喜树碱高分子药物的合成以及细胞毒性的研究（可编辑）

喜树碱高分子药物的合成以及细胞毒性的研究（可编辑） 工 擎 . 喜树碱高分子药物的合成以及细胞毒性 研究 院 系:堡王堂院丝堂丕 专 业:直佥王丝堂皇物理 研究方向:生丝医旦直盆王挝抖 指导教师:金塞会副熬援 硕士研究生: 菹耐酋 年月完成 一 ?’ : ? ’ : 、’ : 塾皇也苎型 : . ....... : 堡磐竺堕 垒 尘竺丛塑丝【垒堕 : ’ : ? 》, 作 或 说 ;:矽,秽年【月必日 作者签名:盔星殛 华东师范大学学位论文著作权使用声明 《喜树碱高分子药物的合成以及细胞毒性研究》系本人在华东师范大学攻读学位 期间在导师指导下完成的砾妇博士请勾选学位论文,本论文的研究成果归华东师范 大学所有。本人同意华东师范大学根据相关规定保留和使用此学位论文,并向主管部门 和相关机构如国家图馆、中信所和“知网”送交学位论文的印刷版和电子版;允许学 位论文进入华东师范大学图书馆及数据库被查阅、借阅;同意学校将学位论文加入全国 博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索,将学位论文的标和摘要汇编出版,采 用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于请勾选 .经华东师范大学相关部门审查核定的“内部”或“涉密”学位论文幸, 于 年 月 日解密,解密后适用上述授权。 , ?.不保密,适用上述授权。 导师签名 本人签名盏壶毖 切护年月西日 “涉密”学位论文应是已经华东师范大学学位评定委员会办公室或保密委员会审定过的学位 论文需附获批的《华东师范大学研究生申请学位论文“涉密”审批表》方为有效,未经上 述部门审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的,默认为公开学位论文,均适用 上述授权。姓名 职称 单位 备注 谢美然 教授 华东师范大学 主席 张以群 教授 华东师范大学 委员 贺小华 副教授 华东师范大学 委员一论文摘要 日益受到人们的 成分作载体成为 合成的纳米粒或 定义为粒径小于 聚物或疏水改性 装成各种形态的 胶束。一般,自组装形成的纳米粒由亲水性的外壳和疏水性内核构成。其内核可 通过疏水性相互作用、静电作用和氢键等使疏水性药物、基因治疗药物或蛋白多 肽类增溶,从而提高生物利用度。其亲水性外壳与外界环境接触可有效防御生物 活性化合物的吸附,从而避免分解,在体循环过程中体现出长久的活性。本论文 主要是合成喜树碱类聚合物纳米药物胶束。主要研究喜树碱类聚合物纳米药 物胶束的载药量、水溶性、稳定性、药物的控制释放以及细胞毒性。具体内容如 下: 第一章绪论 近年来,聚合物纳米药物受到制药行业的特别关注。首先,聚合物纳米粒在 胃肠道内可以保护包裹的药物,因此相比其他胶束载体如脂质体较稳定。其 次,可以利用各种聚合物材料改变物理化学性能,药物释放性能,纳米粒的生 物 利用度。最后,纳米粒表面可以吸附或接枝某些分子,比如聚乙二醇, 聚氨酯和生物活性分子。而且,相比其他尺寸大的载体,聚合物纳米胶束亚微型 尺寸和较大的特殊表面,可以支持吸附。此外,聚合物纳米药物有助于增加药物 的药代动力学,具有直接应用于药物治疗的潜力,将是未来新药的设计方向与发 展趋势。?第三章水溶性喜树碱高分子药物的合成 “一锅法”实现环加成反应,合成水溶 我们应用催化反应, 性的聚合物一喜树碱纳米胶束。由于反应过程的高度可靠性、生成的产物有完全 的区域选择性、反应试剂与生理条件的相容性,催化的叠氮化合物和末端 炔形成,,】.三唑的,.二偶极环加成是一种特别强有力的纽带反应。在药 物开发方面,【,,.