【doc】纳豆激酶原核表达载体的构建及其活性鉴定

【doc】纳豆激酶原核达载体的构建及其活性鉴定 纳豆激酶原核表达载体的构建及其活性鉴 定 应用与环境生物2007,13(3):369,372 ChinJApplEnvironBiol=ISSN1006-687X2007-06-25 纳豆激酶原核表达载体的构建及其活性鉴定 童煜陈守春2张思仲 (四川大学华西医院医学遗传研究室,成都地奥制药集团有限公司成都610041) 摘要利用引物搭桥的方法,经PCR扩增,获得了纳豆激酶成熟肽基因(NK),从而构建了大肠杆菌表达质粒NK/ pTWIN1,NK/PET32a及NK/PML—c2x,经分别转化宿主菌ER2566,BL21和ER2566,获得了转纳豆激酶基因重组菌. 结果表明,NK/pTWIN1一ER2566和NK/PET32a—BL21的纳豆激酶蛋白表达量较高.本研究选用NK/pTWIN1ER2566 作为表达菌株,对其进行发酵表达.SDS—PAGE显示,目的蛋白约占菌体总蛋白的36%,该蛋白是以包涵体形式存在 的.包涵体经收集,蛋白变性及复性,并经过SPSepharose分离纯化,得到了纯化的纳豆激酶蛋白,琼脂糖一纤维蛋白平 板法测出1mg纳豆激酶干粉的溶栓活性相当于600u尿激酶.本文从基因角度研究纳豆激酶基因的克隆,表达及 纯化,为利用基因工程菌生产纳豆激酶奠定了基础.图5表1参11 关键词纳豆激酶;克隆;表达;纯化;活性测定 CLCQ78 ExpressionandPurificationofNattokinaseinE.coli TONGYu.CHENShouchun&ZHANGSizhong (DepartmentofMedicalGenetics,WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu6100 41,China) (DidoPharmaceuticalGroupCo.,Ltd.,Chengdu610041,China) AbstractNattokinasegenewasamplifiedusingoverlappingpolymerasechainreaction(PCR),andclonedintopTWIN1, PET32aandPML— c2xvectors.TheexpressionplasmidsofNK/pTWIN1,NK/PET32aandNK/PML— c2xwereconstructedand usedtotransformE.coli.TheresultsshowedthatthelevelofthenattokinaseproteinwasalittlehigherinE.colitransformed byNK/1wIN1andNK/PET32a.Nattokinaseproteinwaspurifiedbyamethodincludingproteindenaturation,proteinrenat- urationandSPsepharosefromtheE.coliER2566~ansformedbyNK/pTWIN1.SDS— PAGEshowedthattheexpressionpro- teinwasabout36%oftotalcellprotein.Theexperimentofaga— fibrousproteinplateshowedthattherecombinantnattokinase hadpotentfibrinolyticactivityequivalentto600urokinaseunitspermilligram.Theexpressionandpurificationofsuchafi— brinol~icenzymewouldbehelpfulinproducingnattokinasebygeneengineeringstrain.Fig5,Tab1,Ref11 Keywordsnattokinase;clone;expression;purification;activitydetermination CLCQ78 纳豆激酶(nattokinase,NK)是日本传统食品——纳豆 (natto)在发酵过程中产生的,是一种由纳豆芽孢杆菌(Bacil 1usnatto)产生的具有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶….NK可有效 地分解血栓的主要成分——纤维蛋白,因而具有同血浆纤维蛋 白酶相似的特异性.