谈通脉丸溶出液中士的宁和马钱子碱的含量测定

谈通脉丸溶出液中士的宁和马钱子碱的含量测定 =“news_bd”> 通脉丸是河南中医学院第一附属医院的院内制剂，由附子、两头尖、当归、赤芍、制马钱子、甘草等11 味中药材组成。该方为本院国家级名老中医、中国中西医结合学会周围血管疾病专业委员会主任崔公让教授的临床经验处方，主治风寒湿痹、四肢痉挛、骨节疼痛、痈肿、动脉硬化闭塞性脉管炎等动脉缺血性疾病所致的寒凝脉络型脱疽。其中马钱子为马钱科植物马钱或云南马钱的干燥成熟种子，具有通络止痛、散结消肿的功效，现代研究运用马钱子治疗风湿性关节炎取得了显著疗效。马钱子的主要成分马钱子碱和士的宁，是马钱子的主要毒性成分，同时也是主要有效成分，占马钱子总生物碱的80%左右，人服用士的宁的中毒量为2 mg，致死量为30 , 100 mg，马钱子碱的毒性为士的宁的1 /30 , 1 /8。马钱子中士的宁毒性最强，且治疗量与中毒量非常接近，应对其投药量和用量严格控制。而该方中马钱子用量较大，存在一定的安全隐患，所以通脉丸的体内外释放研究对通脉丸新制剂的开发有重大的意义。 2010 年版《中华人民共和国药典》中以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈0. 01 molL - 1庚烷磺酸钠与0. 02 molL - 1 磷酸二氢钾等量混合溶液(用体积分数10%磷酸调节pH 值2. 8)(21?79)为流动相;检测波长为260 nm 的色谱条件来测定马钱子碱和士的宁的含量。本实验应用超高效液相色谱法对通脉丸溶出液中的马钱子碱和士的宁进行测定，检测方法由《中华人民共和国药典》方法改进而来，结合超高效液相色谱法性能特点，使得该法灵敏度高，重复性好，测定结果准确，样品处理简单，经方法学验证稳定可行。 1 实验材料 1. 1 仪器 ZRS-8C 智能溶出试验仪( 天津大学无线电厂)，超高效液相色谱仪(Waters)，Sartotius-CP225D 型电子天平(德国赛多利斯公司)，DT5-1 型低速台式离心机(北京时代北利离心机有限公司)，Neofuge1600R 型低温台式告诉离心机( 上海力申科学仪器有限公司)，摩尔智能超纯水器(重庆摩尔水处理设备公司)，KQ-100DE 型数控超声波清洗器(昆山超声仪器公司)。 1. 2 试药 通脉丸(制剂室提供，20141018)，马钱子碱对照品( 中国食品药品检定研究院，批号:110706-201306)，士的宁对照品(中国食品药品检定研究院，批号:110705-201307)，乙腈为色谱纯，其他为分析纯。 2 方法与结果 2. 1 溶出液处理方法溶出条件选择桨法，温度:(37 ± 0. 5) ?，离心速度100 rmin - 1，离心半径13. 5 cm。取3 mL 溶出开始后4 h 的溶出液为样品，置于10 mL 带盖离心管中，3000 rmin - 1 离心2min，取上清液1. 5 mL 置于2 mL 离心管中，15 000rmin - 1 高速离心20 min，离心2 次，取上清液测定。 2. 2 色谱条件Acquity UPLC BEH C18色谱柱(2. 1 mm × 100 mm，1. 7 μm)，流动相为乙腈-酸水(17?83)，酸水为浓度0. 02 molL - 1 磷酸二氢钾与浓度0. 014 8 molL - 1 庚烷磺酸钠等量混合溶液，并用体积分数10%磷酸调体系PH 至2. 8，流速为0. 3 mLmin - 1，检查波长260 nm，柱温30 ?，进样量5 μL。 2. 3 马钱子碱、士的宁对照品溶液配制精密称取马钱子碱对照品4. 64 mg，士的宁对照品4. 34 mg，分别用甲醇定容至50 mL 容量瓶中，配制成质量浓度92. 8 mgL - 1 的马钱子碱对照品储备液和质量浓度86. 8 mgL - 1 的士的宁对照品储备液。然后分别稀释不同倍数，得到马钱子碱对照品溶液质量浓度37. 12 mg L - 1，18. 56 mg L - 1，7. 424mgL - 1，3. 712 mgL - 1，士的宁对照品溶液质量浓度34. 72 mg L - 1，17. 36 mg L - 1，6. 944mgL - 1，3. 472 mgL - 1。 2. 4 专属性考察取相同溶出条件下的通脉丸溶出液及阴性样品溶出液，按照2. 1 项下处理方法进行处理，进样测定，结果表明，阴性样品在对照品出峰时间处均未有色谱峰出现，说明该方法的专属性好。 2. 5 线性关系考察取已知浓度的对照品溶液(马钱子碱质量浓度分别为37. 12 mgL - 1，18. 56mgL - 1，7. 424 mgL - 1，3. 