三唑产物不像传统的连接试剂,仅仅是被动的连接单元, 而是通过氢键和二偶极相互作用,与生物靶点产生了联系。 .., . , . , . , ., . , .. :. , , ., , , 一 ??????????????????????????一咖., ,啪,锄 甜 ,,., . 。/ : 亿 / : , 声.蝌....眦.. . . 、】 锄 .. 。: ‘‘” 钇 ,一 . , 佗? , , 嘲胁 ; ,, 肌嘟? ??目录 目 录?.?.?..?.?.?.:;.?.??.. 载本..?.?.?.?. 参考文献??。 第二章聚天冬氨酸衍生物喜树碱大分子药物的研究 .引言.实验部分一 ..试剂与纯化。 ..实验仪器.. ,.聚.羧基丁酸..天冬酰胺.喜树碱.的合成路线.. ...聚.天冬酰亚胺的合成? ..仉伊聚羧基丁酸..天冬酰胺的合成...促伊聚羧基丁酸.天冬酰胺一喜树 碱的合成?. .. .共聚物的药物载药量的测定。 .. ?共聚物胶束的制备?。 .. .聚合物的水溶性研究一 .. .聚合物的稳定性研究? .. .聚合物的控制释放实验??。 .. .聚合物的体外毒性试验??.. .结果与讨论??.. .. 、与.的结构表征? .. .共聚物的药物载药量的测定。 .. .共聚物胶束的研究?一 .. .共聚物的稳定性研究.. .. .共聚物的药物控制释放研究。 .. .共聚物的体外细胞毒性评价。 ..聚天冬氨酸衍生物分子量的表征.. ..三乙胺在聚天冬氨酸衍生物合成中的作用??.. .结论??: 参考文献??.. 第三章。?锅法刀合成水溶性喜树碱聚合物纳米胶柬的研究 .引言???目录 .实验部分. ..试剂与纯化.. ..实验仪器?一 ..聚乙二醇一,聚丙炔基一 一天冬酰胺一喜树碱?的 合成路线?. ...叠氮己酸的合成一 ...叠氮己酸.的合成? ..聚 .天冬酰亚胺的合成?.. .. .聚丙炔基.天冬酰胺的合成? ...“一锅法”合成水溶性的聚乙二醇,.聚.丙炔基.天冬酰胺.喜树碱纳 米药物..?..水溶性.黟.?聚合物胶束的制备以及的测试. ..水溶性..聚合物胶柬稳定性的研究..水溶性..纳米药物的控制释放试验. 结果与讨论??. .. ..聚合物的结构表征??. .. ..聚合物聚合物胶束??. .. ..聚合物纳米胶束的稳定性??. ..水溶性..纳米药物的控释释放性能研究 .结论参考文献附录:硕士在读期间科研成果 。?.. 致谢第一章绪论 第一章绪论 .聚合物纳米药物的研究进展 ..纳米药物的定义 纳米技术被视为世纪的关键高新技术之一,其中纳米生物技术是目前国际 生物技术领域的前沿和热点问题,在医药领域有着广泛的应用和明确的产业 化前 景。特别是高分子纳米药物载体、纳米生物传感器等将在疾病的诊断、治疗 和卫 生保健方面发挥重要作用。 的颗粒【?。而近年来这一概 纳米颗粒是指粒径为.~ 念已有所扩展,在纳米颗粒的定义中强调:纳米颗粒的合适尺寸在 形式上应适合生物技术的需要才是关键,而非限定于粒径.~ 。随着纳 米技术的迅速发展,其在生命科学、材料、化工等领域都发挥着日益重要的作用。 由此美国国家卫生研究院定义:在疾病治疗、诊断、监控以及生物系统 控制等方面应用纳米技术研制的药物称为纳米药物【。 ..纳米药物的特点 纳米药物所特有的性质,决定了其在药物和基因运输方面具有以下几个优 点:?可缓释药物,提高血药浓度,延长药物作用时间;?可减少药物降解,提 高药物稳定性;?可保护核苷酸,防止其被核酸酶降解;?可提高核苷酸转染效 率;?可建立新的给药途径【。 高分子纳米抗肿瘤药物延长了药物在肿瘤内的停留时间,减慢了肿瘤的生 长,而且纳米药物载体可以在肿瘤血管给药,减少了给药剂量和对其他器官的毒 副作用。