【WORD论文原稿】幽门弹簧插入配合高盐热糊灌胃复制大鼠慢性萎缩性

【WORD论文原稿】幽门弹簧插入配合高盐热糊灌胃复制大鼠慢性萎缩性 免费查阅标准与论文 幽门弹簧插入配合高盐热糊灌胃复制大鼠慢性萎缩性 1 胃炎癌前病变模型形态学观察及早期细胞凋亡 11*22322张玉禄 ，李军祥 ，鲁香凤 ，戴欣 ，朱陵群 ，尹军祥 ，孙海芸 1 北京中医药大学东方医院消化内科，北京 (100078) 2 北京中医药大学东直门医院，北京 (100700) 3 北京中医药大学中医内科学教育部重点实验室，北京 (100700) E-mail:lijx970508@sohu.com摘 要:目的:研究幽门弹簧插入配合高盐热糊灌胃法复制 CAG 癌前病变大鼠形态学及早 期细胞凋亡特征。:采用幽门弹簧插入配合高盐热糊灌胃法复制 CAG 癌前病变模型， 用双标记流式细胞术分析 CAG 癌前病变大鼠细胞凋亡的特征。结果:光镜观察明 CAG癌前病变模型复制成功，CAG 癌前病变模型组大鼠早期凋亡率明显高于正常组(P<0.01)。 弹簧插入配合高盐热糊灌胃法成功复制 CAG 癌前病变大鼠模型, 细胞凋亡增强 结论:幽门 可能是 CAG 癌前病变的发病机理之一。 关键词:萎缩性胃炎，癌前病变，病理形态，流式细胞术，Annexin V，大鼠 慢性萎缩性胃炎(Chronic Atrophic Gastritis，CAG)是消化系统常见病、疑难病之一， 在 CAG 基础上伴发的肠上皮化生(Intestinal Metaplasia ，IM)和异型增生(Dispalsia ， [1]Dys)是胃癌前期病变。从胃癌 II 级预防的角度注重对 CAG 癌前病变转归的研究,特别是 建立类似人 CAG 癌前病变动物模型,在此基础上作干预阻断试验,寻找逆转癌变的方法,意义 [2]重大。按赵凤志等的方法复制大鼠 CAG 癌前病变模型，从早期细胞凋亡角度对疾病模型 进一步分析，提高对疾病模型的认识。 1 材料 1.1 实验动物 雄性 Wister 大鼠，体重 180,220g，清洁级，由北京维通利华实验动物技术有限公司提 供。实验动物许可证编号:SCXX(京)2002-0003。大鼠在相同条件下分笼饲养，每笼 5 只，常规喂养标准颗粒饲料，自由饮用水。 1.2 流式细胞仪及试剂 Annexin V-FITC 试剂盒(美国 BD 公司) ，碘化丙啶(PI)(美国 Sigma 公司)，Rnase A(美 国 Sigma 公司)。 1.3 动物实验技术条件 北京中医药大学东直门医院中药药理学实验室 II 级动物实验室，许可证号:SYXK 11-00-0029。 1.4 主要仪器 (1)TP-1000 电子天平，湘仪天平仪器厂。 (2)OLYMPUS B×51 显微镜，日本制造。 1本课得到国家自然科学基金项目(No(30572388)的资助。 - 1 - 免费查阅标准与论文 (3)LEIKA RM2135 石蜡切片机，LEIKA ASP300 脱水机，德国制造。 (4)流式细胞仪:FACScalibur, 美国 BD 公司制造。 2 方法 2.1 大鼠 CAG 癌前期病变模型的建立 [2]按赵凤志等的方法，将雄性 Wistar 大鼠(体重 230,260g)禁食不禁水 16 小时后，以 1.0,戊巴比妥腹腔注射麻醉(0.5ml,100g)，称重，固定大鼠四肢，在无菌条件下开腹，暴 露胃，在胃前壁距幽门环 0.2cm 无或少血管处切一小口，将一长约 2cm，直径约 0.2,0.3cm 的金属弹簧前 1/3 插过其幽门环进入十二指肠，用缝线将弹簧两端及中央固定，按手术常规 逐层缝合胃及腹壁切口。手术后禁食不禁水 24h，恢复性饲养 1 周后，开始每周每只大鼠灌 胃 60,70?高盐热淀粉糊 2 次(含 15,氯化钠)，每次 2ml，连续 24 周。并于造模结束前随 机抽取模型组大鼠 8 只进行胃粘膜病变理形态学检查，其中 7 只出现轻,中度不典型增生， 符合统计学要求，确认造模成功。 2.2 流式细胞术检测 2.2.1 单细胞悬液制备 模型组、正常组大鼠各 8 只， 10%水合氯醛麻醉大鼠后，剖腹取胃，漂洗干净后，于 3 胃窦部取米粒大小胃组织，剪碎成<1mm大小，用组织匀浆器研磨成细胞悬液，过 200 目 筛网，取滤液离心 1000 转/min，用 PBS 洗 2 遍，再过 300 目筛网，所得滤液即为单细胞悬 6 -1液。显微镜下细胞计数，调整细胞浓度 2×10ml，备用。 2.2.2 Annexin V/PI 法检测细胞早期凋亡 6 严格按说明书进行操作:取 1×10细胞用冷的 PBS 洗两次，悬浮于 100µl binding buffer， 加入 5 µl Annexin V- FITC 及 5 µl PI，混匀后室温避光染色 15 min，加入 400µl binding buffer， 1 小时内用流式细胞仪获取细胞并分析结果。 2.2.3 流式细胞仪分析 光源为 488 nm 氩离子激光器，FITC 受激发后发绿色荧光，PI 发红色荧光,以 CELLQuest 软件获取 10,000 个细胞并分析凋亡百分比,用 HP-Deskjet 1600CM 打印结果。