慢性肺疾病患儿全血细胞因子研究

慢性肺疾病患儿全血细胞因子研究 南方医科大学级硕学位论文 慢性肺疾病患儿全血细胞因子研究 ?? ? 课题来源:广东省自然科学基金 业 称 专 名 儿科学 学位申请 人 罗 英 指 导 教 师 黄为民教授 答辩委员会主席 崔其亮教授 答辩委员会成员 王斌教授 周 伟 教授 钱新华教授 姚英民教授 论文评阅人 崔其亮教授 姚英民 教授 教授 年月日 广州『删舢四『删『『『『『四舳硕士学位论文 慢性肺疾病患儿全血细胞因子研究 硕士研究生:罗英 指导老师:黄为民教授 摘要 背景 慢性肺疾病 ,是早产儿常见的并发症之一, 其最终结局为肺组织纤维化,是早产儿致残、致死的重要原因。约%%的 患儿于生后年内死于呼吸衰竭,存活者也需要长期依赖氧气或呼吸机治疗, 直接影响患儿日后的生活质量,给家庭和社会带来沉重的经济和精神负担。随 着围产医学的不断发展,极低出生体重儿的存活率明显提高,慢性肺疾病的总 发病率呈逐年上升趋势,国外报道目前在所有新生儿中慢性肺疾病的发病率为 .%,已成为新生儿重症监护室最棘手的问题之一。 的发病机制十分复杂,但其本质是在遗传易感性的基础上,各种医源 性因素如氧中毒、气压伤或容量伤以及感染和炎症等对发育不成熟的肺造 成的损伤,最终导致肺组织异常修复。目前认为炎症反应在慢性肺疾病的发病 过程中发挥了极其关键的作用,而细胞因子是参与肺内炎症反应的主要介质, 促进着的发生和发展,但确切机制至今仍不明确。已有大量研究评估了 或高风险者的羊水、脐带血、血浆、气道分泌物中细胞因子的情况,表明 肺组织或支气管肺泡灌洗液中的.、.、.、.等前炎症 因子早期呈高水平并持续表达,发生于各种病因造成的中,但持续时间尚 有争议。趋化因子包括单核细胞趋化蛋白..,.,巨噬细胞炎 症蛋白.,.均和慢性肺疾病有关。气道分泌物中.的浓度升 高与解脲脲原体气道定植发生的危险因素之一有关。支气管肺泡灌洗中文摘 要 液中、.、.、几.等抗炎细胞因子未分泌或不规则分泌可能导致肺 部炎症反应失控而持续存在,最终纤维组织增生而导致发生。但是也有一 些研究并未能证实上述结果:有研究显示支气管肺泡灌洗液及血中.、、 一的水平与的发生无相关性;还有实验发现患儿的中,. 等下调炎症因子与其他患儿相比无变化。 故哪些细胞因子确实参与了的发生,的急性期和非急性期起作用 或起关键作用的因子各有哪些,各因子之间关系如何,是否病程前后起作用 的 因子都一样,或只有急性期有细胞因子参与,患儿的外周血中这些细胞因子 是 否也发生了类似的变化,具体持续时间等等,仍需进一步探讨。国内外对于 细胞因子的研究大都着眼于肺部局部,对于患儿全身免疫状态的研究较少。 研究以动物实验居多,临床研究很少,且临床研究的样本量一般较少。患儿全 血细胞因子的研究很少。全身免疫是否参与的发病机制,不同阶段患 儿全身免疫状态如何,与肺部的局部免疫是否具有相关性,这些问题鲜见相 关 文献报道。 由于样本处理和检测方法的不同,细胞因子的检测结果差别很大,无固定 参考数值可用来比较。通过对个的或个别几个细胞因子的检测并不能反映细 胞因子相互作用的复杂网络,解决这个问题的关键是要有统一的样本处理方 法, 使用灵敏度高,且能同时检测多种因子的的检测仪器。液态悬浮芯片系统是 唯 一一种通过美国认证的芯片检测系统,可以满足快速、微量、同时检测多 种细胞因子的需要,降低检测误差。本研究将液态悬浮芯片技术应用于的 细胞因子检测,解决早产儿采血量少、检测指标多的矛盾,可同时检测全血中 的个细胞因子。 目的 通过研究早产儿慢性肺疾病全血中个细胞因子的表达,探讨全 身性免疫因素在慢性肺疾病中的可能作用,为寻求的新的治疗方法、指导 有针对性的免疫调节治疗在中的应用、改善患儿的预后提供可靠的理论依 硕士学位论文 据。 方法 、免疫刺激剂的选择刘占国等珠江医院免疫移植研究所的既往研究 表明,浓度/、刺激全血时,为最佳的全血细胞细胞因子分泌刺 激剂。因此我们选择作为刺激剂,浓度/,刺激时间为小时。 、研究对象的选择年月至年月,收集南方医科大学附属南 方医院、南方医科大学附属珠江医院、广州医学院第三附属医院、广州市儿 童 医院、广东省人民医院五家三甲医院新生科患儿为研究对象。纳入: 、早产儿;、胎龄体重无显著性差异;、住院满天;、根据天能 否脱离氧气分为两组:慢性肺疾病组不能脱氧和对照组不需要氧。排除 标准:先天性肺发育不良等原因造成的氧依耐予以排除。在时采集外周血标 本。