本研究重点研究PHC 患者中RNasemDicer的表达量是否有异常,为进 一 步研究PHC的发病机制提供一定的理论基 础. 1材料和方法 1.1细胞人正常肝细胞系WRL一68由本院分子 肿瘤实验室馈赠,培养基为含10小牛血清(杭州 四季青)的RPMI1640(Gibco);HBV阴性肝癌细胞 系HepG2由本院信号转导实验室馈赠,培养基为含 10胎牛血清(Gibco)的DMEM(Gibco);HBV阳 性肝癌细胞系HepG2.2.15引自上海中国科学院细 胞库,培养基为含10胎牛血清,G418(Merk)的终 浓度为380~ug/ml的MEM(Gibco),所有细胞均置 于5CO培养箱中37?培养. 1.2PHC组织的采集PHC组织标本来自本院 手术患者,分别取癌瘤的中央部位,及癌旁组织配对 标本液氮速冻后置一8O?保存备用,同时送病理切 片.所有病例均经病理学证实,并进行严格的病理 诊断.癌与癌旁新鲜配对标本共20例,男16例,女 4例,年龄35,55岁,均为HBV阳性PHC标本. 1.3引物设计根据目的产物DicermRNA(No. NM177438或No.NM030621)和内参照18SrRNA (No.K03432或No.M10098)的全序列,应用在线 引物设计软件primer3.0设计,采用BLAST进行 比对,由Invitrogen公司合成.Dicer-S:5r-GTA CGACTACCACAAGTACTTC一3;Dicer-AS: 5一ATAGTACACCTGCCAGACTGT一3;产物 大小253bp.18SrRNA-S:5一CGGCTACCA CATCCAAGGAA一3;18SrRNA—AS:5一GCT GGAATTACCGCGGCT-3;产物大小187bp. 1.4RNA提取和逆转录反应3种细胞系计数后 传代于6孑L板,待细胞长满(约2.5×10/孑L),用 PBS洗3遍后,每孔加1mlTRIzol试剂(Invitro- gen)提取细胞总RNA;取50,100mgPHC组织及 癌旁配对组织加1mlTRIzol试剂用同样方法提取 组织RNA;紫外分光光度计检测RNA的质量和浓 度.取2g总RNA进行逆转录反应,0.5g/l随 机引物(Promega)1"l,用DEPC水补足体系至15 "l,70?5min,后加M—MLV5×逆转录反应缓冲液 5l,200U/tdM—MLV逆转录酶(Promega)1l, 100mmol/LdNTPs(上海申能博彩生物科技有限 公司)0.51再用DEPC水补足体系至251,37?1 h.cDNA分装,置一40?保存备用. 1.5Dicer和18SrRNA定量标准品质粒的构 建取上述cDNA1l用引物Dicer—S,Dicer-AS和 18SrRNA—S,18SrRNA—AS,进行PCR扩增.该 PCR体系包括:100mmol/LdNTPs0.5"l,10× PCR缓冲液5l,TaqDNA聚合酶(上海申能博彩 生物科技有限公司)0.5l,正反引物各0.5l,用 ddHO补足体系至50l.PCR产物电泳,电泳后 用胶回收试剂盒(TaKaRa公司)回收电泳产物3l (约20ng)与pMD18一T载体(TaKaRa公司)连接 16.C30min.连接产物转化感受态大肠杆菌 JM109(Promega),在具Amp抗性的L一琼脂平板培 养基上培养,37?12,16h.经蓝白斑筛选,阳性克 隆进行测序分析,筛选出的阳性菌株进一步扩增,抽 提质粒,用紫外分光光度计准确定量,并进行10倍 稀释,作为标准品一40?保存. 1.6DicermRNA定量测定取上述合成的cD- NA模板2"l,PlatinumSYBRGreenqPCRSuper— MixUDG(Invitrogen)10"l,20×牛血清白蛋白 (Invitrogen)1l,上下游引物各1l,用ddH20补 足体系至20l,混合后加入专用毛细管中,并设阴 性对照,和质粒标准品(5×10,5×10,5×10,5× 10,5×10.copies/tA).各反应管于荧光定量PCR 仪(RocheLightcycler)进行扩增,50?预热2min, 95?预变性2min,然后进入循环94?变性5S, 50?退火10s(Dicer)/55?退火10S(18SrRNA), 72?