纳米药物载体还可以增强药物对肿瘤的靶向异性。纳米高分子药物载体 另~个重要的作用是用于基因的输送,进行细胞的转染等。第一章绪论 ..高分子纳米药物的设计模型 聚合物体系在药物传递和基因载体方面的研究快速发展。近年来,药物与纳 米聚合物以共价键相联组成的治疗系统成为研究者们关注的热剧。其突出的优 点在于:.药物与聚合物以共价键连接,有利于实现定点、定时释放;.药物 连接到聚合物上后会呈现出生物惰性,因而在药物被释放前不会对人体产生伤 害,对病人的损伤较小;.多官能团聚合物还能隐蔽生物活性物质如蛋白质和 多肽等,使其在到达作用位点前保持生物活性;.聚合物所具有的效应 ,使其能够进入到疾病部位的血管或炎 症组织处而不影响正常组织,这样药物就有可能只在病患处释放,从而减少副作 用的发生。此外,纳米聚合物有助于增加药物的药代动力学,具有直接应用于药 物治疗的潜力,将是未来新药的设计方向与发展趋。 目前,聚合物药物主要有以下三种类型【】:.破坏细胞形成有效物质。.键 合二种或更多物质,在特定的细胞内,发生反应形成有效成份。.靶向载药体 系,通常包括三种成份:靶向链段、载体、有效成份。根据受体表达、配体内化 程度、选择抗体、抗体片段或非抗体配体以及配体间的键合力来判断载体有无靶 向性。因此,要发挥聚合物药物作用的关键问题是选择合适的聚合物和靶向链 段以及药物和高分子间的连接。 一般理想的聚合物药物模型主要包括:高分子骨架作为药物载体;一 种或者更多的药物成份;生物分子和多功能链结体的水解空间;造影基团 或靶向基团如图.。 黼 ,雕加咖咖材 图.高分子载体抗肿瘤药物的合成设计模型 . 绪论 米脂 细胞 长体 内循环时间等具有重要。纳米脂质体和胰岛素纳米脂质体。 .固体脂质体纳米粒 与以磷脂为主要成分的脂质体双层分子结构不同,固体脂质体纳米粒 是由多种类型材料如脂肪酸、脂肪醇及磷脂等形成的固体颗粒。性质稳定, 制备较简单,具有一定的缓释作用,主要适合于难溶性药物的包裹,用作静脉 注 射或局部给药。它可以作为靶向的定位和控释作用的载体。 .纳米囊和纳米球 纳米囊和纳米球主要是由聚乳酸、聚丙交酯一己交酯、壳聚糖、明胶等高分 子材料制备而成。可用包裹亲水性药物,也可包裹疏水性药物。根据材料的 性能, 适合于不同给药途径,如静脉注射的靶向作用、肌肉或皮下注射的缓控释作 用。 口服给药的纳米囊和纳米球也可用非降解性材料制备,如乙基纤维素、丙烯 酸树 脂等。 纳米粒子和纳米囊具有超微小体积,能穿过组织间隙并被细胞吸收,可通过 人体最细的毛细血管,且可通过血脑屏障。纳米控释给药系统的靶向作用原理主 要是:利用一般纳米粒的特性制成被动靶向制剂,实现肝脏靶向给药、基因输送、 肺部靶向给药;经过表面修饰制备主动靶向制剂,如抗体介导的主动靶向、受体 介导的主动靶向、长循环给药系统、前体药物主动靶向;物理化学靶向制剂,如 用外加磁场靶向、热敏靶向、酸敏靶向等。已经成功应用的靶向分子包括叶酸、 促黄体激素释放激素、磺胺、各种缩氨酸受体和多种直接结合于细胞表 面的单克隆抗体;它们在药物输送方面具有许多优越性:增强药物靶向作用。 可缓释药物,从而延长药物作用时间; 改变药物的透膜能力; 可提高 药物的稳定性,保护药物使其免受体内各种酶类的水解;提高药物的生物利第一章绪论 用度;可在保证药物作用的前提下,减少给药剂量,从而减轻或避免毒副反 应。 .聚合物胶囊 这是近几年正在发展的一类新型的纳米载体。有目标地合成水溶性嵌段共聚 物或接枝共聚物,使之同时具有亲水性基团和疏水性基团,在水中溶解后当自发 形成高分子胶束,从而完成对药物的增溶和包裹。因为其具有亲水外壳及疏水性 内核,适合于携带不同性质的药物,亲水性的外壳还具有“隐形”的特点。 ..