取得患儿家属的同意后选择患儿未稀释的肝素化全血作为研究样本同 分离的单个核细胞以及稀释的全血样本相比,能更好的模拟全血细胞所处的 内 环境,更能反映体内的情况。我们一共收集到例标本,例为先天性肺发育 不良予以剔除,故供分析标本共例。其中慢性肺疾病组例,对照组例。 胎龄为周,体重为.,两组孕周及体重比较差异无统计学意义胎 龄..,.;体重一.,.。 、细胞因子检测方法的选择在细胞因子检测方面,单一细胞因子的检测 故传统的技术、蛋白质组学 并不能反映细胞因子相互作用的复杂网络, 技术等均无法满足我们的需求,液态悬浮蛋白芯片技术将流式检测与芯片技 术 结合在一起,可以一次检测一份样本中多达种细胞因子的水平,而且检测时 间短大概小时,可以满足我们全面快速分析全血中多种细胞因子的要求, 因此我们选择通过了美国认证的液态悬浮蛋白芯片技术作为细胞因子的检 测技术。 、统计学方法应用.统计软件进行统计学分析,偏态分布的组间 比较采用两个独立样本比较的秩和检验,所测数据以中位数、平均秩次 中文摘要 表示,.为差异有统计学意义;正态分布的数据组间比较采用方差齐的 检验,所测数据以又?表示;两组间性别分布比较采用’ 。以 .为检验标准。 结果 、慢性肺疾病组和对照组的一般情况 例标本中组人,其中男例,女例,~周的例, 周的例,的例,~的例,的例;对照 组例,其中男例,女例,周的例,周的例,的 例,~的例,的例。两组性别分布差异无统计学 意义.,组男性与女性比差异有统计学意义.。两组均 有相似的基础治疗:防治感染、改善微循环、补充微量元素、维持电解质和 酸 碱平衡、静脉营养支持等。不同之处:组到生后采血时仍需要氧疗, 对照组不需要。 、 慢性肺疾病组和对照组的个细胞因子水平 对慢性肺疾病组和对照组的个细胞因子.、.、.、.、、 一、一、、、.、.、.吖,.,..、硕士学位论文 组、、.、.、师吨的中位数及.、.的均数比对 照组高,、、.、、.、.、.的中位数比对照组 低。 结论 、患儿口.较对照组显著降低,我们推测其可能参与了的 发病过程,但具体机制尚不明确。 、全身免疫因素在慢性肺疾病的非急性期可能不起关键作用,研究慢性肺 疾病非急性期的全身性免疫机制的意义可能需要进一步商榷。 、、、、、 、?吖,,.可能 在全血中未分泌或分泌极少,这可能和早产儿的细胞免疫及体液免疫不成 熟, 分泌这些因子的能力相对不足有关。 , 、组.、.、几.、.、.、?、.的浓度有 比对照组高的趋势,、 、、吖、.、.、.的浓度有 比对照组低的趋势,但两组差异没有统计学意义,此结果是否与样本数量不 足 有关,有待进一步研究。 由于标本的难取得性,我们样本量偏小,所得结论的准确性可能需要进一 步考证。 关键词:细胞因子慢性肺疾病全血液态悬浮芯片技术 早产儿 硕士学位论文 ?一 : :. 宅 . .,,. ? , 、? . . .., , . ... , 也 , ” ” ,,一,. ?., ,,一,.埘 、几?、 . 一一. . 陀: 、?、; ”?” 一 , , . , , 铀呛 ,, ,, .硕士学位论文., :’., , .圮. 砌 , , ..,, .., 丽 . .., , , ?.., . 【 、/, . . /, 、 州? 、 、 ’ 、 :? : , .: . 硕士学位论文 卢?. 一.,., .,.. 、.., . ....、 . . ,. . 、析 ’ . .. 、 、析 : . . .~ , ,., ,~ :.~ , , . ,~ ,~ . ....硼舱 : , :, .谢 . 、 ;.,.,.,.,., .,.,.,.,.,.,., .,.,.,.,.,.,一.,.,. ,一.,.,.,.,..,一耳. .,.,一.,.,.,.,. .,?.,.,.,芦一.,.,.,吖.,.,.,盯.,三.,..伧 ? .,.,. 、、一、 、 .?、 . ? 吖’一, :一 一、、、吖、、一、、一、一、、 , 一、师吨 诵 .、 一 ,. 、. . . 、?、、一、一、一、?、吖、. ; ; ; :; 硕士学位论文 目 录 摘要 ?...??..??...??.??.??.?.?..?... 前 言?~ ?.?..??.?.??..?. 材料和方法。 结果? :口 木?: 讨论? 结论? 参考文献综述? 中英文对照缩略词表??一 硕士期间发表论文. 致射? 学位论文原创性声明?。 统计合格证明??硕士学位论文 前言 早产儿慢性肺疾病一般又叫支气管肺发育不良 ,,最早描述于年,发现需高体积分数氧和机械 通气支持的严重呼吸窘迫综合征的早产儿可发生一种慢性肺疾病:生后 仍 需用氧,胸片表现为囊泡形成,通气过度,伴肺不张,此为“经典”【】。