研究结果表明,NK除具有较强的溶栓 作用外,还具有以下几个优点:(1)来源于食品,安全性能好; (2)分子量小,是一个单链蛋白质,体内半衰期长,可能更易被 人体消化吸收;(3)可由消化道吸收,因此有成为口服性药物 的可能;(4)NK对纤维蛋白的作用机制不同于UK等现用于 临床的药物,它同纤溶酶一样直接作用于纤维蛋白,同时可以 激活体内的tPA;(5)可以用细菌进行液体发酵生产,造价低 廉.可以预见,NK可能成为新一代治疗血栓的口服药物. 为了提高纳豆中纳豆激酶的活性,纳豆激酶的生产在国际 上多采用改良菌种和纳豆生产工艺等方法,国内主要采用 收稿日期:2007-03-07接受日期:2007-04-17 国家高技术研究发展资助项目(863计划,2004AA216090) SuppoaedbytheNationalHigh-teehResearchandDevelopmentProgram ofChina(863Program,2004AA216090) 通讯作者Correspondingauthor(E-mail:szzhang@mGwwcunls.CO1Ta1) 改善纳豆杆菌液体发酵条件,改善纳豆激酶的纯化等方 法'.Nakamura等人于1992年测定了纳豆激酶基因序 列,使利用基因工程的方法提高纳豆激酶活性及产量成为 可能.本文根据大肠杆菌密码子的偏爱性设计拼接引物,采用 PCR引物搭桥的方法获得了与报道"一致的纳豆激酶成熟肽 基因,成功构建了纳豆激酶原核表达载体NK/p1wIN1,NIL/ PET32a及NK/PML.c2x,并利用NK/pTWIN1,使纳豆激酶蛋白 在大肠杆菌中高效表达,通过简单易行的纯化工艺获得了具有 溶栓活性的纳豆激酶冻干干粉. 1材料与方法 1.1质粒与菌株 质粒p1wIN1,PET32a,PMALc2x和菌株E.coliJM109, EcoliBI21,E.coliER2566均为本实验室保存. 1.2酶与试剂 舭I,EeoRI,XbaI,Tag酶,T4连接酶,IPTG和x- gal购自TaKaRa公司;脚I和XmnI购自NEB公司.PCR purificationkit,Gelextractionkit和Plasmidminiprepkit购自0- MEGA公司.牛纤维蛋白原购自SIGMA公司;尿激酶,牛凝血 370应用与环境生物ChinJApplEnvironBioll3卷 酶购自中国药品生物制品检定所;其它生化试剂均为国产或进 口纯. 1.3纳豆激酶基因的PCR扩增及克隆测序 根据已发表的纳豆激酶的序列以及大肠杆菌的偏爱密码 子设计NK拼接引物,用引物搭桥的方法进行PCR扩增(图 1),其具体过程如下. (1)引物磷酸化:将上述引物稀释至100pmol/mL,各取1tzL 混匀,于70?变性5rain后立即置于冰上放置5min,然后加 入T4ligasebuffer和T4polynucleotidekinase37?反应1h,最 后于70?水浴10min. (2)引物连接:磷酸化产物加入T4DNAligasebuffer和T4 DNAligase,于16?连接过夜,产物用cycIe—PureKit纯化. (3)NKcDNA的扩增. NKcDNA5.和3.末端引物的设计:已有报道表明,重组的NK 蛋白是以包涵体形式存在,为了观察NK在pTWIN1,PET32a 和PMALc2x三种载体中的表达情况及其存在方式,通过引入 位于NKcDNA5.末端和3.末端的合适的酶切位点(表1)来 连接相应的表达载体,在不改变载体阅读框的前提下,表达出 与天然NK蛋白氨基酸序列基本一致的重组蛋白. 扩增NK全长cDNA:以步骤(2)中纯化产物为模板,加入 5.和3.末端引物,扩增全长双链NK成熟肽基因,PCR反应 条件:94?变性60S,55oC退火60S,72oC延伸90S,反应35 个循环,最后72?延伸10min. —————————— 引物磷酸化 .........——.........——.........——.........——Primerphosphorylation 上 I?K基因扩增 5'-flank 5 il.末ngp端引rime物r撇唧n砒" 3'-末端引物 3'-flankingprimer 图1NK基因的合成 Fig.1SynthesisoftheNKgene 拼接引物彼此约有2【】-bp的碱基互补,在经过引物磷酸化,引物连接以 及PCR扩增后,得到了NK基因全序列 Theoligonucleotides,whichweresequentiallyoverlappedwith20bpwere mixed.Theywerefirstphosphorylatedandthenassembledby374ligase. Subsequently,thefull—lengthsyntheticNKgenewasamplifiedbyPCR 表1NK基因PCR扩增引物序列 Table1OligonucleotidesofPCRprimersofNKgene 名称Name引物序列Primersequence NK/PET一5 ttc 't c c gt3 taga , .