CLASP1与PRC1的相互作用在中心纺锤体微管构架形成中的功能解析

CLASP1与PRC1的相互作用在中心纺锤体微管构架形成中的功能解析 中国科学技术大学 博士学位CLASP1与PRC1的相互作用在中心纺锤体微管构架形成中的功能 解析 姓名:刘菁 申请学位级别:博士 专业:分子与细胞生物学 指导教师:姚雪彪 20090501 摘要 摘要 细胞分裂时，染色体的分离由纺锤体微管协同动点完成。从纺锤体两极发出的极间微管发生重排，在分开移向两极的染色单体之间形成严密整齐的动态结构:中心纺锤体。中心纺锤体主要由两束稳定的反平行微管构架而成，其担负胞质分裂的启动和完成。参与中心纺锤体形成与维系的重要分子包括有丝分裂马达蛋白(,,,,,,; ,,,,,,,)，微管捆绑蛋白,,,,以及,,,,,, ,激酶复合物的参与。然而，,,,,在中心纺锤体组成过程中的确切功能及其相关蛋白质群还有待进一步研究。 根据,,,,在中心纺锤体组成过程中的作用，我试图解析,,,,功能蛋白质群的分子构成及其作用机制。我的工作揭示了,,,,与,,,,,,相互作用性及其作用域。,,,,,,属于一类调节中心纺锤体重叠微管束稳定性的保守蛋白家族。,,,,通过,，,,先于,,,,,,驶向中体微管相互作用，并将,,,,,,稳定定位到中心纺锤体。下调,,,,,,蛋白质的达会导致姐妹染色单体间染色体桥的产生和中心纺锤体微管发生解聚。为了测试,,,,,卜,,,,相互作用对中体微管可塑性的影响，我并制备了一个膜通透多肽，竞争性地抑制内源性,,,,,卜,,,,蛋白的相互作用。我的活细胞成像实验发现此多肽通过破坏,,,,,卜,,,,蛋白的相互作用影响染色体的精确分离，并导致染色体桥的产生。这些发现显示出,,,,,卜,,,,相互作用维系中体微管的可塑性及细胞分裂染色体稳定性。为此，我的研究揭示,,,,维系,,,,,,在中心纺锤体的定位并通过与,,,,,,的作用调控中体微管的可塑性。我认为,,,,,卜,,,,复合体负责稳定中心纺锤体微管和维系反平行微管的延伸。 关键词: ,,,,,,，,,,,，中心纺锤体，中期一后期转换 ,,,,,,;, , ,,,,,,, ,,,,,, ;,, ,,,,,,,,，;,,,,,,,,,, ,,伊,,,,,,, ,, ,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,;,,,, ,,,,,,,,, ,,;,,,,，,,,,, ,,,,, ,,, ,,,,,,,;,,,,(, ,,锄,,,; 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,,,,,,,)和微丝骨架组成的收缩环(;,,,,,;,,,, ,,,,)协同完成核分裂和胞质分裂。有丝分裂时，纺锤体运用微管纤维和多种有丝分裂马达蛋白将复制过的染色体组平均分配进分裂产物…子代细胞。胞质分裂是细胞分裂的最后一步，同时也是被科学家最早观察到的细胞周期事件。应用显微操作技术，在棘皮动物的胚胎中发现了胞质分裂这一过程(,,,,,,,,, ,,,,)。然而困难在于，胞质分裂无法用生化手段分析。近年来，利用简单易操作的模式动物进行胞质分裂的研究，得到了很大的进展。胞质分裂的位点首先被确定位于细胞赤道板附近，然后分裂沟(;,,,,,,,,,,,,,)在此位点开始装配，主要由,;,,,和,,,,,,组成的收缩环(;,,,,,;,,,,,,,,)形成;之后收缩环收缩，在两个子代细胞的细胞质之间形成一道膜屏障。这个过程中，中心纺锤体被收缩环压缩成中体(,,,,,,,)。最终，细胞发生切断，细胞膜封闭，两个完整的子代细胞形成。 由此可以了解纺锤体的主要作用即是分离姐妹染色单体到两个子代细胞。有丝分裂期和纺锤体相关的主要事件有两个:纺锤体的形态学发生以及介导染色体的运动。进入,,,,期后，微管形成一个双极导向的纺锤体结构，赤道板将这个结构分成两个“半纺锤体”(,,,, ,,,,,,,)。每个半纺锤体的微管负末端集中在纺锤体极上，并促使染色单体沿着微管射线从赤道板到纺锤体极的转运。从图,(,(,上，纺锤体看起来是晶体的、稳定的结构，而实际上它具有令人称奇的动态性。 组成纺锤体的微管纤维按形态分有四种类型:负责 连接动点和纺锤体极的动点微管(,,,,,,;,,,,州,,);来自两极交互成反平行结构从而稳定了纺锤体两极性的极间微管(,,,,,,,,,, ,,,);和染色体巯嗔 旧 謇 蛄郊 娜旧 灞畚?