目前一般 定义为生后天或胎龄不足周至矫正胎龄周仍需要持续用氧或机械通气 【】。虽然新生儿护理和治疗技术取得了相当大的进展,如表面活性物质替代治 疗、产前皮质类固醇激素的给予、通气技术改善等,但是可能由于极低出生体 重儿存活率的提高,早产儿慢性肺疾病的发生率并没有减少。国外目前报道在 出生妈周,体重, 的,名早产儿中,慢性肺疾病的发病率为%, 在所有新生儿中慢性肺疾病的发病率大概是.%。且是致残和死亡的重 要原因,故研究其发病机理是目前新生儿疾病研究的热点和难点。 是一个多因素疾病,一般认为与母亲患绒毛膜羊膜炎、宫内/出生后感 染、早产、男性、氧中毒及机械通气、动脉导管未闭、维生素、 缺乏、遗传易感性等因素有关,其发病机理及其复杂,目前研究认为炎症反应 是发病的关键环节【.,但尚有许多不明之处。细胞因子是参与肺内炎症反 应的主要介质,促进着的发生和发展,故细胞因子在发病机制中占有 重要地位【。细胞因子可由所有有核细胞产生,如白细胞、内皮细胞、上皮 细 胞、成纤维细胞、型肺泡上皮细胞等。针对各种刺激,细胞因子可调节免疫、 炎症、造血等功能。对于早产儿来说,各种刺激均可引起其全身及肺局部的 炎 症反应。常由绒毛膜羊膜炎对羊膜腔内的胎肺的炎症反应开始,在机械通 气、氧疗、出生后感染等因素作用下肺部炎症反应加重。早产儿出生后不久, 在机械通气等因素的刺激下,大量炎性细胞巨噬细胞中性粒细胞在肺内聚 集,中性粒细胞粘附于内皮组织,二者通过粘附分子相互作用,这使得大量中 性粒细胞和巨噬细胞渗透到特定的损伤部位,并释放细胞因子及其他信号分 子前言 放大炎症反应如氧自由基、蛋白水解酶等,造成肺组织损伤; 血管及肺组织完整性被破坏,这种不完整使肺组织试图修复、分 炎症反应协同作用,即产生我们在慢性肺疾病患儿或慢性肺疾病 的生化谱、症状及体征。目前我们仅在一定程度上了解了炎症是 基础上引起的,即可能是前炎症因子和抗炎因子失衡的结果【’】。大量研究 早产或高风险者的羊水、脐带血、血浆或气道分泌物中细胞因子的情 况,致力于确定这种状态下的生化谱。动物实验和临床研究证实,肺组织或支 气管肺泡灌洗液中的.、.、.、师.伍等前炎症因子早期呈 高水平并持续表达,发生于各种病因造成的了纠】。流行病学资料显示绒毛 膜羊膜炎与早产密切相关。母体存在绒毛膜羊膜炎的早产儿出生后立刻 抽取羊水厂脐血/支气管肺泡灌洗液,其.、.、.、.等细胞因子升高, 增加发生的风险,是预示早产儿肺产生不利结局的重要标记物‘。璐【 发现的早产儿在生后.天,甚至第天,其支气管肺泡灌洗液中几、. 含量已明显增高。这些因子的升高与氧疗及机械通气持续的时间呈正相关。 同 时发现,早期.升高预示早产儿对机械通气和氧疗的需求增加,一与. 比值升高也是早产儿发展为的风险因素。还有研究表明,患儿支气管 肺泡灌洗液中前炎症因子.、.、.、.等的水平明显升高,于生后 周内逐渐增加,接近周时达高峰,并持续存在,甚至达几周以上,且最终发展 为的患儿高于仁患儿【。有研究比较了不同的机械通气方式对第,, 天患儿血清细胞因子水平的影响,证明高频振荡通气较同步间歇指令通气更 能 减少血清前炎症细胞因子几.、.的生成,减少的发生【。有学者对支气 管肺泡灌洗液和血清中.与.在生后第天,天,~天,天, 天的水平进行了研究,结果显示只有在第天支气管肺泡灌沈液和血清中 .与.有显著相关性,其他时间点支气管肺泡灌洗液和血清中两因子无相 关性;氧浓度%和%两组间所有时间点的也.与.均无显著性差异。 .、一、、.又叫做抗炎细胞因子,能下调肺部炎症反应,但研究 硕士学位论文 显示慢性肺疾病患儿支气管肺泡分泌物中.、.、.未分泌或不规则分 泌,可能导致发生【。但是也有一些临床研究并未能证实上述结果:有研 究显示及血中.、.的水平与的发生无相关性,还有实验发现 患儿的中,.等下调炎症因子与其他患儿相比无变化‘捌。 由于的发病机制中仍有诸多疑问,目前的治疗仍然是棘手的问 题,进一步研究和阐明的发病机制,对于临床实行有针对性的治疗、早期 阻断炎症反应、改善预后,是十分必要的。 由于对细胞因子的研究有许多不确定的地方,很多研究尚处于探索阶段, 为了进一步明确究竟哪种细胞因子确实参与了的发生,各因子之间关系如 何,是否前后起作用的因子都一样等问题,本课题拟检测患儿全血免疫细胞因 子,以先进的液态悬浮芯片技术为主要技术手段,规避了新生儿尤其是早产儿 因其生理因素限制采血量少的缺点,可同时进行个细胞因子的检测。