【doc】早期妊娠猕猴孕激素水平的检测

【doc】早期妊娠猕猴孕激素水平的检测 早期妊娠猕猴孕激素水平的检测 4福建畜牧兽医第33卷第l期2011年 早期妊娠猕猴孕激素水平的检测 李志雄'范春梅'周建华刘琼珊'黄以兰, (1.福建省人口和生育科学技术研究所福州3500l3;2.福建中医药大学,福州 35Ol00) 摘要利用全自动化学发光免疫分析仪检测正常未妊娠的与不同孕期猕猴血清中 雌二醇及孕酮的分泌水平.结果表明孕5d, 10d,25d,30d血清孕酮比正常猕猴的分泌水平有非常明显的上升(P<O.01),孕 15d也有显着的上升<0.05);孕15d,20d的 雌二醇分泌水平比正常组有非常显着升高<0.o1),而孕5d,10d,25d,30d与正常组 比没有显着差异(P>O.05).) 关键词猕猴早期妊娠孕酮雌二醇 文献标识码:A文章编号:1003-4331(2011)ol—OOO4—02 DeterminationofProgesteronelevelsofearlypregnancyinmesusmonkey LiZhixiongFanChunmeiZhouJianhuaLiuQiongshanHuangyilan (1.FujianProvinceInstituteofPopulationandFamilyPlanning,Fuzhou350013; 2.FujianUniversityofTraditionalChineseMedicine,Fuzhou350100) AbmractTodeterminetheProgesteronelevelsbyAutomaticchemiluminescentimmunoassayinserumofnormalandpregnantmon. key.ResultsthatProgesteronelevelsofpregnant5d,10d,25d,30dinsenlmofmonkeysareverysignificantincreasedwithnormal group(P<0.01),andthatofpregnant15dhassignificantdifferenceswithnormalgroup<0.05);E2levelsofpregnant15d,20d hasaverysignificantincreasedwithnormalgroup<0.O1),whilethatofpregnant5d,10d,25d,30dhasnOsignificantdifference withnormalgroup(P>O.o5). KeywordsRhesusmonkey(Macacamulatta)EarIypregnancyProgesterone(P】 Estradiol(E2) 猕猴的组织结构,免疫,生理机能和代谢等方面 与人类高度相似.特别是雌性猕猴具有规则的月经 周期为28d,经量/体重比率,性激素周期性变化的 图型,一胎妊娠.分娩及哺乳过程等与人类极为接 近【1】,是人类生殖生理学,生殖健康,生命医学,新药 物研究临床前实验的理想动物模型,开展猕猴孕激 素的研究,对猕猴在性周期中排卵,胚胎着床与早期 胚胎发育等生殖方面的研究,具有科学意义. 1材料 1.1实验动物选用本所福州非人灵长类实验中心 所养的实验猕猴,进行单笼(60cmx60crux75cm) 饲养,每天二餐主食,二餐副食.在配种繁殖期间适 当增加饲料中蛋白质及维生素E的供应.实验猴的 质量条件与环境设施条件均符合普通级实验动物 (猴)国家标准要求(SYXK(闽)2005—0015). 1.2主要仪器设备贝克曼ACCESS全自动化学发 光免疫分析仪;OLYMPUS高级生物显微镜. 1.3试剂雌二醇,孕酮均购自贝克曼公司,试剂批 号分别为:915171,916210:质控品购自美国伯乐 基金项目:福建省自然科学基金项目(2oo9JOllO2),省属公益 类科研院所基本科研专项(2009t~10019—4),福建 省科技计划项目(2010L0001)资助. 作者简介:李志雄(1964-),高级畜牧师,从事非:人灵长类实 验动物养殖与动物实验研究工作. (批号:40222o 2方法 2.1实验动物的选择选择健康状况良好,有较高 配种能力,年龄6一l0岁,体壮,性器官发育良好.精 液常规检查正常的雄猴18只.选择月经周期正常, 健康状况良好,有正常生育史,年龄6,10岁,性皮 肤变化明显的雌猴65只. 2.2选择实验季节猕猴的繁殖季节为9月份至翌 年的4月份.选择繁殖季节作为实验时间. 2.3实验猕猴的配种在繁殖季节,先观察母猴第 1个月经周期(28_+3d),在其第2个月经周期的第 . 11d至第13d.把挑选好的体重相差不太大的雌猴 放入雄猴笼内进行交配,第2d早上观察雌猴外阴 口是否有阴道栓.