高分子纳米胶束作为药物载体 胶束亦称胶团,是过量的表面活性剂在水中自组装形成的胶体溶 液。文献中常将胶束形成的过程称为“自组装”。聚合物纳米胶束是在平衡条件 下,两亲性聚合物在选择性溶剂中通过非共价键作用,如氢键、范德华力以及弱 的离子键作用,以自由能最小时状态最稳定为原则,自发地缔结成热力学稳定、 核一壳结构、性能特殊的纳米微粒。其内核可通过疏水性相互作用、静电作用和 氢键等使疏水性药物、基因治疗药物或蛋白多肽类增溶:从而提高生物利用度; 其亲水性外壳与外界环境接触可有效防御生物活性化合物的吸附,从而避免分 解,在体循环过程中体现出长久的活性。 聚合物纳米胶束具有小尺寸、靶向性和稳定释放等优点。其通常有较低的临 界胶束浓度 ,,表现为载药胶束在血流中稳定, 可延长循环时间。聚合物纳米胶束在制备过程中无需添加乳化剂、表面活性剂等 有机溶剂,可减小载体的毒性。通过温度、值、电场、磁场或酶的作用改变 聚合物的性质,能使产生主动或被动靶向性,从而影响药物在生物体内的分 布【】。聚合物纳米胶束有别于普通纳米粒的突出优点是对疏水性药物包封率高、 药物泄露少,且能够组成两亲性前药的完整个体。自组装技术简便易行,成本低, 无须特殊装置,通常以水为溶剂,具有沉积过程和膜结构分子级控制的优点,因 此具有很好的应用前景【】。 在治疗方面,聚合物纳米体系主要包括聚合物药物、聚合物一药物偶联体、 聚合物一蛋白质偶联体、连接药物的聚合物胶束以及聚合物一基因复合物等类 型。以聚合物为基础的治疗药物的粒径大多在几纳米到几百纳米之间,因此也有 第一章绪论 人称其为纳米药物。从分子水平上对聚合物进行设计和合成,通 过重塑结构使其治疗疾病,同时还具有生物响应性、特异性、靶向性等性能。其 中的聚合物组分,本身具有生物活性,或是作为治疗中的一个功能部分来促 进药 物、蛋白质或基因的传递。因此,以聚合物为基础的治疗药物,将会在癌症、肝 炎、肌肉硬化症及生长激素缺乏症等疑难或慢性疾病的治疗中发挥巨大作用,已 经成为生物医学研究中最活跃的领域之一。 .纳米控制系统 纳米级聚合物粒子作为药物传递和控释的载体,是一种新的药物控释体系, 纳米控释系统包括纳米粒子和纳米囊,是粒径在~ 之间的固状胶态粒子,活性组分可通过溶解、包裹作用而位于其内部,或 通过吸附、附着作用而位于其表面。纳米控释系统中药物的释放机制可以是药物 通过囊壁沥滤、渗透和扩散出来,也可以是由于基质本身的溶蚀而使其中的药物 释放出剩】。 纳米给药系统及其所用材料的性质,使其在靶向给药、缓释给药、 降低药物的毒副作用等方面表现出良好的应用前景。纳米给药系统中纳米粒子表 面的亲水性与亲脂性将影响其与调理蛋白吸附结合力的大小,从而影响吞噬细胞 对其吞噬速度的快慢。纳米粒子可以增加药物的溶解度,提供较大的比表面积链 接功能分子和高浓度的药物,这些为纳米粒子作为药物载体提供了理论依据。目 前常被用于药物载体的纳米粒子包括脂质体,脂肪乳,多肽载体及高分子聚合物 等,在这些纳米粒子表面通常都链接上靶向性分子如抗体或其它小分子来引导纳 米药物的运输,以起到减少药物的毒副作用,间接增强疗效的作用。纳米粒子的 选择及修饰,靶向性分子的确定应用和承载模式,药物、纳米粒子及靶向分子的 空间适配关系,纳米药物的生物相容性及其内体安全性是目前研究的热点和重 点。 纳米控释系统最重要的应用之一是用作抗肿瘤药物的输送。抗肿瘤类药物一 般用于对肿瘤的定位治疗及癌症手术后的化疗中。与常规药物相比,这类药物往 往具有较强的细胞毒性,对药物控制释放的要求更为严格。利用纳米技术进行恶 性肿瘤治疗可以有效的降低细胞毒性。其作用原理是:细胞活性的加强和肿瘤内第一章绪论 脉管系统的衰弱导致静脉内纳米粒子的聚集,静脉途径给予的纳米粒子在肿瘤内 输送,提高药物的利用效率,避免全身性的副作用,减少了给药剂量和毒性反应。 