我们旨‘ 在比较相同胎龄体重下,慢性肺疾病患儿长期的氧疗与不需要依赖氧的早产儿 相比外周血中细胞因子有无改变,探讨全身性免疫因素在慢性肺疾病中的可 能 作用。材料和方法 材料和方法 选择合适的免疫刺激剂 细胞因子几乎可由所有有核细胞产生,如白细胞、内皮细胞、上皮细胞、 成纤维细胞、型肺泡上皮细胞等,它是免疫细胞功能的执行者和体现者,但 是静息状态下全血中细胞因子的水平很低,几乎无法检测到。研究表明,免疫 细胞经免疫刺激剂刺激后细胞因子会迅速大量分泌,并且细胞因子的分泌能力 可以反应免疫细胞的功能状态【。目前有多种免疫刺激剂可以选择:植物血凝 素、刀豆蛋白、脂多糖等。研究表明,、 、单用或者联用均可刺激细胞因子分泌,但是最合适的刺激剂。 它可以刺激种细胞因子分泌,并且在相同刺激浓度下,产生的细胞因子量最 多,并且平台值和峰值出现较早且稳定。浓度为/时已经使免疫细胞 充分活化,为合适刺激浓度。刺激外周血.时大多数细胞因子浓度达到了 平台值或峰值,小时后有些细胞因子浓度已开始出现下降趋势,故时为 合适培养时间刚。因此我们选择浓度/作为全血细胞的刺激剂, 刺激时间为时。 在样本选择上,我们选择未稀释全血作为样本,同分离的单个核细胞以及 稀释的全血样本相比,未稀释的全血更完整的保存了机体的原始状态,更准确 的模拟了机体的内环境状态,因此更能反映体内的情况【。。 在细胞因子检测技术方面,由于样本处理及检测方法不同,细胞因子的检 测结果差别较大,无固定参考数值可用来比较。另外,单一细胞因子的检测不 能反映细胞因子相互作用的复杂网络,亦不能准确反映机体免疫状态的整体 情 况。故要全面分析全血中多种细胞因子的水平,传统的技术、蛋白质组 学技术等均无法满足我们的需求。液态悬浮蛋白芯片技术将流式检测与芯片 技 术有机的结合在一起,以微球作为反应载体,更准确、快速、高效,该技术最 硕士学位论文 多可以检测一份样本中多达种细胞因子的水平网。而且该技术是通过美国 认证的临床检测技术,可用于临床检验使用,因此我们选择液态悬浮蛋白 芯片技术作为本实验的细胞因子的检测技术。 临床资料收集 我们在年月至年月期间,收集南方医科大学附属南方医院、 南方医科大学附属珠江医院、广州市儿童医院、广州医学院附属第三人民医 院、 广东省人民医院共家三甲医院的新生儿乖斗适合的患儿做临床研究。 患儿的基本资料:姓名、性别、年龄、体重、出生史、临床表现、辅助检查 线、、血气分析等、诊断、治疗等情况,并设计了资料收集表格。纳入标 准:、早产儿;、胎龄体重无显著性差异;、住院满天;、根据天能 否脱离氧气分为两组:慢性肺疾病组不能脱氧和对照组不需要氧。排 除标准:先天性肺发育不良等原因造成的氧依耐予以排除。在时采集外周 血标本。取得患儿家属的同意后选择患儿未稀释的肝素化全血作为研究样 本。我们一共收集到例标本,例为先天性肺发育不良予以剔除,故供分析 标本共例。其中慢性肺疾病组例,对照组例。胎龄为?周,体重为 ?,两组孕周及体重比较差异无统计学意义见表.。 表.两组胎龄、体重比较中位数 平均秩次 。组 。组 值 值 对照组鼍胞/霈 蝥 殂孕周. . .. . . . . . .. . 体重 材料和方法 诊断标准 :生后 仍需氧疗,或胎龄不足周至矫正胎龄周时仍需氧疗或机 械通气者【】。 先天性肺发育不良:先天性肺发育不全是由于胚胎期肺组织在发生发育过 程中出现障碍而引起的一种肺部畸形,可发生在两侧肺、一侧肺或肺叶。两 侧 肺不发育者或发育不全者不能存活。一侧肺发生者可分为三型:患侧支气管、 肺、血管系统完全缺如;患侧仅有支气管盲端发育不全的主支气管。无 肺组织和血管,即盲端支气管型;患侧主支气管及部分支气管形成,但支气 管、细支气管及肺泡少,支气管管腔小,肺组织发育不全,为原始结缔组织结 构或有囊肿形成。上述前两型为肺不发育 ,第三型为肺发育 不全: 。诊断主要依靠线或【】。 材料 .样本 符合入选标准的早产儿静脉肝素化全血。 .主要试剂见表. 表..主要试剂及生产厂家 .. 试剂名称 生产厂家 美国公司 双抗溶液 胎牛血清 美国公司 肝素 美国公司 美国公司 细胞因子溶液试剂盒 美国公司 细胞因子校正试剂盒 美国公司 细胞因子校验试剂盒 美国公司 硕士学位论文 美国公司 鞘液 血浆稀释液 美国公司 去离子水 珠江医院免疫移植研究所自制 上海新华化工厂 氢氧化钠 上海新华化工厂 磷酸氢二钠 上海新华化工厂 磷酸二氢钠 上海新华化工厂 磷酸二氢钾 上海新华化工厂 碳酸氢钠 .