Annexin V- FITC/ PI 双标记流式细胞术可以将实验样本中正常、机械损伤细胞、早期凋亡细胞和坏死细 胞区分开。以 Annexin V- FITC 和 PI 荧光作双参数散点图,可见细胞分为四个亚群:A: Annexin V- FITC -、PI-,代表正常细胞;B: Annexin V- FITC-、PI+代表机械机械损伤细胞;C: Annexin V- FITC+、PI -,为早期凋亡细胞;,: Annexin V- FITC+、PI +为坏死细胞。 3 结果 3.1 大鼠一般情况 模型组动物喜蜷卧，皮毛散乱无光泽，体重 559.38?38.92g，显著低于正常组体重 661.00?22.93g(P,0.01)。如表 1 - 2 - 免费查阅标准与论文 表 1:两组大鼠体重比较 例数(n) 大鼠体重(g) 8 正常组661.00?22.93 ?? 模型组8 559.38?38.92 ??: P<0.01(与正常组比较) 3.2 胃粘膜大体改变观察结果 (1)正常组:大鼠胃粘膜呈粉红色，有光泽，被覆较多粘液，粘膜皱襞表面光滑，走 向规则，胃壁弹性良好(图 A)。 (2)模型组:造模 24 周时，大鼠胃壁弹力减弱，粘膜层变薄，色苍白或紫暗，皱襞变 平或走向紊乱，有者粘膜表面黄染，部分大鼠胃粘膜糜烂充血或有溃疡形成。大部分在胃窦 部可见一至数个灰白色结节，质地偏硬(图 B)。 3.3 胃粘膜组织学改变光境观察结果 (1)正常组:大鼠胃粘膜上皮细胞排列整齐，无缺损或脱落，腺体形状规则，大小基 本一致，腺上皮细胞多呈单层排列，固有层偶见少许慢性炎细胞浸润。粘膜肌层平滑肌呈环 行排列，未见增生及向粘膜层深入现象(图 C)。 (2)模型组:大鼠出现多灶性萎缩性胃炎，表现为粘膜腺体减少，体积缩小，部分腺 体呈囊性扩张，固有层可见较多慢性炎症细胞浸润，部分有淋巴滤泡形成，毛细血管扩张淤 血，粘膜肌层增厚，结缔组织及平滑肌增生并向粘膜层萎缩的腺体间伸延。8 只大鼠中有 7 只伴有轻--中度不典型增生，表现为腺体大小、排列和形状不规则，出现共壁或“背靠背”现象，腺上皮细胞大小形状不一，核浆比增大，胞浆嗜碱性增强，分泌现象减少或消失，部分 细胞排列成多层或呈乳头状增生。(图 D,G)。 3.4 双标记流式细胞术检测结果 CAG 癌前病变模型组大鼠早期凋亡率明显高于正常组(P<0.01)，如下表 2: 表 2:两组大鼠早期细胞凋亡比较 例数(n)早期凋亡(%) 8 正常组2.22?2.26 ?? 模型组8 5.36?1.78 ??P<0.01(与正常组比较) 4 讨论 本模型复制的机理主要是由十二指肠液反流、金属弹簧、缝线的机械刺激及高渗盐和热损伤等综合作用的结果。模型的病变部位主要在胃窦部，十二指肠液反流及高渗盐和热损伤 等诱发原因又与人患胃癌的诱因相似，因此此模型可用于胃癌前期病变发生机理和防治作用 的研究。 [3]流行病学调查显示，长期高盐饮食可导致萎缩性胃炎，甚至胃癌的发生。动物实验也 [4]证实长期过热饮食可引起大鼠胃粘膜萎缩。热烫、高盐食物入胃后，可直接导致胃粘膜的 损伤，粘液屏障的破坏，当胃粘膜上皮反复发生损伤和再生修复时，有可能启动基因的突变 而发生癌变。高盐饮食可以升高胃肠渗透压，使其蠕动减慢、排空延迟，也间接促进了对有 - 3 - 免费查阅标准与论文 毒成分的吸收。因此，在胃癌及其癌前病变的发生过程中，烫热、高盐饮食是不容忽视的因素。采用将金属弹簧置入幽门环而导致幽门环持久性扩张，从而引起碱性肠液如胆汁等返流 入胃。研究表明，碱性肠液，特别是胆汁的反流与胃癌及其癌前病变的发生发展密切相关。 [5]Miwa 等通过手术造成 Wistar 大鼠不同反流模型后 50 周发现，胰十二指肠液反流组和假 手术组均无胃癌发生，而 2/8 的单纯胆汁反流组和 11/29 的混合反流组大鼠发生了胃癌，且 只在这两组动物中可见胃癌前病变存在，提示反流肠液中的胆汁是引发胃癌的成分，其他成 分可能起一定的促进作用。一方面，胆盐可使表皮细胞大量溶解，肥大细胞脱颗粒，提高胃 胺的水平，从而破坏胃黏液屏障和上皮细胞，促进致癌物质的吸收。另一方面， 粘膜内组织 [6]胆酸尚可激活蛋白激酶 C(protein kinase C，PKC)，可以影响与细胞形态密切相关的微丝组 [7]装蛋白的磷酸化，在细胞的恶性转化过程中起重要作用。 在本次造模过程当中，模型组 8 只大鼠中，7 只出现了轻,中度异型增生，符合统计学 要求，说明模型复制成功。 细胞凋亡是由自稳机制促发的细胞程序化死亡,受基因调控。细胞凋亡事件发生的时间 顺序一般依次为受体激活、线粒体功能减低、Caspase 家族激活、PS 暴露、DNA 断裂、形 态改变等。检测凋亡早期细胞膜磷脂酰丝氨酸(PS)暴露的方法,比检测 DNA 断裂或形态改 变更能反映凋亡的启动。因此,使用能特异性结合细胞膜 PS 的 Annexin V- FITC(共轭有荧 光色素染料异硫氰酸荧光素(FITC)的膜联蛋白?)