用沾有生理盐水的棉签插入阴道 擦拭后镜检,检查精子活力情况. 2.4血清标本的采集在配种前,孕5d,10d,15d, 20d,25d,30d抽全血,37cI=恒温静置半小时, 3000r/min离心,收集血清,冷冻保存,待测定. 2.5早早孕诊断标准利用B超探测到实验猴的子 宫增大及胎囊的影像特征. 2.6孕酮,雌二醇激素分泌水平的测定 2.6.1血清中孕酮的化学发光酶免疫分析法Ac— cess化学发光仪的孕酮含量的检测.是一种竞争结 合的酶免疫检测.样品和兔抗孕酮抗体,孕酮一碱性 福建畜牧兽医第33卷第1期2011年5 磷酸酶酶结合物和包被了羊抗兔捕捉抗体的磁性颗 粒一起加入到反应管中,样品中的孕酮与孕酮一碱 性磷酸酶酶结合物竞争结合有限的特异性孕酮抗体 的结合位点,随后抗原一抗体复合物通过捕捉抗体 结合到磁性颗粒表面.而后,反应管被传送到磁性分 离区域进行多次冲洗.去除未和固相结合的其他成 分.最后在反应管中加人化学发光底物(Lumi— Phos*530).已与固相结合的碱性磷酸酶会使该底 物发出光子并被光电比色计所检测.而后,对照仪器 中储存的多点定标曲线中所描绘的光量子与标准品 孕酮的对应关系而计算出样品中的孕酮浓度,反应 产生的光子与样品中孕酮的含量成反比. 2.6.2血清雌二醇分泌水平的测定Access化学发 光仪雌二醇含量的检测.是一种使用了延时加入酶 结合物的竞争结合的酶免疫检测.样品和包被了羊 抗兔抗体:兔抗雌二醇捕捉抗体的磁性颗粒,以及含 蛋白的Tris缓冲液一起被加人到反应管中.20min 以后,加入雌二醇一碱性磷酸酶酶结合物.样品中的 雌二醇与雌二醇一碱性磷酸酶酶结合物竞争结合有 限的特异性雌二醇抗体的结合位点,最后抗原一抗 体复合物通过捕捉抗体结合到磁性颗粒表面.而后, 反应管被传送到磁性分离区域进行多次冲洗,去除 未和固相结合的其他成分.最后在反应管中加入化 学发光底物(Lumi—Phos*530),该反应所产生的光 子并被光电比色计所检测.光子的产量与样品中的 雌二醇的浓度呈反比.最后,对照仪器中储存的多点 定标曲线中所描绘的光量子与标准品雌二醇的对应 关系而计算出样品中的雌二醇浓度. 2.7统计方法用EXCEL2003软件进行数据处理, 计量资料采用组间t检验,差异性设为a<0.05.实验 数据采用均值?标准差(X?SD)表示. 3结果 3.1早早孕猕猴血液雌二醇的分泌水平雌二醇质 控结果:343(284,392),不同孕期(孕5d,10d, 15d,20d,25d,30d)血清雌二醇检测结果见表1. 表1雌二醇检测结果(n=12,X~SD)pg/mL 组别E, 正常 孕5d 孕10d 孕15d 孕2Od 孕25d 孕30d 注:表中标"?''表示与正常组比较,差异显着(P<O.05); "??"表示与正常组比较.差异非常显着(|P<0.O1). 3.2早早孕猕猴血液孕酮的分泌水平孕酮质控结 果:8.99(7.75,10.7),不同孕期(孕5d,10d,15d, 20d,25d,30d)实验猴血清孕酮检测结果见表2. 表2孕酮检测结果(n=l2,X_-~SD)ng/mL 组别P 注:表中标"?''表示与正常组比较.差异显着(P<O.05); "??,,表示与正常组比较,差异非常显着(P<0.O1). 4结果分析 1)在猕猴的妊娠早期,孕酮的分泌水平增加较 快,孕前孕酮水平为1.92+1.56ng/mL,与王训立团, 张惠云等【3J利用放射免疫测定法的数值接近;随着孕 期的增加,孕酮的分泌水平增加,在孕10d有一个 小高峰(6.04_+4.60ng/mL),而后下降,孕20d后又 开始回升,继续上升至孕30d(7.7~6.30ng/mL).孕 30d后的分泌水平.有待进一步研究. 2)正常未妊娠猕猴血清中雌二醇时的水平为 96.1+52.6pg/mL,接近于张惠云等【3】利用放射免疫 测定法的数值;随着孕期的增加其含量不断增加,在 孕20d达到一个高峰值(359.3~239.7pg/mL),而后 缓慢下降,降至孕30d的水平(122.7_+72.3pedmL). 3)因实验猕猴个体的差异,血清中所测定的孕 酮和雌二醇水平有较大的差异.作为辅助的实验室 检查诊断指标,需要多测2,3个点. 4)研究孕激素与雌激素的分泌水平,对调节月 经,助孕的机理,子宫内膜腺体及血管变化,受精卵 着床,子宫出血,流产等研究有借鉴意义. 参考文献: 【1】魏振年.猕猴的生殖生理及科研应用U丁.动物学杂志, 1988,23(6):46-50. [2】王训立.恒河猴血清孕酮含量测定方法【『】.2008,18(7):56— 59. 【3】张惠云,乔明奇,陈雨振,等.正常猕猴性周期相关指标的检 测.中药药理与临床,2002,18(2):46—48. *宕*一*.一一一,,一, 1 ddddd 译5m:2加如?孕孕孕孕孕孕 69J霄卜3一一一一一一一一一一一一一一