主要试剂配方见表. 表.试剂配方?. 质量 试剂 磷酸盐缓冲盐水.岣 . . . . . 去离子水 细胞培养液 . 包 干粉 . . 去离子水 配制 材料和方法 母液/ 冻干粉 溶液 作液./ 母液 溶液 .实验仪器与消耗器材见表. 表..实验仪器及生产厂家..屺 仪器名称 生产厂家 超净工作台 美国 公司 美国 二氧化碳孵箱 公司 微量高速离心机 美国 美国 台式高速大容量冷冻离心机 超纯水系统 美国 型微量振荡器 常州澳华仪器有限公司 江苏康健医疗用品有限公司 美国 公司 美国 意大利 美国公司 德国 德国赛多利斯股份公司 . 嘴 德国 公司 日本公司 硕士学位论文 纯水器 厦门 自动高压消毒锅 公司 干燥箱 美国 公司 液氮罐 公司 测定仪 梅特勒一托利多仪器上海有限公司 冰箱 广州万宝集团有限公司 塑料培养皿 江苏姜堰市新康医疗器械有限公司 .型微量振荡器 江苏姜堰市新康医疗器械有限公司 丹麦公司 多道微量移液器 孔板吸滤器 公司 紫外灯管 公司 孔板、培养瓶等 江苏姜堰市新康医疗器械有限公司 实验方法 .患儿静脉全血的采集一真空采血法静脉采血 准备好真空采血管肝素钠,填好标签。选择合适的静脉,消毒,穿 刺成功后,抽取患儿静脉全血,取下真空采血管,用干棉签按压针眼 处片刻。轻轻混匀全血和采血管中的肝素钠备用。 .全血培养 在无菌层流细胞间,超净台上用移液枪迅速将采集的肝素化全血加入 孔底培养板中, 每孔 ,向培养孔中加入刺激剂/的 ,混匀,?%培养箱内培养小时。 .样本收集 全血培养小时后,分别移入.管中,离心转/, 分钟,取上清,置于冰箱待检。 材料和方法 .细胞因子的检测 解冻:将收集的样本共个于室温下自然解冻。 稀释:用微量移液枪从管中取出血清样本加入含有 人血 清样本稀释液的新管中,使待测样本:稀释。 .滤板设计:选取孔滤板中的相应标本数目的孔作为检测孔,并标明 每孔的具体样本信息。 ,每孔 , 滤板预湿:向滤板选定的孔中加入分析液 封上贴膜,置于微量振荡器上低速振荡,振荡器转速为转/分,。 置于干净管中,并将管用 微球稀释:预先取 锡纸严密包裹,用微量移液枪取的微球.排入预先放有 的管中取微球前将含有微球的悬液在振荡器上中速振荡秒,避光、 混匀。 加样:将滤板从振荡器上取下,除去封膜,置于负压抽滤器上秒内 抽空滤孔中液体,向滤孔中加入稀释的微球,每孔 加入之前于振荡器 每孔洗涤两次,向滤 上再次中速振荡秒,抽滤,用 孔中加入稀释的样本,每孔加入之前用振荡器快速振荡管底部, 封上封膜,振荡分钟振荡开始时将振荡速度缓慢调至 转/分,并保 持此速度秒,之后再将振速调至转/分,并保持此振荡速度分钟。 .检测仪设置:打开悬浮芯片检测仪,预热机器,冲 洗管路,进行测试校准机器,设定检测,输入样本信息, 等待样本检测。 检测抗体稀释:预先取检测抗体稀释液置于干净管中,用 . 微量移液枪取 的检测抗体 排入预先放有检测抗体稀释液的 管中取检测抗体之前先将抗体快速离心秒,混匀。 加入检测抗体:从振荡器上取下滤板,除去封膜,置于负压抽滤器上 每孔,洗涤次,加入稀 秒钟内抽空滤孔中液体,用 硕士学位论文 释的检测抗体叫孔加入之前在振荡器上快速振荡,封上封膜,震荡 分钟振荡开始时将振荡速度缓慢调至转/分,并保持此速度秒,之 后再将振速调至转/分,并保持此振荡速度分钟。 置于干净管中, 稀释:预先取 并将管用锡纸严密包裹,用微量移液枪取的溶液 .排入预先放有 的管中取溶液之前先 将此溶液快速离心秒,避光,混匀。 加入溶液:从振荡器上取下滤板,除去封膜,置于负 压抽滤器上秒钟内抽空滤孔中液体, 每孔,洗涤次, 加入稀释的溶液 每孔加入之前在振荡器上快速震荡, 转份,并保 封上封膜,震荡分钟震荡开始时将振荡速度缓慢调至 持此速度秒,之后再将振速调至转/分,并保持此振荡速度分钟。 重悬:从振荡器上取下滤板,除去封膜,置于负压抽滤器上秒钟内 。:抽空滤孔中液体, 每孔,洗涤次,每孔加入 ,封上封膜,置于振荡器上 转/分,振荡秒,立即除去封膜, .。 置于液态芯片仪器,上机检测。 检测:液态芯片系统预先开机,经过 ,及 后 使用校下液,校正机器。机器通过校准后,输入标准品及样本信息,放入 检测板,检测读板。使用液态芯片仪附带软件,分析实验 数据,根据标准品的数值,拟合曲线,得出样本的细胞因子含量。 .统计分析方法 应用.统计软件进行统计学分析,偏态分布的组间比较采用两个独 立样本比较的秩和检验,所测数据以中位数、平均秩次表示,. 