712 mgL - 1;士的宁质量浓度34. 72 mgL - 1，17. 36 mgL 3. 472 mgL - 1)，分别进样1 μL，2 μL，测定峰面积，以浓度进- 1，6. 944mgL - 1， 样量为横坐标，峰面积Y 为纵坐标，得标准曲线。 2. 6 精密度实验取2. 3 项下的对照品溶液，连续进样5 次，每次2 μL，记录色谱峰面积，结果5 次连续进样的RSD 马钱子碱为1. 12%，士的宁为0. 84%，精密度良好。 2. 7 稳定性实验取2. 4 项下的供试品溶液，每间隔4 h 进样1 次，重复进样6 次，记录色谱峰面积，计算马钱子碱、士的宁色谱峰面积的RSD，马钱子碱为0. 69%，士的宁为1. 05%，样品在24 h 内稳定。 2. 8 重复性实验按照2. 1 项下的供试品制备方法，各制备6 份供试品溶液，测定，结果RSD1. 38%，结果表明此方法重复性良好。 2. 9 加样回收率考察精密吸取溶出液适量，分别精密加入对照品马钱子碱、士的宁对照品，按2. 1 项下制备方法制备加样回收样品，各平行操作6 份，分别测定计算含有量及回收率。 2. 10 溶出液含量测定取通脉丸样品，按2. 1 项下方法进行处理，分别进样5 μL，记录峰面积，分别计算马钱子碱和士的宁的含量，结果马钱子碱质量浓度为4. 652 gL - 1， 。3 讨论超高效液相色谱法是一种新型的基于小颗粒填料的士的宁质量浓度为5. 152gL - 1 分析色谱技术，它的管路内径比高效液相色谱法色谱柱的更细，色谱柱填料粒径只有1. 7 μm，从而增强了分析能力和灵敏度，缩短了分析时间，提高了高效液相色谱法系统的分离效率、方法稳定性和分析通量。传统高效液相色谱法用于中药指纹图谱研究时分析时间至少数十分钟，多则可达1. 5h。而采用超高效液相色谱法法，样品分析一般数分钟即可完成。在溶出度的测定中，待测样品较多时超高效液相色谱法的优点极大的体现出来，保证了样品测定的均一性与可靠性。Wang 等采用超高效液相色谱法法对大黄中5 种蒽醌衍生物进行分析测定，结果发现高效液相色谱法需要30 min 才能完成测定，超高效液相色谱法仅需3min 即可完成分离。陈佳等通过比对超高效液相色谱法与高效液相色谱法测定丹参药材中丹酚酸B 的含量，结果发现超高效液相色谱法能够替代高效液相色谱法测定丹参药材中丹酚酸B 含量，并得到较高的分析灵敏度，还加快了样品分析速度，减少有机溶剂的使用量。 超高效液相色谱法进样体积比较小，消耗也少，但是由于填充色谱柱的颗粒相对比较小，为了避免色谱柱阻塞，对样品就有更高的要求。超高效液相色谱法超高的分析速度提高了大批量样品的分析效率，而消耗时间较长的样品前处理环节将成为制约整个分析周期的重要因素，如何缩短样品前处理将是未来关注的方向。此外，从高效液相色谱法到超高效液相色谱法的方法转换中，还需要根据待测成分的理化性质来摸索合适的色谱方法。虽然超高效液相色谱法对色谱柱要求高、仪器昂贵，但随着填充和进样技术进步，超高效液相色谱法在药品分析和含量测定中将大有可为。 庚烷磺酸钠为离子对试剂，是高效液相色谱专用试剂，主要分析测试有机生物碱类离子化合物，对生物碱有较强的选择性保留作用，增大其浓度能够大大延长马钱子碱和士的宁的保留时间，通过调整离子对试剂的用量能够避免峰形叠加，改善所需色谱峰的峰形及分离度。另外，考察流动相中有机相的浓度对保留值的影响对改善被分析物的保留值和分离选择性是有必要的，在离子对试剂的色谱行为中流动相组成的变化亦是最重要的参数之一。高效 液相色谱法以大比例的甲醇作为流动相，而大比例的甲醇会升高超高效液相色谱法的柱压，所以使用低浓度甲醇有利于分离。 笔者通过多次实验发现，中药复方制剂的溶出液中成分复杂，尤其是中药味数较多的成方制剂，在色谱测定中很难达到理想的分离效果。据研究，在附子中生物碱成分很多，在实验时改变流动相中SDS 的浓度观察色谱峰保留时间的变化可以确定一些碱性成分，其保留时间随流动相中SDS 的浓度的增加而明显增加。马钱子中的马钱子碱和士的宁都是生物碱类成分，按照《中华人民共和国药典》方法，在反相色谱柱中分离，保留时间极短，几乎紧随溶剂峰流出，很难达到基线分离，所以在多次实验之后发现，当有机相比例从《中华人民共和国药典》规定的21%调整至17%，且将庚烷磺酸钠的浓度调整至0. 014 8 molL - 1 时，能得到理想的分离效果，且随着庚烷磺酸钠的浓度增大，保留因子K 值会不断增大，保留时间延长。 与《中华人民共和国药典》方法相比，此法在测定马钱子碱和士的宁的理论塔板数、拖尾因子和分离度均较好，因此选择该法为本实验测定方法。本法结合对马钱子成分体外释放的研究可以对处方中马钱子的毒性成分进行严格的限度限定，保障患者的用药安全。