作为探针,可以检测细胞早期凋亡,同时 利用碘化丙啶(PI)不能透过完整细胞膜的特点,可以使用 Annexin V- FITC/ PI 双标记流式细胞 术可以将实验样本中正常、机械损伤细胞、早期凋亡细胞和坏死细胞区分开。以 Annexin V- FITC 和 PI 荧光作双参数散点图,可见细胞分为四个亚群:A: Annexin V- FITC -、PI-,代表正常 细胞;B: Annexin V- FITC-、PI+代表机械机械损伤细胞;C: Annexin V- FITC+、PI -,为早期 凋亡细胞;,: Annexin V- FITC+、PI +为坏死细胞。。 胃粘膜癌变并非由正常细胞一跃而成为癌细胞，而是由正常胃粘膜细胞?浅表性胃炎? [8,9] 萎缩性胃炎?肠上皮化生?异型性增生?胃癌。研究发现 CAG 胃粘膜细胞凋亡增加， [10,11] 并认为此种变化与粘膜萎缩、肠化、不典型增生乃至癌变都有密切关系，有学者据此 [12]推测细胞调亡是胃癌演化进程中的早期事件。实验结果表明在造模过程中，由于金属弹 簧、高盐热糊及反流的胆汁和十二指肠液等致病因素的刺激下，大鼠胃粘膜从正常胃粘膜细 胞?浅表性胃炎?萎缩性胃炎?肠上皮化生?异型性增生，其早期凋亡率升高， CAG 癌前 病变模型组大鼠早期凋亡率明显高于正常组(P<0.01)，与文献报道一致。 经多年来有关胃癌前期病变的研究证明，此模型稳定、重复率高、节约成本。但是，在 造模过程中对手术操作者的手法要求较高，弹簧置入的位置恰到好处，如果过深进入到十二 指肠则达不到在胃窦部位造模的目的，如果进的过浅，则幽门环扩张不够不能达到十二指肠 液返流的目的;另外，因为胃酸、胆汁及热糊、高盐等刺激加之胃蠕动加速，易导致弹簧的 脱落，致局部病变很轻，造模失败。因此，造模时需注意这几点能有助于提高模型复制成功 率。用此动物模型进行科研的局限性表现在造模成功后胃内金属弹簧不能祛除，造模致病因 素异物刺激和胆汁反流这两个因素持续存在，这对药物干预对形态学改变及其它科研指示的 检测会产生一定的影响，需要今后进一步加以改进。 - 4 - 免费查阅标准与论文 参考文献 [1]陈灏珠(实用内科学(第 12 版，北京:人民卫生出版社，2005:1881-1882 [2]赵凤志,鲁香凤,戴欣,等.种水煎方剂对实验性慢性胃炎大鼠胃粘膜组织病理学变化及胃液 pH、胆酸含量 的影响.中国中药杂三志,1995,20(8):488,492 [3] Fox JG，Dangler CA，Taylor NS，King A，Koh TJ，Wang TC，High-salt diet induces gastric epithelial hyperplasia and parietal cell loss，and enhances Helicobacter pylori colonization in C57BL/6 mice，Cancer Res， 1999，59:4823-4828 [4] 张沥，张玲霞，徐俊荣，曹广周，张宁霞，江梅，贾长河(热水致萎缩性胃炎形成的实验(第四军医 大学学报，2003，24:1355-1355 [5] Miwa K，Fujimura T，Hasegawa H et al(Is bile or are pancreaticoduodenal secretions related togastric carcimogenesis in rats with ruflux through the pylorus? J Cancer Res Clin Oncol，1992，118(7):570- 74 5 [6] Huang XP，Fan XT，Desjeux JF et al( Bile acids，non-phrobol-estre-type tumor promotes ，stimulate the phosphorylation of protein kinase C substrates in human platelets and colon cell line HT29， Int J Cancer，1992， 52(3)440-450 [7] 管考梅，柳惠图，谢山海，等(蛋白激酶 C 活性的阻抑对人胃癌细胞 BGC-823 恶性表型的影响( 解 剖学报，1996，27(1):53-57 [8] Correa P.A human model of gastric carcinogenesis[J].CancerRes,1988,48(13):3554-3560 [9] 张荫昌.胃癌癌前病变研究的 30 年进展[J].