甘草活性成分抗呼吸道合胞病毒作用

甘草活性成分抗呼吸道合胞病毒作用         &nb sp;     作者:张建军 李洪源 王吉锡 李鑫 朴英爱 陈振华 谢志平 杨庆伟 【摘要】  目的 研究甘草抗病毒活性成分(GX)体外抗呼吸道合胞病毒(RSV)的作用。方法 采用中性红实验和观察细胞病变(CPE)法～以利巴韦林为阳性药,测定GX对RSV的抑制作用。结果 GX的半数中毒浓度,TC50,为460.00?μg/ml～半数有效抑制浓度(EC50)为23.53?μg/ml～治疗指数(TI)为19.55;GX在RSV感染Hela细胞2～4～6～8～10?h后给药, 对RSV复制均有明显的抑制作用(P<0.01),且GX对RSV有中和作用。结论 GX在体外对RSV复制有明显的抑制作用。 【关键词】  甘草,呼吸道合胞病毒,抗病毒作用 呼吸道合胞病毒,RSV,是一个世界范围内婴幼儿最常见的呼吸道感染的病原体。目前～对RSV的防治仍无有效的疫苗和药物〔1〕。近年来～国内外有关抗病毒中药的研究日益增多～从中筛选其有效成分已成为当前抗病毒新药开发的一个热点〔2〕。本课题组在2004年报道甘草水提液具有 明显的抗RSV的作用,在2005年发现甘草有效部位GC3 1 4具有抗RSV的作用基础上〔3〕,进一步分离到抗病毒活性成分,GX,～并在细胞水平上检测其抗RSV的作用。现将结果如下。 1 对象与方法 1 1  材料        &nb sp;      甘草(产地内蒙古～经黑龙江省药品检验中药研究所鉴定)。利巴韦林注射液(天津药业集团新郑股份有限公司,批号:0610152)。人宫颈癌传代细胞(Hela),(中国疾病预防控制中心病毒研究所)。呼吸道合胞病毒(RSV-Long株)(中国疾病预防控制中心病毒研究所)。RSV在Hela细胞中的组织半数感染量(TCID50)为1×10-6.6/0.2?ml。本次实验采用100TCID50/0.2?ml的感染量。硅胶制备板(安徽良臣硅源材料厂)。甲醇、三氯甲烷、无水乙醇等～均为分析纯(天津市博迪化工有限公司)。中性红(上海华舜生物工程有限公司)～用磷酸盐缓冲液稀释。脱色液:由无水乙醇、枸橼酸钠和盐酸组成。 1 2 方法 1 2 1  甘草抗病毒活性成分,GX,的制备         &nb sp;      甘草经水煎煮浸提、醇沉、大孔吸附树脂柱层析得到 的GC3 1 4,再经由氯仿和甲醇组成的展开剂～在硅胶板 上经薄层层析得GX。 1 2 2 药物毒性实验         &nb sp;      用细胞维持液将GX和利巴韦林释为7个浓度组～分 别加入到Hela细胞已长成单层的96孔培养板上。同时设正 常细胞对照组。置35?、5% CO2培养箱培养3?d后～弃去 维持液,每孔添加0.2?ml中性红染液,放回培养箱培养2?h。 取出后用磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次,添加0.2?ml脱色液。 室温暗处放置30?min后,酶标仪450?nm波长下测吸光度(A)值〔4〕～测定细胞存活率～求药物半数中毒浓度(TC50)。细 胞存活率=药物组平均A值/细胞对照组平均A值×100%。 1 2 3 药物抗RSV实验        &nb sp;      参照文献〔5〕。实验分3组进行。(1)药物的抑制作用:在96孔板上～接种100TCID50/0.2?ml RSV液～0.2?ml/孔。吸附2?h后～分别加入不同浓度的GX和利巴韦林。置培养箱中培养。同时设正常细胞对照组和病毒对照组～待病毒对照组细胞病变(CPE)为4时～中性红实验同上,测定病毒抑制率～求药物的半数有效浓度(EC50)和治疗指数(TI)。病毒抑制率=,实验组(药物+病毒)平均A值-病毒对照组平均A值,/,正常细胞对照组平均A值-病毒对照组平均A值,×100%。CPE记录规则:0为细胞无CPE,1为0，25% CPE,2为25%，50% CPE,3为50%，75% CPE,4为75%，100% CPE。TI=TC50/EC50。(2)不同时间给药对RSV抑制作用:向96孔板中～加入100TCID50/0.2?ml RSV液～0.2?ml/孔～分别作用2～4～6～8～10～12?h后吸弃病毒液～再分别加入GX,浓度为120.00?μg/ml,和利巴韦林,浓度为80.00?μg/ml,～培养方法同上。待病毒对照组CPE为4时～记录CPE结果。(3)药物的中和作用:200TCID50/0.2?ml RSV液与含不同浓 度药物的维持液等体积混合～35?作用2?h后,加到96孔板 中～0.2?ml/孔。吸附2?h～弃上清～加细胞维持液～置培养 箱中培养。待病毒对照组CPE为4时～记录CPE结果。 1 3 统计分析         &nb sp;      采用SAS?8 2软件进行分析。