中国人遗传性高铁血红蛋白血症NADH—细胞色素b5还原酶基因L …

中国人遗传性高铁血红蛋白血症NADH—细胞色素b5还原酶基因L … 中国人遗传性高铁血红蛋白血症NADH— 细胞色素b5还原酶基因L … 够{皤岔在脚剜 中华血蘸学杂志1998年4月第19卷第4期 t{s唧暨俘黼 差占 习妻嘎 中国人遗传性高铁血红蛋白血症 NADH一细胞色素b5还原酶基因L72P突变厶 吴玉水黄长晖朱忠勇王瑶唐玉钗郑培蒸,7 ,''', 一 ?'.?一 摘要目的:鉴定导致中国人遗传性高铁血红蛋白血症(RCM)的NADH一细胞色素b5还原酶(b5R) 基因突变类型,探讨RCM发病的分子基础.方法:逆转录一聚合酶链反应产物直接测序和cDNA克隆测 序分析先证者的b5R编码基因;限制性酶切分析其基因组DNA.结果:发现一例RCM患者b5R基固第 72密码子存在新的错义突变(CTC~CCC).结论:该突变导致b5R蛋白第72位亮氨酸被脯氨酸替换 (L72P)是该先证者致病的分子基础;进一步证实】型RCM患者的b5R基固突变多发生在近5端部分. 关键词遗传性高铁血红蛋白血症细胞色素b5还原酶聚合酶链反应基因突变 Leu72PromutationintheNADH_cyt0ch咖neb5reductasegenefoundinaChinesehereditarymethe— moglobinemtapatientWuYusAui'.? uangChanghui.ZhuZttoagyong.eta1.'CenterforMedicalLab— oratory,FuzhouMilitaryGeneralHospital,Fuzhou350001 AbstractObjective:T0characterizethemutationinNADHcytochromeb5reductasegeneinaChi— nesehereditarymethemoglobinemiapatienttandelucidatethemolecularbasisofthedisease.Methods: B5RgenefromaproposituswasanalyzedbysequencingtheRT— PCRproductsaswellascDNAclones; andtheresultswerefurtherconfirmedbyrestrictionenzymeanalysisofthegenomicDNAfragments.Re suits:Anovelmulalionwasfoundatcodon72ofbSRgenefromthepropo~kusConclusion}Replace— mentofLeuwithProatcodon72ofb5RgeneisthemolecularbasisofthepropositusIandthemutantal lelelocatedin5partofb5RgenemainlycausehereditarymethemoglobinemiatypeI. KeywordsHereditarymethemoglobinemiaCytochromeb5reductasePolymerasechain reactionGenemutation 人NADH一细胞色素b5还原酶(bsR15因 长31kb,含9个外显子和8个内含子;cDNA 长1974bp-.寻找和分析b5R的基因突变类 型,有助于研究该酶结构与功能的关系,从基因 水平探究常染色体隐性遗传性高铁血红蛋白血 症(RCM)的发病机制,并为建立RCM基因诊 断方法检测人群中的杂合子携带者,遗传咨询 和优生优育乃至基因治疗等提供必要条件.我 们用聚合酶链反应(PCR)相关技术及分子克隆 和序列测定,分析福州市郊县一RCM家系先 证者的b5R基因,发现了一个新的错义突变. 本课题曼垒军八五"重点课题基金:(159)ClO]资助 作者单位:350001南京军区福州总医院医学检验中心 (吴玉承,朱息勇,壬瑶,唐五钗,部培蒸1第二军医大学特子 遗传学开放实验室(黄长晖) 病例和方法 ? 1先证者女.3岁.足月产.发育正常.父母非近亲婚 配.出生后数月发现患儿颜面部发绀,尤以口唇为甚. 无明显诱因.其兄(5岁)亦有类似症状.无活动后蹲踞 现象.超声心动图和心肺各项检查未见异常.精神神经 系统检查未见异常;血气分析示低氧血症.Hegesh改 良法检测b5R活性为0.10U(正常对照2.30土 0.31U);高铁血红蛋白含量占全部血红蛋白的15. 血红蛋白分析未见异常.临床诊断:遗传性高铁血红蛋 白血症I型.入院后给予维生素C治疗,全身发绀明显 喊轻. 2主要试剂与仪器RNA提取试剂盒及DNA测序 试剂盒(Promage公司产品);反转录试剂盒(Gibco公 司产品),Taq酶(Sangon公司产品),7-P—ATP(北京 亚辉生物工程司产品),内切酶EeoRI,BamHI, Apa1和DNA分子量参照物败自华美公司:TDNA 连接酶赔自NewEnglandBiolab公司.PE2400DNA 196 扩增倥,荧光自动DNA序列分析仪(荑国PE公司产 品),手工测序装置(BiD—Pad公司产品). 3方法 3.1逆转录半巢式PCR:外周血白细胞总RNA的提 取和eDNA第一链的合成接各自试剂盒说明书进行. 自行设计扩增B5ReDNA全部编码序列(900bp)的外 弓f物(由San~on公司合成): Pl(上游) GGGAATCATGGGGG P2(下游) GGGGA 内引物 P3(下游)5GATGACCAGG P'(上游)5'GAGAA CG3 GCGC3 ACATCAAG3 以逆转录合成的eDNA(1.0td)为模板,先用外引物 P1/P2(各15pmo1),5.0mmoldinTP,2.5110×PCR 缓冲液,JUTaq聚合酶在25td反应体积中作PCR扩 增{反应结束后,取1.0#1产物分别甩引物P/P和P/ P.行半巢式PCR的第二轮扩增.两轮循环反应条件均 为:94?30秒,60C30秒,72C45秒,共30个循环最 终反应产物经普通琼脂糖凝腔电泳纯化回收. 