髂诅.砒. NK/PTWIN—F5catatggcacagtctgttccgtacgg3 NK/PMAL—F5tgcgcagcacagtctgttccgtacgg3 NK—R5gaattcttactgtgcagctgcctg3 1.4目的基因的克隆及其序列测定 将PCR产物与克隆载体PMD18.T按4:1比例混合后, 加T4DNA连接酶于16?连接过夜,连接液转化感受态细胞 E.coliJM109,筛选阳性重组子PMD18T?NK1,PMD18T?NK2 和PMD18T.NK3,提取重组子质粒DNA,PMD?18T1用XbaI, EcoRI酶切鉴定,PMD18T.NK2用NdeI,EcoRI酶切鉴定, PMD.18T3用pI,EcoRI酶切鉴定.以重组质粒为模板,利用 Sanger双脱氧终止法,用ABI3730型全自动测序仪进行双向测 序. 1.5表达质粒的构建 1.5.1NK/PET32a的构建从PMD18T?NK1质粒上用Xba I,EcoRI切下NK基因,与经过相同酶切的PET32a质粒以4 :1比例混合后,加T4DNA连接酶于16?连接过夜,连接液 转化感受态细胞E.coliJM109,筛选阳性重组子,提取其质粒 DNA,并用XbaI,EcoRI进行酶切鉴定. 1.5.2NK/pTWIN1的构建从PMD18T.NK2质粒上用 NdeI,EcoRI切下NK基因,与经过相同酶切的pTWIN1质粒 以4:1比例混合后,按照1.5.1所述方法筛选阳性重组子. 1.5.3NK/PML.c2x的构建从PMD18T.NK2质粒上用 脚I,EcoRI切下NK基因,与经过XmnI,EcoRI双酶切的 PML.c2x质粒以4:1比例}昆合后,按照1.5.1所述方法筛选 阳性重组子. 1.6目的蛋白的表达与鉴定 鉴定为正确的质粒NK/pTWIN1及NK/PML?c2x转化大肠 杆菌ER2566,NK/PET32a转化大肠杆菌BL21.挑取单菌落, 接入5mLLB培养液,37?,250r/min培养过夜;次日把过夜 培养物接入新鲜LB液体培养基中,使:0.1,37?摇5 , 6h,当D达到0.8左右时,加入诱导物IPTG,使其终浓 度为0.3mmol/L,30?诱导表达4h.收集菌体,用2×SDS裂 解液裂解,SDS—PAGE法鉴定表达产物.薄层扫描测定表达 的纳豆激酶蛋白在菌体总蛋白中所占的比例. 1.7目的蛋白的纯化 100mL的表达菌以9000r/min离心10rain,收集菌体,将 菌体悬浮于100mLPBS中,冰上超声破菌30min,镜检95%破 壁后,10000r/min离心30min,收集沉淀,经过蛋白质的变性 复性后,在pH6.0的条件下过sP柱,用0.2mol/LNaC1洗脱. 1.8目的蛋白的活性测定 采用纤维蛋白平板法测定纳豆激酶活性.15mL1%的 琼脂糖于55?时加入5mL0.3%的纤维蛋白原溶液及0.25 mL凝血酶(5U/mL),混匀后倒入平板中,静置冷却.在平板 上打孔,以尿激酶作为品,将不同浓度的尿激酶和纳豆激 酶点样在平板上,37?温箱中放置5h,取出后用卡尺测量出 标准品和待检品的溶圈直径.用尿激酶制作标准曲线,算出纳 豆激酶的酶活力. 2结果 2.1懈PCR扩增及其序列分析 根据已发表的纳豆激酶的序列以及大肠杆菌的偏爱密码 子设计引物,用引物搭桥的方法进行PCR扩增,产物用琼脂糖 凝胶电泳鉴定,在800bp附近有十分明显的DNA扩增带,与 预期NK基因大小一致(图2).将PCR产物连接到克隆载体 PMD18.T,测序得到序列正确的PMD18T?NK1,PMD18T?NK2 和PMD18T.NK3. 3期童煜等:纳豆激酶原核表达载体的构建及其活性鉴定371 2.2重组表达质粒的构建 按方法所述,得到含有NK基因的阳性重组子,提取其质 粒,NK/PET32a用0I,EcoRI酶切鉴定,NK/pTWIN1用I, 0RI酶切鉴定,NK/PML—c2x用FspI,0RI酶切鉴定,酶切后 可见一条与PCR产物大小一致的基因片段(图2). 2000bp 7 0 5 0 0b0b8 500bp 250bp 100bp M1234567 图2纳豆激酶基因PCR产物及其表达载体的构建 Fig.2Amplificationofnauokinasegeneandconstruction ofexpressionplasmids M.DNAmaker100bpladder;1.NKPCR产物;2.