为差异有统计学意义;正态分布的数据组间比较采用方差齐的检验,所测数 据以?表示;两组间性别分布比较采用’ 。以.为检 验标准。结 果 结 果 、慢性肺疾病组和对照组的一般情况 我们一共收集标本例,例为先天性肺发育不良予以剔除。 男例,女例,周的例,周的例,的例, 的例,~的例;对照组例:男例,女例, 例,周的例,的例,的例,的 例。两组性别分布差异无统计学意义.,组男性与女性比差异 有统计学意义.。两组均有相似的基础治疗:防治感染、改善微循环、 补充微量元素、维持电解质和酸碱平衡、静脉营养支持等。不同之处:组 到生后天采血时仍需要氧疗,对照组不需要。 .慢性肺疾病组和对照组的个细胞因子水平 慢性肺疾病组和对照组的个细胞因子也. 、、、.、、 、 一、、 、 一、 一、、?吖、、、 .、.分别进行组间比较。结果提示:两组的.、.、、 .、.、.吖,.对刺激剂几乎无反应或反应较差。慢 性肺疾病组和对照组相比,两组除.外的个细胞因子水平差异均无统 计学意义,.。...,.,.,差异有统计学意义见 表.、。尽管个细胞因子无统计学上的差异,但是我们从分析数据仍 可以发现: 组.、.、、、.、的中位数比 对照组高,、 .、.、.、吖、 一、.、。的中位数比 对照组低。 表. 两组间.、.、、.、.、.、.、.、.、 .、吖、吨、.、.、.的检测结果 硕士学位论文、、.、、、一、、.、 口一 、、、、、一 表.两组问、的检测结果士 一 一 士 讨论 讨论 慢性肺疾病是早产儿,尤极低出生体重早产儿较常见的疾病之一, 是长期采用机械通气或氧气治疗早产儿严重心肺疾病后最常见的并发症,严 重 影响患儿的生存率和生活质量,为新生儿重症监护病房最为棘手的问题之 一。 由年首次提出,认为它是与应用机械通气及供给高氧有 关,需机械通气数周、数月、数年,更严重者死于心肺衰竭。典型的病理特征 是炎症和肺实质纤维化,线表现为肺囊性变的特异性过程。随着围产医学的 进步, 多年前描述的这种严重慢性肺疾病“经典”已很少见,取而 代之的是一种轻型慢性肺疾病又称为“新型”,其典型病理特征表现为: 肺泡和肺微血管发育不良或发育异常,炎症和纤维化并不明显【】。“新型” 常见于极不成熟儿,出生时仅有轻度或无肺部疾病,不需要给氧或仅需低浓 度 的氧。患儿在住院期间逐渐出现氧依赖,并且持续时间长,超过天,或胎龄 不足周者至纠正胎龄周仍不能脱氧。存活者容易反复发生肺部感染、肺 功能指标明显下降,有极高的致残及致死率,给家庭和社会带来沉重的精神 和 经济负担。因此,研究的发病机制,以便进一步给予针对性治疗、防止其 发生发展是有必要的。 的发病机制极其复杂,主要涉及早产、产前感染和产后炎症反应、氧 化应激及肺发育受阻等多个方面,但确切机制至今仍不明确。常由羊膜腔 内细菌等因素造成的胎肺的炎症反应开始,然后在机械通气、氧疗等因素的 作 用下肺部炎症反应加重【。目前认为细胞因子是参与肺内炎症反应的主要介 质, 促进着的发生发展。 细胞因子是由机体免疫细胞包括白细胞、上皮细胞等所分泌,根据细胞 因子作用的不同,可大致分为:、细胞免疫相关的细胞因子:.,一丫,., 一和.等;、体液免疫相关的细胞因子:, ., ., ., .等;、趋化因子:粒细胞集落刺激因子,。粒细胞巨噬 硕士学位论文 细胞刺激因子,单核细胞趋化蛋白,巨噬细胞炎症蛋白等。细胞免 疫相关细胞因子主要促进反应,抑制反应;而体液免疫相关细胞因子则 促进反应,抑制反应【,从而达到免疫状态的平衡。趋化因子在整个免 疫系统网络中亦扮演了重要的作用。可激活血管内皮细胞和淋巴细胞,增 强白细胞粘附性,并可活化细胞。气道分泌物中.浓度的升高可预示早产 儿对机械通气和氧疗的需求【。可激活血管内皮细胞,增强血管通透性, 诱发一氧化氮和基质金属蛋白酶但等的产生,有助于免疫球蛋白 和补体向感染灶聚集,也可促进吞噬细胞向组织间隙渗出。.值出现在炎症反 应的早期阶段,在肺结局不良的通气早产几的支气管肺泡液中升高【】。.可促 进细胞增殖分化和分泌抗体,并和.、吨一起作为内源性致热源参与炎症 反应,且一起诱导.反应蛋白和甘露聚糖结合凝集素参与非特异性免疫的识别。 .与一比率的升高也是的风险因素,尤在解脲脲原体移生者【】。趋化因 子分为四亚类,,.,其中有类和肺炎症性疾病有关 ,,。在宫内感染和氧疗/机械通气造成损伤的基础上发生炎症 级联反应,趋化因子在这个过程中起调节作用,表现为在发展为慢性肺疾病的婴 ,中趋化因子大量增加。几.