埽ǎ悖瑁颍铮恚铮螅锼瑁?,,,)以及从中心体向胞质放射以便在细胞皮层定位纺锤体的星极微管(,,,,,, ,,,)。在脊椎动物细胞中，纺锤体的组装呈现向两极扩展的趋势。动点微管首先被发现具有向两极流动的特点。到了中期，两极附近的微管负端持续地解聚同时赤道板附近的微管正端持续地聚合，以保证纺锤体维持一个不变的长度(图,(,(,)(,,,,,,,, ,, ,,(,,,,)。 , 第,章文献综述 图, , ,有丝分裂不同时期的纺锤体结构(标尺:,, ,,【, 一一尽 ,,一 一图,(,(,不同物种细胞的纺锤体结构僵,,,,,,, 一?一 ,,, 一,一 ,四, ,呻,)。红色标记微营，蓝色 标记肼，，绿色标记纺锤体极。 圉,,,,,幼锤体的动态性《?,,,叫,, ,】,,, 图注(,)动点微管;(,)极问微管;(,)星极微管;(,)微管的动力学不稳定性，红 色箭头表示收缩，绿色箭头表示生长:(,)两极向微管流动，黄色箭头;(;)染 色体运动;(,)马达蚩白驱动的反平行微管问的滑动:(,)依赖,,,,,,、负端 指向的馓管转运;(,)纺锤体极的定向运动 第,章文献综述 双极纺锤体的动态性表现在它的组装。纺锤体的组装有两种方式:第一种是中心体介导的组装途径，纺锤体微管的组装开始于在中心体处的成核(,,,,, ,,,,(,,,,)，这个假说由,,,,,,在,,,,年最先提出。在间期细胞中，微管通常从中心体发出到达细胞质各处;,期，,,,进行复制，中心体也复制;进入有丝分裂前期，复制后的中心体围绕着核开始组装两个放射状的微管结构;之后核膜破裂，中心体附近成核生成更多的微管纤维并迅速组装为伸向染色体的射线;星极微管捕获染色体上的动点，最终组装成双极定向的纺锤体(,,,,;,,,, ,,,,,,;,,,,, ,,,,:,,,, ,, ,,(,,,,)。在种类繁多的有丝分裂马达蛋白的协同作用下，比如:细胞质,,,,,,和负责微管滑动的马达分子协同作用使两个中心体分离;正端定向的马达蛋白和负端定向的马达蛋白在极间微管处产生相互对抗的作用力协助纺锤体的定位等。纺锤体的组装经过多个短暂的稳定态结构实现染色体的分离。每个稳定态都由几种或互补或对抗的马达蛋白提供力来维持一定的平衡。当组分中的马达蛋白活性发生变化从而打破平衡时，纺锤体的结构就会从一个稳定状态向下一个稳定状态转变。纺锤体的稳定状态这种说法最初在酵母的研究中提出(,,,, ,,, ,,,,,, ,,,,)之后被应用到果蝇胚胎细胞纺锤体极的分离 (,,,,, ,, ,,(,,,,)。有丝分裂时纺锤体的变化和染色体的运动并非由单个马达蛋白独立驱动，而是由多种马达蛋白协同作用使之从一个稳定状态过渡到另一个稳定状态;当由马达蛋白维持的平衡力被打破的时候就会促使下一个有丝分裂事件的发生。 第二种是染色体介导的组装途径，染色体在纺锤体组装中扮演重要角色，为纺锤体微管的成核和生长提供平台。微管纤维随机地分布在染色体周围互相交联，在具有双向马达活性的,,,,,,,的帮助下形成反平行微管束，然后正端定向的染色体驱动蛋白将微管纤维的正端定位到染色体附近，最后负端定向的马达蛋白(如,,,,,,等)交汇微管的负端形成纺锤体极(,,,,,,,, ,,, ,,,,,, ,,,,:,,,,,,,, ,, ,,(,,,,:,;,,,,, ,, ,,(,,,,)。从对爪蟾卵细胞(卵 母细胞分裂形成的纺锤体缺少纺锤体极和星极微管)的研究中得出结论:,,,和卵细胞提取物都加入的样本才能产生双极定向的纺锤体。有证据支持染色体可以在局部形成激酶一,,,—,,,酶浓度梯度和活性梯度从而修饰调节因子以促使微管射线生长，并由多种马达蛋白参与连接各部分的微管射线，这样缺少纺锤体极的情况下纺锤体也能组装而成;同时可以通过加入,减去促使微管解聚,稳定的因子来调节纺锤体的大小。在这个假说中，中心体依然影响纺锤体的定位但不再决定其双极性的建立。而实际上，这两种假说在不同方面不同程度地解释了不同物种的纺锤体组装机制。 功能蛋白质组显示线虫运用了其开放读码框的,,的基因编码细胞分裂所 , 第,章文献综述需要的蛋白质，包括肌动蛋白，微管蛋白，马达蛋白以及相关的蛋白质。