重组质粒NK/ PMAL.c2x双酶切片断(脚I/EcoRI);3.质粒PMAL—c2x双酶切片 断(XmnI/EcoRI);4.重组质粒NK/pTWIN1双酶切片断(NdeI/ EcoRI);5.质粒pTWIN1双酶切片断(NdeI/Elc0RI);6.重组质粒 NK/PET32a双酶切片断(XbaI/EcoRI);7.质粒PET32a双酶切片 断(XbaI/EcoRI) M1.DNAmaker100bpladder;1.NattokinaseDNAfragmentbyPCR;2. NK/PMAL.c2xdigestedby凡pIandEcoRI;3.PMAL—c2xdigestedby XmnIandEcoRI:4.NK/pTWIN1digestedbyNdeIandEcoRI:5. pTWIN1digestedbyNdeIandEcoRI:6.NK/PET32adigestedby XbaIandEcoRI:7.PE132adigestedbyXbaIandEcoRI 2.3重组菌表达产物的电泳分析 重组菌经IPTG于30?诱导表达4h后,收集菌体,2× SDS裂解液裂解,SDS—PAGE鉴定表达产物.结果表明,NK/ pTWIN1一ER2566和NK/PET32a—BI21中NK蛋白表达量较高 (图3). mdlo.M123456 116 66 45 35 25 18黼 14黼 图3重组菌表达产物的SDS—PAGE分析 Fig.3SDS—PAGEanalysisofexpressionoftargetprotein M.蛋白质分子量Marker;1.NK/PET32a—BI21诱导前;2.NK/ PE2a—BL21诱导后;3.NK/pTWIN1一ER2566诱导前;4.NK/ pTWIN1一ER2566诱导后;5.NK/PMAL—c2x—ER2566诱导前;6.NK/ PMAL—c2x.ER2566诱导后 M.Proteinmolecularweightstandard:1.Expressedproteinbyuninduced NK/PET32a—BL2l:2.ExpressedproteinbyinducedNK/PEI32a—BL21; 3.ExpressedproteinbyuninducedNK/pTWIN1一ER2566:4.Expressed proteinbyinducedNK/pTWIN1一ER2566:5.Expressedproteinbyunin— ducedNK/PMAL—c2x—ER2566:6.ExpressedproteinbyinducedNK/ PMAL—c2x—ER2566 2.4表达产物的分离纯化 选取NK/pTWIN1一ER2566作为表达菌株,对其进行高密 度发酵.发酵产物经4?离心,收集菌体,超声破壁,离心后取 上清与沉淀进行SDS—PAGE电泳,结果表明,约27×10的 蛋白基本分布在沉淀中,其大小与文献报道的纳豆激酶蛋白大 小吻和(图4).所得沉淀用20mmol/L,pH8.5Tris—HC1缓冲 液反复洗涤2次,经离心后的沉淀用含8mol/L脲的20mmol/ L,pH8.5的Tris—HC1缓冲液溶解,经尿素梯度复性后溶于 PBS中,在pH6.0的条件下过sP柱,收集0.2mol/LNaC1洗 脱液,收率约为80%.SDS—PAGE电泳结果表明,在27×10 处有单一条带的蛋白带(图4),100mL菌液经过蛋白变性,复 性和sP柱分离纯化,可获得约0.5g纳豆激酶蛋白冻干干粉. 321MM/103 埘JJ 确赫鲰蝴嘞帮66 潮45 鳓酾35 黼18 14 图4NK基因表达产物及纯化产物的SDS—PAGE分析 Fig.4SDS—PAGEanalysisofexpressionandpurificationofNKgene 1.诱导前;2.诱导后破菌沉淀;3.纯化的NK;M.蛋白质分子量Marker 1.ExpressedproteinbyuninducedER2566;2.Expressedproteininsedi— mentwhenER2566wasinducedwithIPTG:3.Purifiednattokinase:M. Proteinmolecularweightstandard 2.5表达产物的活性测定 按方法所述,称取100mg纳豆激酶干粉,溶于100mL生 理盐水中,以尿激酶为标准品,取10样品点于纤维蛋白平 板上,37?