纳米粒膜材外连接亲水性高分子材料,使表面覆有亲水膜,从而使整个纳米粒系 统表现出血液循环中的循环特征可避免被吞噬。将抗肿瘤药物包裹在纳米粒子中 可延长药物在肿瘤内的存留时间,减慢肿瘤的生长,有研究报道与游离药物相比 纳米抗肿瘤药物抑瘤效果更好,延长了患肿瘤动物的存活时间。 等【】制备了同时载有两种不同溶解性药物的两亲嵌段共聚物,其中间 为亲水性内腔载有亲水性药物多柔比星,外周厚层疏水膜载有疏水性药物紫杉 醇,亲水段外壳可使共聚物逃避内皮系统的捕获,延长纳米粒在体内的循环时间, 该共聚物用于荷瘤鼠的疗效比分别使用两药提高了倍。掣】证明磁纳米 粒是靶向治疗肿瘤肿瘤的良好载体,高效液相色谱法分析结果显示肿瘤区的药物 浓度远高于身体其它部位,磁靶向治疗后肿瘤组织的抗癌药物浓度远远高于普通 化疗后的药物浓度。等【】研究发现,注射三苯氧胺聚氧乙烯一聚己内酰 胺.纳米粒子后,主要沉积在肝脏,随时间延长外周血、肿瘤组织药物 浓度,纳米粒子组比对照组均明显升高。 .聚天冬氨酸及其衍生物 。目 聚天冬氨酸及其衍生物,具有生物相容性和生物可降解性【 前,制备聚天冬氨酸的方法主要有两大类:.由天冬氨酸出发热缩聚合成聚天 冬氨酸【?踟;.从马来酸酐出发热缩聚合成聚天冬氨酸。 由于聚天冬氨酸在制备的过程中,中间产物聚天冬酰亚胺具有很高 的反应活性,能够很容易和伯胺基团反应,从而生成带有不同官能团的聚天 冬氨 酸衍生物。科学家对此十分感兴趣,合成了多种带有不同官能团,具有不同用 途 的聚天冬氨酸衍生物。 聚天冬氨酸衍生物制备出的两亲性聚合物在水溶液中可自发的形成核一壳 结构的胶束,并通过进一步的改性可以得到功能性胶束,所以在药物控释系 统的 领域具有广阔的应用前景,因此备受关注。 第一章绪论 .喜树碱在癌症治疗中的应用 喜树碱,是从我国内地特有的珙桐科旱莲植物喜树 的皮、果实中提取得到的一类色氨酸.萜烯生物 碱类抗癌药物,它对治疗多种恶性肿瘤具有显著疗效。喜树碱是通过作用于 来抑制复制、转录和有丝分裂【。其 拓扑异构酶 闭合的内酯环形式也即环是抑制肿瘤的有效成份,但在生理下,环位 羟基能与邻位的酯羰基形成分子内氢键,使环易于水解开环形成羧酸盐形式 而导致其活性大大降低【,又因其分子结构中喹啉环上氮的特殊碱性,水溶性 很 差.肛/【,从而阻碍了喜树碱在临床上的应用。目前已研发的可溶解的 喜树碱衍生物主要有拓扑替康【】、伊诺替康【】、.】 等。根据喜树碱分子内位羟基的特点,与含羧基的大分子发生酯化反应合成 ..烷基酯化物,这样可以有效阻止分子内氢键的形成从而抑制内酯环水解, 提高喜树碱内酯环的稳定性以及喜树碱的水溶性。例如:.等合成了 .【引。 .等通过喜树碱位羟基与发生酯 化反应合成.共聚物,来改变共聚物水解速率。目前,已有三类聚合 物喜树碱类衍生物用于临床试验。两种.共聚物类药】、普鲁替康 和以为载体的喜树碱前药【引。上述例子中,将喜树碱键合到聚合物上,都 会提高喜树碱的水溶性,并且因二聚水分子的结合或酶降解氨基酸可以控制 喜树 碱的释放。 .论文的研究意义及内容 喜树碱类抗癌药物有许多优点,如高效低毒、抗肿瘤谱广、副作用小,安全 可靠,与其它抗肿瘤药物无交叉耐药性等。但临床使用中也发现喜树碱的毒 副作 用较大,易出现呕吐、腹泻、骨髓抑制等副作用。因此寻找毒副作用小、抗 癌谱 广的喜树碱类似物的研究倍受人们的关注。日本、美国、英国和加拿大等国家投 入大量的人力、物力进行喜树碱类似物的研究和开发。人们以喜树碱为原料,通 过半合成的方法得到喜树碱类似物己达数百种,并从中筛选出了一系列抗癌活性 高、毒副作用低的喜树碱衍生物,成为世界抗肿瘤药物市场上的亮点。 