可 儿的上皮细胞内衬液 纠,主要介导中性 诱导中性粒细胞分泌整合素,是研究的最多的趋化因子【 粒细胞迁移至感染灶,其在气管分泌物中的浓度升高先于中性粒细胞的浸润。慢 性肺疾病患儿气管分泌物中.的浓度在生后十天内都高于非慢性肺疾病婴儿 嗍。但是几。可能只是一般疾病严重性的标志而不仅仅在中升高。其他和 有关的趋化因子包括单核细胞趋化蛋白.,.,.,巨噬细胞炎症蛋 .,??。气道分泌物中.的浓度升高已被视作与解脲脲原体 的风险因素气道移生有关。其他形式的损伤如肺出血的风险因 素也可导致.,.,.的浓度升高【】。.可抑制细胞因子释放, 促进肺纤维化。肺损伤后.的产生上调,可通过减少前炎症细胞因子的产 生对肺提供保护作用。但是,其过度表达可能会刺激成纤维细胞和肺纤维化。 讨论 .过度表达刺激成纤维细胞和肺纤维化可能是严重的一个预示标记’ 。但也有相反研究表明.和蛋白在其母有绒毛膜羊膜炎的发展为 的婴儿细胞和液体中明显降低。.过度表达导致肺泡发育的减少 和肺泡腔的变大轻型的组织学特征及纤维化。.、.、.、,吨 通常被认为是炎性反应的上调因子,又叫做前炎症因子,而几、.、.、 .能下调肺部炎症反应,又叫做抗炎细胞因子。早产儿肺部可能此类细胞因子 缺乏或呈不规则分泌,致使肺部炎症反应失控或持续存在,导致发型。尽 管早产儿和足月儿有着相似的急性炎症反应期,但和足月儿不同的是早产儿 在生 后前天的气道分泌物中一般测不至.,可能因为早产儿巨噬细胞产生.的 能力相对不足【铝’。在发展为慢性肺疾病的早产儿的支气管肺泡灌洗液中 早 期升高,但是与未发展为慢性肺疾病的婴儿相比很快就下降了,并且可见?. 在 急性肺部疾病但未发展为的康复者中浓度大量增.。早产儿急性肺损伤时 气道抽吸物日和.的浓度无明显增加【。硕士学位论文 两者支气管肺泡灌洗液和血清中前炎症因子与. 在生后第天,~ 天,天,天,天水平,显示只有在第天支气管肺泡灌洗液 和血清中的.与.有显著相关性,其他时间点支气管肺泡灌洗液和血清 中两因子无相关性,氧浓度%和%两组间所有时间点的与.均 无显著性差异【。等报道血清前炎症因子的浓度和机械通气及氧疗持续 时间有关【。 由于的发病机制中仍有诸多疑问,故目前的治疗仍然是棘手的 问题,尚无理想的预防和治疗方法。一些实验性治疗,如.抗体、.抗 体、重组几.等,仍在探索阶段,与临床应用还有较大距离。所以,进一步 研究和阐明的发病机制,对于临床实行有针对性的治疗、早期阻断炎症反 应、改善预后,是十分必要的。 细胞因子是机体免疫系统功能的执行者和体现者,它参与免疫细胞的分化。 和增殖,传递免疫信号,在免疫细胞受到刺激后快速分泌,在同样的刺激条件 下,其分泌的速度和分泌量体现了免疫细胞的功能状态,因而检测全血免疫 细 胞的细胞因子,不仅反映了淋巴细胞的功能,还能够反映整个免疫系统网络 中 所有免疫细胞的的功能,理论上其结果能够很好的代表免疫系统的功能【】。 对住院满天的这名患儿分析发现,男婴较女婴更发生的几率大, 这和文献报道一致硎,但是我们的标本太少,实验对象选择没有差异性。两组 的、、一、、 、对刺 、、吖、 激剂无反应或反应差,可能说明这些因子在全血中未分泌或分泌极少,原因尚 不清楚,可能和早产儿的细胞免疫及体液免疫不成熟,分泌这些因子能力相对 不足有关。 组患儿巨噬细胞炎症蛋白.较对照组显著降低,我们推测其 可能参与了的发病过程,但具体机制尚不明确。口是一组多源的细胞因 子,具有广泛的生物活性,如参与炎症反应、免疫作用、抗肿瘤作用、造血功 能、促进损伤修复等【硎,其合成和分泌的异常与多种疾病有关,如关节炎、中 讨论 枢神经系统感染、呼吸系统的多种疾病、胃肠道疾病、生殖系统疾病、血液系 统疾病等。口可能会对某些疾病有利,如它可以募集白细胞至感染部位,有 助于病原微生物的清除在呼吸道合胞病毒引起的急性毛细支气管炎、新隐球 菌肺炎等疾病。但也可能对机体不利,会促进某些疾病的发展,如在有的疾 病中白细胞堆积可能释放毒性物如细菌性脑膜炎等【】。研究发现在某些刺 激下单核细胞、、细胞、细胞、树突细胞等均可分泌.,而几 等可抑制.的分泌。.是淋巴细胞强有力的趋化剂。实验证明. 能促进淋巴细胞粘附到血管细胞粘附分子.上,有助于淋巴细胞从血液中转 移到局部组织。有几组研究表明.可优先吸引特定的某些淋巴细胞亚群, 但是也有对立矛盾的研究。此外.在体内可趋化细胞及未成熟的 树突细胞【 】。目前对呼吸系统疾病的研究以.为多,.通过 对炎症细胞的化学趋化及活化作用参与炎症的全过程,但亦有研究表明其对 某 些呼吸系统疾病有利,如动物实验表明.募集白细胞至肺有利于控制病 毒负荷和临床结局【’。