放置5h(图5),通过测量各溶圈直径,算出纯品 纳豆激酶干粉的溶栓比活为600U/mg(以尿激酶为标准). A B 图5纯化产物溶栓活性的测定 Fig.5Determinationofenzymeactivitybyfibrousproteinplateway A.纯化的纳豆激酶(1,3:稀释浓度分别为l:16,1:4,1:1) B.尿激酶标准品(4,8:浓度分别为62.5,125,250,500,1000 U/mL) A.Thedissolvingthrombuscircleofnattokinase(1,3:1:16,1:4, 1:1dilutedrespectively);B.Thedissolvingthrombuscircleofpurified urokinase(4,8:62.5,125,250,500,1000U/mL,respectively) 372应用与环境生物ChinJApplEnvironBiol13卷 3讨论 心脑血管疾病是危害中老年人健康的最严重而又最常见 的疾病之一,血栓症的死亡率也有日渐增高的趋势.溶解血栓 是治疗此类疾病的重要手段之一,目前临床上用于溶解血栓的 药物主要包括链激酶(Streptokinase,SK),尿激酶(Urokinase, UK),组织血纤溶酶原激活剂(tPA),单链尿激酶型血纤溶酶 原激活剂(SCUPA),化学修饰的血纤溶酶一链激酶激活剂复 合物(APSAC).这些药物通过激活血液中的血纤溶酶原,降解 血液中的纤维蛋白,从而达到溶栓目的.在实际应用中,它们都 是注射用药物,在体内半衰期短,且可能引发病人全身性内出 血,药物生产成本也很高.因此,开发新型溶血栓药物成为当前 重要研究课题之一. 自Sumi于1987年首次报道在纳豆中存在一种具有溶栓 作用的酶以来,人们开始对纳豆激酶进行深入和系统的研 究.研究结果表明,纳豆激酶可有效地分解血栓,纤溶活性 强,持续时间长,并且没有明显的毒副作用,因此纳豆激酶是一 种很有潜力的新型溶栓药物.近年来,我国学者致力于纳豆 激酶基因工程方面的研究并取得了一些进展,彭勇等已经 克隆了纳豆激酶成熟肽基因并实现了在大肠杆菌中表达,虽然 表达率较高,但表达产物为融合型,没有测出溶栓活性,而且该 基因与文献[3]报道的核苷酸序列同源性为93.4%.2002年, 罗立新..等人克隆了纳豆激酶原基因并重组到表达载体 pBV220上,实现了在大肠杆菌中的表达,CLT法测定表达产 物具有溶栓活性,但是表达产物的表达率仅为12%.2005年 张仁怀等人克隆并纯化了具有与纳豆激酶相似的生化性质和 生物学功能的豆豉溶栓酶,这些研究为利用基因工程生产 及提高NK活性提供了依据. 我们根据已发表的纳豆激酶的序列以及大肠杆菌的偏爱 密码子设计拼接引物,用引物搭桥的方法成功地克隆了纳豆激 酶成熟肽基因,并将其以非融合的方式重组到'pTWIN1, PET32a表达载体上.目前,利用大肠杆菌表达外源蛋白多采用 融合表达的方式,这种方式往往会影响目的蛋白正常的功能和 结构,而且蛋白的后续处理费用较高.由于重组NK蛋白是以 包涵体形式存在',为了观察NK在pTWIN1,PET32a和 PMALc2x三种载体中的表达情况,在上述3种表达载体的起 始密码子位点已知的情况下,通过引入位于NKcDNA5一末端 和3一末端的合适的酶切位点(表1)来连接相应的表达载体, 在不改变载体阅读框的前提下,构建了NK/PET32a,NIL/ pTWIN1和NK/PML—c2x,其中,前二者可以表达出与天然NK 蛋白氨基酸序列完全一致的重组蛋白,而后者可以表达出与天 然NK蛋白氨基酸序列基本一致的重组蛋白(其N一端较天然 蛋白多余4个氨基酸).SDS—PAGE显示NK/pTWIN1一 ER2566和NK/PET32a—BL21的纳豆激酶蛋白表达量较高,而 NK/PMAL—c2x—ER2566的目的蛋白表达量较低,可能由于启 动子不同所致.表达载体pTWIN1是IPTG诱导型高效表达载 体,我们选取转化NK/p哪IN1的重组菌作为表达菌株,实现 了纳豆激酶蛋白在大肠杆菌中的高效表达,表达率达到36%, 明显高于其他已报道的纳豆激酶表达水平.100mL菌液经过 蛋白质分离纯化后,可获得约0.5g纳豆激酶蛋白.纤维蛋白 平板实验表明,1mg纳豆激酶溶栓活性相当于600u尿激酶. 与已报道的文献比较,本文关于纳豆激酶基因工程的研究从基 因的正确性,表达率,表达产物的分离纯化等方面都有一定的 提高,但是酶活性相对较低,可能由于纳豆激酶蛋白经过变性 复性后,其溶栓活性受到了一定程度的影响.因此,还需在蛋白 的表达,纯化工艺以及提高蛋白活性等方面作进一步的研究. 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