第一章绪论 目前已应用于临床和正在进行临床试验的喜树碱类药物主要有.羟基喜树 碱,、拓扑替康、伊诺替康、 氨基喜树碱、、硝基喜树碱、、 一、.等。 我们期望研发新的聚合物载体,将喜树碱引入到新聚合物载体上,以此达到 提高喜树碱的水溶性、稳定性以及抗癌效果,同时降低喜树碱的毒副作用。 基于课题组的基础和研究需要,首先设计合成了聚天冬氨酸和聚天冬氨酸衍 生物,并通过红外光谱、核磁共振等对合成的化合物进行了系统 的表征。 在高分子药物的合成中,利用聚天冬氨酸及其衍生物的侧链羧基和喜树碱 位羟基的特点,得到高分子药物。并通过动态光散射仪、紫外光谱仪 、荧光光谱仪、透射电镜对高分子药物的结构以及表 面形态进行了深入研究。第一章绪论 参考文献 ? . 【】 . ..,, ., 】 .‘’ . , 卜. . , 【】 : ., ,. ./ 】 .: . . ., , ..】 .. .,,. , , 【 , ,..』. ,, 】 ,? . ,,. 】张阳德.纳米生物技术学【】.北京:群学岔缎硅,.. , , 】 , .?, :.., ,?. 【】高志贤,李小强.纳米生物医药【】.北京:纪?乙澎出版碰,..【】 , , , . , ? . ., , . . 】 , ,凡 ,,. .. , 】 . :一/ ., 第一章绪论 ,. 【 ,.,. ? / ..,,.. 【】王朝阳,任碧野,可生物降解材料的研究进展.高分子通报.,,.. ,., , ,,, . ,.. ., 【 ,.,,.,,.,,.,,.,,. 一 . ?. ,, .. 】.,,., ? ., .,,. .,,. 【】,. : ? . 一 .,,. . 】.,.,,. . . .,,? 【】,..,,.,,.,..,. .,,?. 】,..,,., .., ,.【,.,,.,,., ., : . ..,,? . .. .,,.., 一 :?, . 一....,,一 第一章绪论一, 【,.,,.,,., . , ., . ,【,.,,.,,.;,., .. :, ,. ., , ., ..,..,..,..? . .,,?. .,. 】 .., ., : .,,?. . ... ,.., ,.,,., ?. .,, . 】..,,.,,., 。 : . .,, 】. .第二章聚天冬氨酸衍生物喜树碱大分子的研究 第二章聚天冬氨酸衍生物喜树碱大分子药物的研究 摘要: 氨基丁酸在 胺混合溶剂中直接均相开环聚天冬酰亚胺,得到的。 中的羧基与喜树碱位羟基发生酯化反应,得到两亲性的.共聚物,再 通过自组装形成胶束。目的是提高喜树碱内酯环的稳定性以及喜树碱的最大 载药量、水溶性。 用核磁、红外来表征共聚物的结构,并用来表征此类喜树碱衍生物内酯环 的稳定性。观察其形貌。动态光散色测定其粒径及其多分散性。利用来分析 共聚物和在 .时,药物控释性能。并通过试验来评价 咿共聚物的毒性。结果表明,.共聚物能够通过自组装形成胶束, 心共聚物胶束的粒径随着载药量的增加而增大,但是水溶性逐渐变差。引入 大分子后还提高在中的稳定性,最大载药量可以达到.%,其水溶性与 相比也有所提高,并且形成胶柬后可以达到缓释控释的效果,细胞毒性比单 纯的游离喜树碱 略佳。 关键词;饵伊聚【一羧基丁酸三一天冬酰亚胺】,喜树碱,纳米胶束,毒性,稳定性,水溶性 .引言 喜树碱,是等在年从中国珙桐科植物喜树 中提取分离的生物碱。喜树碱是一类广谱抗癌药物,对 肺癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、宫颈癌、结肠癌、直肠癌、头颈部圆柱瘤型 癌、胃癌以及皮肤癌等都有抑制肿瘤细胞的作用【】。但因为其在生理条件下溶解 性差,稳定性不佳,毒性大等原因使其临床应用受到限制【’。