碱性磷酸酶Km值测定碱性磷酸酶Km值测定
实验七 碱性磷酸酶Km值测定
本实验为实验考核【需在15:00左右结束】
几个需要加以注意的地方:移液管的规范操作、721型分光光度计的规范操作、化学反应充分混匀的重要性。
Km为米氏常数(Michaelis-Constant),是反应速度等于最大反应速度一半时底物的浓度【注意哟~Km是带单位的哟~,与浓度单位一致,即为: mol/L或mmol/L】 底物浓度与酶促反应速度的关系可用Michaelis-Menten方程式表示。
V max[S]
V= Km + [S]
底物浓度对反应速度的...
碱性磷酸酶Km值测定
实验七 碱性磷酸酶Km值测定
本实验为实验考核【需在15:00左右结束】
几个需要加以注意的地方:移液管的规范操作、721型分光光度计的规范操作、化学反应充分混匀的重要性。
Km为米氏常数(Michaelis-Constant),是反应速度等于最大反应速度一半时底物的浓度【注意哟~Km是带单位的哟~,与浓度单位一致,即为: mol/L或mmol/L】 底物浓度与酶促反应速度的关系可用Michaelis-Menten方程式表示。
V max[S]
V= Km + [S]
底物浓度对反应速度的影响
Michaelis-Menten方程两边取倒数即得:
1 Km+[S] 1 K m 1 1
= 或 = ? +
V Vmax[S] V V max [S] V max
此式为直线方程,以不同的底物浓度1,[S]为横坐标,以1,v为纵坐标,并将各点连成一直线,向纵轴方向延长,此线与横轴相交的负截距为–1,K m,由此可以正确求得该酶的Km值。
Lineweaver-Burk作图法
本实验以碱性磷酸酶为例,测定不同底物浓度的酶活性,再根据Lineweaver-Burk法作图计算其Km值。实验以磷酸苯二钠为底物,由碱性磷酸酶催化水解,生成游离酚和磷酸盐。
酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用,经铁氰化钾氧化,生成红色的醌衍生物,颜色深浅和反映了酶活性的大小,进而可以算出酶活性的大小。
【操作】
取8支试管,按下表依次加入试剂(用量:ml):
管 号 1 2 3 4 5 6 7 0.02mol/L底物液 0.05 0.10 0.20 0.40 0.60 0.80 0.00 pH10碳酸缓冲液 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90
蒸馏水 0.95 0.90 0.80 0.60 0.40 0.20 1.00
处理 混合后37?水浴,预温5min左右
酶 液 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10
处理 加入酶后立即混匀,37?水浴保温。从加入酶液起计时至
下一步加入碱性溶液停止反应,各管反应时间应准确一致,均
为15min
碱性溶液 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 4-氨基安替比林 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 铁氰化钾溶液 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00
处理 混匀,室温放置10min后,以7号管为空白液,于510nm
比色,记录各管的光吸收值() A510
A比色结果 510
A510值一份登记到老师的专用实验考核登记表上,一份交老师签名用于撰写实验
。
实验数据的处理
底物浓度mmol/L 0.50 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 0
1/[S] 2 1 0.5 0.25 0.167 0.125 0
1/A 510
【结果】以底物浓度的倒数1/[S]为横坐标,各管吸光值的倒数1/A510为纵坐标作图【坐标纸、铅笔作图】。根据-1/Km,计算出酶的Km值【带单位的哟~】。
【注意事项】1. 各试剂特别是底物液及酶量的取量要准确。2. 加入酶至加入碱性溶液的时间必须是准确的15min。
思考题:1、为什么不直接利用【S】-V(即底物浓度对反应速度的影响)曲线求Km呢 ? 2、试述km的意义及如何测定酶的Km。 3、反应温度、PH、时间对Km有影响吗, 4、碱性磷酸酶催化哪一类反应,针对不同的底物,其km值相同吗, 4、上网查阅别人做该实验时所得的结果。 5、碱性磷酸酶的临床意义。 6、国际酶学会将酶分成六大类,你认为碱性磷酸酶应划归为哪一类,为什么,
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