中国肿瘤,2001,26(1):406-407. [10] Hiwa H，Endo K，Wada R，et a1(cellular proliferation and differentiation in rat atrophic gastric mucoSa indrced by N’-methy1-N ’-nitro-N-nit- dine[J](J Clin Gastroenterol，1997，25(Suppl 1):Sl16 [11] lsh da M，Gomyo Y，Tatebe S，et al，apoptosis in human gastric mucosa，chronic gastritis，dysplasia an d cal~ noma : analysis by terminal deoxynucleotidyl transferase ( mediated dUTP-biotin nick end hheling[J](Virchows Arch，1996，428(4(5):229 [12] LkedaM，ShomoriK，EndoK，et a1(Frequent occurrenceof apoptosis is an early event in the oncogenesis of human gastric carcinoma[J](Virehows Arch，1998，432(1):43 Observation of pathologic picture and analysis of early apoptosis of precancerous lesion of CAG rats replicated by methods of phlorus spring insertion and hot paste 11223Zhang Yulu，Li Junxiang，Lu Xiangfeng，Dai Xin，Zhu Lingqun， 22 Yin Junxiang，Sun Haiyun 1 Department of Gastroenterology，Dongfang hospital of Beijing University of TCM，Beijing (100078) 2 Dongzhimen hospital of Beijing University of TCM，Beijing (100700) 3 Key Laboratory of the Ministry of Education:Chinese Internal Medicine Laboratory，Beijing University of TCM，Beijing (100700) Abstract Objective: To study the feature of the Pathologic picture and early apoptosis of precancerous lesion of CAG rats replicated by methods of phlorus spring insertion and hot paste. Methods: Replicate the rats model by methods of phlorus spring insertion and hot paste, quantify the feature of the early apoptosis of precancerous lesion of chronic atrophic gastritis rats with Annexin V FITC/PI double labeled flow cytometry. Results: Pathologic picture show the rats model of precancerous lesion of CAG is convincing .The ratio of the early apoptosis of the model control group increases more significantly than normal group(P<0.01). Conclusions: It is convincing to replicate the rats model of precancerous lesion of CAG by methods of phlorus spring insertion and hot paste. Increasing the apoptosis may be one of the etiopathogenesis of precancerous lesion of CAG. ic gastritis;Precancerous Lesion;Pathologic picture;Flow Cytometry;AnnexinKeywords:Atroph V;rats 作者简介:张玉禄，男，在读博士生。 - 5 - 免费查阅标准与论文 附图: 图 1 大鼠胃大体标本及光镜病理图片 A: 正常大鼠胃大体标本; B: 模型组大鼠胃大体标本 C: 正常组 胃粘膜上皮细胞排列整齐，腺体形状规则 HE×100 D: 模型组 轻-中度不典型增生HE×200 E: 模型组 胃粘膜局部有炎症细胞侵润伴腺体增生和轻度肠上皮化生HE×100 F: 模型组 轻-中度不典型增生 HE×100 G: 模型组 萎缩性胃炎HE×100 003:正常组; 015:模型组 图2:流式细胞检测结果图片 - 6 -