研究发现,喜树 碱中六元内酯环是喜树碱类衍生物抑制肿瘤的有效成份【,,然而,内酯环对 值存在依赖性,在生理条件下,喜树碱环位羟基能与邻位的酯羰基形成分 子内氢键,使环易于水解开环,因此喜树碱在人体血浆中存在内酯环与羧酸 盐形式的平衡见图】。又因为羧酸盐形式与人血浆白蛋白结合能力是内酯环 第二章聚天冬氨酸衍生物喜树碱大分子的研究 形式的倍,致使平衡向羧酸盐形式方向位移,羧酸盐形式占%,导致血 液中内酯环形式的浓度远远低于羧酸盐形式,使药物抗肿瘤活性大大下降,并且 存在不良反应,如引起骨髓抑制、呕吐、腹泻和血尿等。 根据喜树碱分子内位羟基的特点,引入高分子载体等与之成酯,可以有效 阻止分子内氢键的形成从而抑制内酯环水解,提高其稳定性和水溶性,并具 有缓 释、控释作用外,还可以改变其在体内的分布,提高生物利用度,从而提高药 效。 目前,文献报道最多的是聚乙二醇 ,类【】大分子以各 种链接方式与喜树碱及其衍生物成酯。还有 . 聚羟甲基乙烯【】,聚丙基甲基丙烯酰胺 【】,聚谷氨酸 ?】 类高分子药物。令人值得兴奋的是,.共聚 物在体内治疗 和.肺癌细的效果优于游离的喜树碱。而 且,.共聚物提高了药物的药代动力学,对于细胞的“”效果而言, 增加了药物在癌细胞上的富集【】。 众所周知,癌细胞组织血管容量的孔径大约是一 ,大于正常组织 细胞 】。据报道,等研究普鲁兰.胆固醇共聚物能够自组装成粒 径为? 纳米胶束【州。因此,为了得到对癌细胞的被动靶向,期望研发粒 径大于 的聚合物一药物纳米胶束的喜树碱载药体系。本文中,利用.氨基丁 :的羧基进行酯化反 酸开环得至,然后通过喜树碱位羟基与 应得到两亲性的.共聚物,再通过自组装形成纳米胶束。最终, .纳米胶束提高在体内的水溶性和稳定性,进一步研究? 纳米胶束的抗癌活性和药代动力学。 .实验部分 ..试剂与纯化 试剂: .天冬氨酸.级国药集团上海试剂有限公司 .氨基丁酸第二章聚天冬氨酸衍生物喜树碱大分子的研究 双一氧代恶唑烷基次磷酰氯...级阿拉丁 一甲氨基毗啶..级 ??一一异丙基乙胺..级阿拉丁 ?二甲基甲酰胺..级国药集团上海试剂有限公司 三乙胺..级国药集团上海试剂有限公司 喜树碱纯度% 噻唑蓝硼 小牛血清培养基 小鼠成纤细胞中国生物细胞科学院 实验所用水均为双重蒸馏水。 纯化: .三乙胺:氢氧化钠干燥,减压蒸馏/. ,蒸馏后避光保存。 .??二甲基甲酰胺?:先用分子筛干燥,减压蒸馏。/. ..实验仪器 核磁共振波谱采用 型核磁共振波谱仪 ,内标 ,溶剂; 红外光谱采用 型红外光谱仪?压片: 型紫外分光光度计; 紫外光谱采用亚研 荧光光谱采用 .荧光光谱仪; 冷冻干燥采用博医康..型冷冻干燥机; 采用 动态光散射仪; 凝胶色谱; 采用 高效液相色谱; 采用 透析袋截留分子量,购自上海绿鸟。 第二章聚天冬氨酸衍生物喜树碱大分子的研究 .. ,.聚.羧基丁酸.天冬酰胺.喜树碱.的合成 路线 ...聚天冬酰亚胺的合成 聚?.天冬酰亚胺的合成根据文酬?。一般步骤,将 . 三.天冬氨酸溶解在含. %浓磷酸的环丁砜 中,在氮气保护 的条件下,油浴加热到?,反应 。反应结束后,将反应液过滤,。所得 溶液滴加到 冰冷水中,过滤收集沉淀,用蒸馏水、甲醇反复洗涤至滤液 呈中性,?真空干燥,得到白色粉末,产率为%。 聚天冬酰亚胺图.: ?凡詈 图. 的合成路线 . ... 聚羧基丁酸也天冬酰胺的合成 参照我们先前的研究报道【引,用.氨基丁酸开环聚?.天冬酰亚胺合 彳.氨基 . 成仅,声.聚羧基丁酸.天冬酰胺。将. 丁酸加入 三乙胺和 水的混合溶剂中,搅拌 后,加入. . ,继续搅拌反应 后,浓缩至 ,用 /盐酸调值至 .。用截留分子量的透析袋在室温下透析天,将透析液浓缩至 ,冷 冻干燥,得到黄色粉末,产率为%。