延伸10S,共45个循环,最后降至4?.根据各 自标准品建立标准曲线,并计算待测样本中的Dicer 和18SrRNAmRNA的准确含量.为了消除样本 RNA的提取,逆转录和PCR反应的差异,以Dicer 和18SrRNA含量的比值作为评价DicermRNA表 达水平的指标. 1.7统计学处理应用SPSS11.0统计分析软件 对实验数据进行t检验. 2结果 2.1实时荧光定量RT—PCR方法检测DicermR— NA的灵敏度,特异性与重复性将10倍系列稀释 的质粒标准品,用建立的该方法测定,结果显示本方 法具有较好的检测灵敏度(5×10.copies/~d).Ct 值和模板起始拷贝数的对数lg值之间具有较好的 ?844?第二军医大学2006年8月,第27卷 线性关系(r?一1.00,y一一4.475x+50.56).熔 解曲线分析可见只有单峰值,排除了非特异性扩增 (图1).批内与批间的变异系数分别为4.13, 19.72%(一3)和6.25%,18.76%(一3). o727476788082848688909294 Temperature(t/"C) 0727476788082848688909294 Temperature(t/?) 图1Dicer(A)和18SrRNA(B)的熔解曲线 Fig1MeltingCUl-V~ofDicer(A)and18SrRNA(B) A;SomefoldsserialdilutionsofDicerplasmidandsomesamples; B:Somefoldsserialdilutionsof18SrRNAplasmidandsomesamples 2.2不同肝癌细胞系中DicerITIRNA的表达与 正常肝细胞系WRL一68(0.026?0.005)相比,HBV 阳性肝癌细胞系HepG2.2.15中DicermRNA的表 达量(0.00026?0.00004)是显着下降的(t一 10.34,P<O.05),HBV阴性肝癌细胞系HepG2中 DicermRNA的表达量(0.0016?0.0002)也是显 着下降的(t一9.80,P<0.05). 2.3PHC组织中DicermRNA的表达与癌旁配 对肝组织(0.0004?0.0003)相比,PHC组织中 DicermRNA的表达量(0.0001?0.00002)是显着 下降的(t一2.808,P<0.05). 3讨论 结合荧光染料SYBRGreenI和相应的熔解曲 线分析,实时荧光定量RT—PCR方法的优点是在 PCR扩增的对数期对模板mRNA进行定量,结果 更为可靠,扩增与检测同时进行,能减少交叉污染引 起的假阳性,具有较高的灵敏性,特异性.本研究通 过实时荧光定量RT—PCR方法检测肝癌细胞系和 PHC组织中DicermRNA的表达量,与正常肝细胞 系对照,肝癌细胞系无论是HBV阳性还是阴性, DicermRNA的表达量都是下降的;与癌旁配对肝 组织相比,PHC组织中DicermRNA的表达量同样 也是下降的.人的RNaseHIDicer是存在于胞质中 的一种酶,属于RNaseIll这一大家族中分类中的第 三大类,该酶的酶切产物之一miRNA与该酶及其 他蛋白质形成的核酸蛋白复合物可以调节机体基因 的表达,当miRNA与某一基因同源时,若可以与该 基因mRNA的3端非翻译区不完全互补结合,此时 miRNA所形成的复合物会阻止该基因mRNA翻译 成相应的蛋白质,我们称之为翻译抑制;若可以与该 基因mRNA完全互补结合,则在该复合物中的核酸 内切酶Dicer的作用之下,该基因mRNA就会被切 割降解,达到基因沉默效应,发挥类似于siRNA的 作用3.本实验仅从mRNA水平证明了肝癌细胞 系和PHC组织中Dicer的表达量是下降的,为以后 进一步从基因水平研究PHC的发病机制提供了基 础.至于Dicer的下游产物miRNA的改变及miR— NA的下游基因的改变,都有待进一步研究. 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[收稿日期]2006—01—13[修回日期]2006—03—30 [本文编辑]尹茶 84O62844加?o???. 工p/(一一p—u—矗u田—呈1l口/t一一p—名u田—呈一