,,,,年两组科学家分别了参与组装纺锤体的马达蛋白和非马达蛋白，归纳在表,(,(,和表,(,(,中(,,,,,,,, ,, ,,(,,,,:,,,,,,, ,,, ,,,,,,, ,,,,)。 微管纤维和微丝纤维分别是由,,股,,一微管蛋白异二聚体和,股,一肌动蛋白单体组成的直链，极向，线状的多聚体。这些多聚物通过在末端增加或减少单体得以延长和缩短并同时可以产生推力和拉力;它们也可作为马达蛋白运行的轨道，马达蛋白通过水解,,,来产生动力。在单分子水平，骨架蛋白产生,,。,,级别的牛顿力以及纳米级别的运动距离。在细胞分裂期间它们协同合作能够产生,,呻级别的牛顿力，并精确转运细胞内组分以及可以跨度,,微米地重排细胞表面区域(,;, ,,(,,,,)。参与有丝分裂的马达蛋白通过在指定区域产生,,,, ,, 力或者控制微管的动态性来参与微管的组装。按照定位和活动区域，马达蛋白有以下一种或几种功能:一、参与纺锤体极间反平行微管的形成与滑动，如:,,,;二、促使动点和从两极发出的微管连接，如:,,,,—,，,,,,,,;三、连接染色体臂和微管，协助染色体的定位以及稳定纺锤体结构，如:,,,,,;四、集中在纺锤体极以帮助纺锤体在胞质中的定位，如:,,,,,,;五、解聚动点一微管，如:,,,,。 纺锤体的组装除了需要马达蛋白的参与，还需要非马达蛋白。同样，按非马达蛋白的功能可以分为以下几类:一、协助微管成核和组织，如:,,,,,，,,,,，,锄,, ,，,,,,;二、调节纺锤体的形状和大小，如:,,,,，,,,,,,，,,,,,, ,;三、调节马达蛋白活性以及微管的动态性，如:,,,,;,,,，,,,,;四、调控染色体分离和细胞周期的进程，如:,,,，,,,,，,,,,,,。 , 第,章文献综述 表,,,参与纺锤体组装的马达蚩白(,,,,,,,, ,, ,, ,,,,) ; ; , 雾黪 器;甜?„?, 嚣静一, 将 ,荨?镕 ,。, ”隧, , ，习 蓉姑“, ;耄雾蠡 尊享一::堇量 黧善 ;誊, ”龋 ;,誊,, :霉尝 嚣(器?, 撼 蠼鬣 霪寥 溥 蒜‰, 嚣:甜, , 瓣 霉善, ?,, 斛, ;耄雾 遘?。 第,章文献综述 表,(,参与纺锤体组装的非马达蛋白(,,衄,,,锄, ,伽,,,, ,,,,) ，,,,?, ,,, ,,?;„?? ,,;一?,,, ,—,,,,, ,,,,,?，?—,,,(, ,,可,目,啪;口,妇 ,,,舶(，, ,口,,,,,口口山?? ,,?扛,;帕山,“,,?)一钾,叼—,,叼?,?“ ?脚, ,月枷(,,,,(?。,, ,,“?,,,? ,啦缸?帅砒曲?,瞳?(删,,蜘口一,,咖,“。?,,,,,,?, ??, (,??删???桷 ,,嘲(,,，??(呐?,州,?崎 忽譬一神”,椭 :慧怒一,,岫,,,。„岫址时曲砷,哺,瑚印,雾, 弋?,,,一 , ,‰ 勰:蒜品器嘲一眦, 嗍？,,,,(竹??，，,,,,，,,,),; ,,霄,,,?„坤??,,,,?一 ,,膏,?,精，??,如,,，, ,,,,??啊,,岫,,,—„?州棚,(哪,?,,?,,湘 ,科,??饼—,?昕峙,,,葺?,曲,,,,,„?,,:?,,岫—啊,州 ,?;叼,由??,??,, ,?曲(,,恤,，，,,,哪 ，,, ,岬啪(,,,幅,嘲 目口,,?,,,,，?„,,?,,?,, ,嘴,,?,,,曲妇,口,止,???枷?硼,,,,,帆,,嘲: ?,,?口,，?,自?,量 。,,?旧,，田 ,,憎,,,,(,,,帆?吨, ,『,幻,?,开?,辩(,,—,????,,一 ,自,隅,,蚍,,崎?，—:,?,,??,,—,?,,,—,,??憎 ???,口,?„一羹 ,,,帅憾琳(竹阳，,，，印,,?唧 ,爪—如,,?憎哪;,,却,?,, ,,，?:,艄如，,,庀,，—?,,呻„, 黼器垭勰一 „,(?，， ,口,出,,„,? „盹, ,,?刮?,?,„?????,如,,, ,,,，哺仰叩,,,？,,,(，;叼帅坤删,帅，邮狮?一 ?,?柏,,,,,,,叼?,，?, 仙,, ,?,,,,竹,,?，,, ,,,??甜,?,，, —,,,盼曲峨,,,，甘,岫协凼,呻,„『鼬?, ,,般 ,,,,,;? ,, 九(,(竹„，?,,”,,,峨,,，( 却,?出,,,(印,,,州州， , ,？,嘲,琳,,,士,,,,曲?州任—,曲啊”??口?,一,, .