3.2PCR产物直接测序:P和P末端标记-P ATP后,分别作铡序引物,对P-,P.半巢式扩增产物进 行手工测序(按说明书操作). 3.3PCR产物克隆测序:纯化回收后的引物P,P半 巢式PCR扩增产物及噬菌体载体MJ3mp18分别用 EcoRI,BamHI双酶切,用连接酶连接过夜(16"C). 常规氯化钙法转化太肠杆菌JMJ09.重组子鉴定,单链 抽提等接文献[-33方法.以正常人及先证者部分B5R eDNA阳性克隆的噬菌体单链为模板,荧光标记的 M13通用引物进行全自动DNA序列分析. 3.4基因组DA片段的扩增及限制性酶切分析为 进一步证实该突变的存在并建立简便的基固诊断方 法,常规方法提取患儿及正常人外周血白细胞基固组 DNA.扩增B5R第3,第4外显子的引物序列及扩增条 件参见文献[4]PCR产物经乙醇沉淀,洗涤后用Apa I酶切+8聚丙烯酰胺凝腔电泳分析. 结果 1PCR产物直接测序P/P半巢式扩增产 物(长338bp)测序结果显示,与正常人比较,先 证患儿Io5R第72密码子(位于外显子3)以脯 氨酸(CCC)替换了正常的亮氨酸(CTC)(见图 1). ChinJHemato].April1998,Vol19,No.4 正常人先证者 C CPro — C 与正常人h5R辅码基因比较,先证者基因的弟72憧面码干的 改变为CTC~CCC(结果所示为编码链) 围1h5ReDNA部分序列分析结果 2PCR产物克隆测序P/P半巢式扩增产 物(长81p)克隆后的测序结果证实,与正常 人b5RcDNA序列(结果未显示)比较,先证患 儿Io5R基因第72密码子存在CTC~CCC突 变,而第4外显子以及下游序列未见其它突变 (见图2). 700710"~720730 先证看垂的第72位密码于改耍为CT('~CCC (结果所示为反义链) 圈2先证者bSReDNA经半巢式PCR扩增的产韧克隆后 全自动序列分析结果 3限制性酶切分析用引物P/P扩增出长 ll201op的基因组DNA片段.由于第72密码子 突变后导致该位点产生一个ApaI酶切位点 (5GGGCCC3),使酶切片段改变(见图3). 正常为471+649bp;先证患儿为440,3l+ 6491op.确证先证患JLIo5R基因存在新的突变 (CTC—CCC). 中华血液学杂志I998年4月第l9卷第4期 A:正常对照IB:先证患儿;M分子量标记 田3限制性酶切分析bSR基因组DNA的PCR扩增片段 讨论 已报道的I型RCM的b5R基因突变均为 所,我们细 发生在外显子的错义突变】. 胞总RNA经逆转录合成cDNA,以此为模板 进行PCR扩增及序列分析,可迅速有效地检出 编码基因的突变. 迄今已发现13种不同的突变位点可导致 I型和l型RCM.国内仅我们报道过一种与 日本学者报道相同的突变类型-.RCMI型患 者b5R缺陷仅见于红细胞,临床现较轻, 全身发绀为主.?型患者全身细胞均存在b5R 缺陷;临床表现除发绀外,还有致死性的精神 发育迟缓及神经系统紊乱等].寻找和分析 b5R的基因突变类型,有助于揭示单一基因发 生的突变引起不同临床表型的分子机制.从目 前的研究结果看,I型RCM患者的b5R基因 突变位点大多近基因的5端(仅1例例外),而 ?型患者该基因突变位点大多近3端.前者导 致突变酶的稳定性降低;后者往往导致突变酶 的稳定性和催化活性都大大降低.我们的研 究结果也证实了这一结论.经对正常人和患儿 的b5R基因这一位点碱基序列的反复测定及 限制性酶切分析,排除正常多态性和PCR错配 的可能性,确证了患儿bsR基因存在第72密 码子(外显子3)的错义突变. bsR基因L72P(CTC~CCC)国内外均未 见报道.由于第72位亮氨酸在人,大鼠,牛等的 bsR中是保守的,提示它对b5R的功能和结构 有重要意义[.Chou和Fasman方法根据 eDNA序列推导的肽链结构一,该位点在b5R 二级结构中位于第二个片层区(第67至72 位).由于脯氨酸是亚氨基酸,不能在链内(间) 形成氢键稳定肽链空间结构,使得突变酶的 构象发生改变,导致酶稳定性降低.所.可以 推断第72密码子的改变是该先证者致病的分 子基础 参考文献 1TomatsuS,KobayashiY,FukumakiY.eta1.Theorganiza tionandthecompletenucLeotidesequenceofthehuman NADH—cytochromeb5reduetas~geneGene,1989,80} 353—961. 2YubisuiT,NaitohY.ZennoS.eta_-Molecularcloningof eDNAsofhumanfiverandplacentaNADH—cytochromeb5 reduc?e.ProcNatlAcadSc】USA,1987,8436093613 3J萨姆布鲁克,EF弗里奇,T曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指 南.第2版(金冬雁译).北京:科学出版杜,1993.918—233. 4KatsubeT,SakamotoN,KobayashiY,et.Exotdcpoint mutationsinNADH—cytochromebSreduetas~genesofho- mozygotesforhereditarymethemogIobinemia.types】and II;putadvemechanismsoftissuedependentenzymedefe— ciettcy.AmJHumGeaet,1991,48;799808 jV[eireLM,KaanJC,KahnA,eta1.Fournewmutations intheNADH-cytochromeb5rednctasegenefromp~tieo.ts withrecceasiveeongeaitalmethemoglobittemiatype? 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