第二章聚天冬氨酸衍生物喜树碱大分子的 研究 ? ,伊聚?羧基丁酸一天冬酰胺的合成路线图.: ? 图. 的合成路线 .聚羧基丁酸也天冬酰胺一喜树碱.的合成 通过喜树碱位羟基与的羧基发生酯化反应合成.。以 , ?的合成为例。将 .溶解在 中,加入 . , . 和 ,然后加热,温度控制在. . ,在室温下反应 ?,继续反应 。反应结束后,过滤,得到的滤液浓缩至约 ,滴加到无水乙醚中, 过滤,得到黄色粉末。待得到的粗产品完全溶解在 中,过.凝胶柱,以作流动相。过完柱子,浓缩至 ,滴加至 无水乙醚中重沉淀,过滤,得到的黄色粉末于。下真空干燥。产率为%。 根据与羧基的摩尔比,合成共聚物.,., .,.,.和.见表。 第二章聚天冬氨酸衍生物喜树碱大分子的研究 ,伊聚羧基丁酸一三一天冬酰胺喜树碱?的合成路线 图.: 专 正?. ?,瑾 图. ?的合成路线 ... 共聚物的药物载药量的测定 分析得到【】。利用在. 共聚物.中的载药量根据 一上的处特征峰的积分面积与.?. 中一 处特征峰的积分面积计算得到。 .. 共聚物胶束的制各 制备?聚合物胶束的过程如下:称取 ?共聚物,在 室温下,将其溶解在 丙酮溶液中。待其完全溶解后,加入 去离子水, 室温下强力搅拌 ,减压旋转蒸发除去丙酮,形成胶束粒子。将?共 聚物胶束肛滴加到镀有碳膜的铜网上,自然晾干后,使用透射电子显微镜 ,?观察拍照。并用动态光散射测定胶束的水合粒 径。 .. .聚合物的水溶性研究 溶解投入去离子水中,在。搅拌小 将?共聚物 时,用孔径为 , 滤膜过滤。滤液用分光光度计测定波长为 以溶液为参比,得到溶液浓度【。 第二章聚天冬氨酸衍生物喜树碱大分子的研究 .. 聚合物的稳定性研究 研究利用分光光度计分析?共聚物在,.时 内酯环的稳定性。根据等‘的研究,喜树碱有紫外吸收波长特征峰, 内酯环形式: ,的羧酸盐形式:. 。将? 共聚物 .的中,在下磁子搅拌 ,检 加入到 测。计算/的比值,用来评价?共聚物中的稳定性。 .. .聚合物的控制释放实验 参照等【】的研究方法,进行从聚合物胶束中的药物控制释放 试验。分别将 溶解在共聚物/.%和 . .和的混合溶液中/:,然后分别装入透 /, 析带中,置于盛 . /,.的离心管中,于 ?士.?下搅拌透析。每隔、、、、、、 取出. 透析液并 补充. 去离子水。样品用反相澳定其中的含量,结果以质量含 量表示。 .. .聚合物的体外毒性试验 收获处在对数生长期的小鼠成纤维细胞,悬浮于新鲜的 培养 基含有质量分数为%的小牛血清和%的双抗中,并接种于孔板中 个细胞/孔,于?和含有体积分数为%的空气环境下培养过夜。吸去培 养液,加入含有不同浓度,.,,,,, ./的? 后,加入 共聚物以及培养基旺,继续培养 噻唑兰,. 后,吸 。同样,在?,含有体积分数为%的空气环境下培养 去含有的培养基,加入此溶解甲躜晶体,用.酶标仪 波长处测定甲躜溶液的吸光度。细胞存活率通 ,美国于 过与空白对照组比较计算得出,结果以次实验的平均值和标准方差形式表 示。峰为主链中亚甲基信号峰峰,其次甲基的化学位移在. 处 峰。.氨基丁酸开环开环后得到,次甲基的化学位移从. 至 . 图.中的峰,信号为羧酸基团中羟基氢的化学位移. 。 谱中没有出现主链中次甲基在. 在的 处的信号峰, 说明完全开环,开环率达到了%。.氨基丁酸开环反应可发生在仅 位或‖位,由核磁谱图积分面积计算得位与声位开环比率为:.。 由此说明,相对于开环而言,该反应主要以‖开环为主。 由图.可以看到,化学位移. 处的羧酸基团中的羟基氢消失,说 明已经接上。比较.和的 谱,. ,,. ,,. ,,. ,,. ,. ,,. ,,. ,,. , . ,,. , ,,进一步证明已经接上。