利用Reed Muench法测定病毒TCID50～Logit回归计算药物TC50和EC50〔6〕。不同时间处理组或不同剂量组与病毒对照组之间的结果比 较采用Kruskal-Wallis法。 2 结 果 2 1  药物毒性结果测定         &nb sp;      根据中性红实验测定细胞存活率～Logit回归计算得 GX的TC50为460.00?μg/ml～利巴韦林的TC50为 1.01?mg/ml。 2 2 药物对细胞内RSV抑制作用(表1)  表1 GX和利巴韦林对RSV的抑制作用GX浓度 (略)        1        经Logit回归方法计算得GX的EC50为23.53?μg/ml～ 利巴韦林的EC50为12.90?μg/ml。所以GX的TI为19.55～ 利巴韦林的TI为78.29,GX在一定浓度时对RSV在Hela细 胞内的复制有明显的抑制作用。 2 3  不同时间给药对RSV抑制作用         &nb sp;      Kruskal-Wallis检验结果表明～在RSV感染2～4～6～ 8～10?h后给药～GX和利巴韦林组细胞病变(CPE)程度均低 于病毒对照组～且差异有统计学意义(P<0 01)～说明 在RSV感染2～4～6～8～10?h后给药～GX仍具有抑制RSV 在Hela细胞内复制的作用。 2 4 药物对RSV的中和作用(表2)表2 GX和利巴韦 林对RSV中和作用,略,注:* P<0.01                &nb sp;    GX15 55?μg/ml及以上各药物浓度组CPE程度均低于病毒对照组CPE,差异有统计学意义(P<0 01),利巴韦林10 37?μg/ml及以上各药物浓度组CPE程度也低于病毒对照组CPE～差异也有统计学意义(P<0 01)。说明GX在一定浓度时～对病毒有较好的直接灭活作用。 3 讨 论 本实验用抗病毒活性作为导向分离方法从甘草中分离到抗病毒成分GX。为了验证GX抗RSV的作用～实验中RSV病毒感染量定为100TCID50/0 2?ml～并设立了严格对照组(正常细胞对照～病毒对照和阳性药物对照)。结果表明GX对RSV复制有明显的抑制效果～其EC50为23 53?μg/ml～TI为19 55。结果也表明～GX抗RSV作用是多途径的～不仅有直接灭活病毒的作用～而且对于进入细胞的病毒～无论是在病毒复制的早期～还是在病毒复制的中晚期～均有一定的抑制作用。                          目前～大多数研究认为甘草中有抗病毒作用的主要成 分是甘草酸〔7〕和甘草多糖〔8〕。实验中～初步验证GX不 是甘草酸和甘草多糖～可能是一种新的抗病毒物质～因此～ 应对GX化学结构进行深入研究。体外研究不能充分体现药 物在体内的生化转化效应,本实验有待于在动物体内检验其 抗RSV的作用,GX是通过抑制病毒核酸复制,还是通过阻止 病毒蛋白合成～而实现对RSV复制的抑制～其具体作用机制 尚需研究。 【参考文献】   〔1〕Lucia FB.Prevention of respiratory syncytial virus infection,J,.Rev Hosp Clin Fac Med Sao Paulo,2001,56(3):79-90. 〔2〕朱丹,刘华刚.抗病毒中药的最新研究进展,J,. 中国医学文摘:内科学～2005～26(6):747-748. 〔3〕刘鑫妍～李洪源～王秀琴～等.甘草抗病毒有效 部位(GC3-1-4)体外抑制呼吸道合胞病毒的研究,J,.中医 药信息～2006～23,4,:65-67. 〔4〕Mark RP,Dale LB,Paul FT.Potent inhibition of respiratory syncytial virus replication using a 2-5A-antisense chimera targeted to signals within the virus genomic RNA,J,.Proc Natl Acad Sci U S A～ 1998,95(15):8874-8879. 〔5〕何静～杨占秋～石丽桥～等.盐酸阿比朵尔抗呼 吸道合胞病毒机制初探,J,.武汉大学学报:医学 版,2006,27(1):69-71. 〔6〕刘昌孝～孙瑞元.药物评价实验设计与统计学基 础,M,.北京:军事医学科学出版社～1999:31-32. 〔7〕Jeffrey IC.Licking latency with licorice ,J,.J Clin Invest,2005～115(3):591-593. 〔8〕汲晨锋,姜薇,王晓晶.甘草多糖的化学与药理研 究.,J,哈尔滨商业大学学报:自然科学版～ 2004,20(5):515-518.