研究.的很少。 等研究表明.在 新生儿呼吸窘迫综合症患儿支气管肺泡灌洗液中升高和慢性肺疾病的 发生有关,并指出到生后天不能脱离氧气者.的浓度仍明显高于不需 要氧气者【】。我们的研究表明患儿外周血中的.较对照组明显减 少,与 等研究的肺部改变不一致。可能说明全血中细胞因子的改变不 一定会与肺部改变一致。也可能血中口. 过低导致肺部分泌过低,进一步导 致趋化淋巴细胞在肺局部的聚集过低,不利于炎症控制。我们推测可能和 .?在呼吸系统疾病中有利有弊的作用类似,.过低或过高都可能不 利于肺部疾病的改善。 大量研究表明早产儿慢性肺疾病急性期有显著的免疫反应,氧疗可引起肺 部持续的炎症反应。本研究显示除.外,需氧组和非依耐氧气组全身免疫 反应无明显差异。这说明全身性免疫因素可能在慢性肺疾病的非急性期不起 主 要作用,全身性免疫因素可能只是在急性期起关键作用。出现这种检测结果 还硕士学位论文 可能和以下原因有关:?、检测时间点:单个时间点检测,细胞因子变化受影 响的因素较多,波动范围很大,动态监测可能会有新的发现;?、病程的长短: 等,也有个别 本试验的研究点为出生后,而很多的研究在生后、或 研究的时间点跟本实验一样;?、研究对象不一样:有研究纳入研究的对象均 为,有的比较不同的通气方式或通气浓度下细胞因子的变化等; ?、样 本量大小:多中心,大样本的研究获得的数据更有说服力。由于该疾病的临床 标本来源少,进行更大样本量的研究有一定的困难。如果增加样本量,并在疾 病的早期监测细胞因子的变化,可能有助于更好的研究的发病机制;?、 标本来源不一样:大部分以动物实验为主,本研究采集早产儿外周血为样本, 国外报道较少。?、采用的检测手段不同:不同的实验技术可能敏感性不同, 细胞因子对任何条件变化都非常敏感,故可能会导致不同的结果。同时分析 数 据还可以看出,组.、.、.、.、?、.、...的一 浓度有比对照组高的趋势,、 、.、吖、 .、.、儿. 的浓度有比对照组低的趋势,故我们推测如果增大样本数量,可能能得出其 他’ 有显著差异的结果,如组的前炎症因子.、.、.显著高于对照 组,组的抗炎因子几.、、.显著低于对照组等和前人研究的肺部 表现一致等情况,当然也可能会没有改变或出现相反的结果。由于我们样本 量 偏小,所得出结论的准确性可能需要进一步考证。在诊断早产儿的这个时 间点上监测外周血细胞因子的变化其临床意义还需进一步研究。研究慢性肺疾 病非急性期的全身性免疫机制的意义可能需要进一步商榷。 检测单一时间点细胞因子的改变只是第一步尝试,要全面了解机体在慢性 肺疾病发病过程免疫状态的变化,还需要对于其他时间点如生后第,,,, 天等的全血细胞因子水平进行进一步研究。本研究的局限性在于未能对 发病急性期的全血细胞因子的水平进行检测,未动态监测这些因子在发生 发展中的变化,未与肺局部的细胞因子改变做对照研究。急性期全血细胞因子 是否在患儿中发生了根本性的改变,其变化如何需要进一步探讨。 结论 结论 在本研究中,我们可以看出,早产儿中男婴较女婴更易发生。在 的非急性期,.、.、、.、 .、.,吖,.,. 对刺激剂无反应或反应差,这些因子可能在全血中未分泌或分泌极少,可能和 早产儿的细胞免疫及体液免疫不成熟,分泌这些因子能力相对不足有关。 患儿的?.浓度较对照组显著降低,我们推测其可能参与了的发病过 程,但具体机制尚不明确。可能血中.过低导致肺部分泌过低,进一步致 趋化淋巴细胞在肺局部的聚集过低,不利于炎症控制。可能口.浓度过低或 过高都不利于肺部疾病的改善。也可能全血中细胞因子的改变不一定会与肺部 改变一致。全血个细胞因子中,除.外个细胞因子在慢性肺疾病的 非急性期都没有发生显著性的改变,全身性免疫因素可能在慢性肺疾病的非 急 性期不起主要作用,研究慢性肺疾病非急性期的全身性免疫机制的意义可能 需 要进一步商榷。但是组.、.、.、.、、.、吨 的浓度有比对照组高的趋势,.、、.、刀?、.、.、. 的浓度有比对照组低的趋势,故我们推测如果增大样本数量,可能能得出其 他 有显著差异的结果。同时由于标本的难取得性,我们样本量偏小,所得出结论 的准确性可能需要进一步考证。硕士学位论文 参考文献 、 . : 【】. ,:?. 、 . . .; :?. 、 . . .;:. 、 , , . “ ‘ . .;:. 、 , , ‘’ : . . ; :?. ‖ .. 蹴 、 :. .; .、八 .【 . ;:?. 姆 、 , .:. . ; : 、,., ? .阴 . ;:?