植物生长素受体

植物生长素受体 l68植物生理学通讯第43卷第1期,2007年2月 植物生长素受体 胡应红,李正国,宋红丽,杨迎伍 重庆大学生物工程学院基因工程研究中心,重庆市高校功能基因与调控新技术重点实验室,重庆400044 AuxinReceptorinPlants HU"Fmg—Hong,LIZheng-Guo',SONGHong-Li,YANGYmg-Wu Genet~EngineeringResearchCenter,CollegeofBioengineering,ChongqingUniversity,K eyLaboratoryofFunctionalGeneand RegulationTechnologiesunderChongqingMunicipalEducationCommission,Chongqing 400044,China 提要:扼要介绍了生长素结合蛋白ABP1和泛素一蛋白酶体SCFTM作为生长素受体研究的新进展,并以这2种受体为基 础初步分析了植物生长素受体体系的和范围. 关键词:生长素受体;ABPI;TIRI;AFB 植物生长素的研究已有100多年,但在生长 素受体领域却一直停滞不前,极大地阻碍了生长 素信号转导途径的研究.直到2005年,Dharma. siri,Kepinski和Leyser在Nature上连续发表了2 篇,确定TIR1为植物生长素受体,从而引 起了科学界的高度关注(parry和Estelle2006:康 宗利和杨玉红2006). 在TIR1被确定为生长素受体之前,生长素 受体的研究重点是生长素结合蛋白(auxin.binding protein1,ABP1).2001年,对烟草叶细胞的研 究结果表明,ABP1主要介导低浓度(高亲和力)生 长素的反应,调节细胞伸长生长(Chen等2001). 同年,美国北卡罗莱纳大学Jones研究组从拟南芥 中成功分离到ABPl的首株突变体,并发现ABP1 为正常细胞分裂和伸长所必需,参与胚的形态建 成(Chen等2001).之后,Napier和Venis研究组 揭示了ABP1三维晶体结构的奥秘,并确定了 ABPI的生长素结合位点(Woo等2oo2). 这些研究结果为ABPI的生物学功能提供了分 子生物学和遗传学的证据,表明它具有生长素受 体的功能.这一成果被刊登于Genes&Develop— ment的封面(April1,2001).但至今没有证据表明 它与生长素诱导的基因表达有关. 1TIR1受体功能的确定 生长素受体的另一个研究方向是泛素化降解 途径.早期的研究结果表明,TIR1(transportin— hibitorresponseJ)编码F.box蛋白,并且这种 SCFrm为生长素反应必需(Ruegger等1998).一旦 确定了TIR1是F.box蛋白,就需要分离与其结合 的底物.早期的研究证实Aux/IAA蛋白的稳定化 修饰阻碍生长素反应,并且生长素能促进它的快 速降解(Gray等2001;吴蓓等2005);在细胞提 取液中,Aux/IAA蛋白(IAA7)能与TIR1结合(Gray 等2001);在级联反应中,IAA7DomainII的3O 个氨基残基能与TIR1结合(Kepinski和Leyser 2004).这些研究结果证实,Aux/IAA蛋白就是 SCF的底物,并且它的DomainII在这2种蛋 白互作中起作用.但至今还不清楚是什么因素促 进了这2种蛋白质的相互作用,这些因素又是如 何与生长素感知相联系的. 在去除膜结构的细胞提取液中,Aux/IAA蛋 白能与SCFm结合,证明生长素受体和相关联的 信号传递蛋白是可溶的(Dharmasiri等2003).在 动物和真菌中,底物蛋白的修饰作用(尤其是磷酸 化作用)是特异性识别所必需的.但在植物中,基 因学和药理学研究证实这种磷酸化作用对Aux/IAA 蛋白的识别不是必需的(Dharmasiri等2003; 收稿2006.06—27修定2007—01—17 赍助国家自然科学基金项目(30471214和30371006)和中法 先进研究项目(PRABT04—01). 通讯作者(E—mail:zhengguoli@cqu.edu.cn:Tel:023— 65120483). 植物生理学通讯第43卷第1期,2007年2月l69 Kepinski和Leyser2004).另外,DomainII的光 谱分析也没有发现依赖于生长素的修饰变化.这 些结果证明生长素不是通过改变Aux/IAA蛋白的构 象来促进其与TIR1相互作用(Kepinski和Leyser 2004). 这就引发出一个问,是否存在别的蛋白质 促进二者的相互作用.在【HI.IAA存在的条件下 进行级联反应时,发现IAA能与SCFm'结合,且 细胞提取液中TIR1的浓度越大放射性标记就越 强,这证明IAA是与TIR1或相关蛋白特异性结合 的(Kepms~和1.~yser2005;Dharmasiri等2005a). 为了弄清楚生长素究竟是与TIR1还是其他相关蛋 白结合,采用在光滑爪蟾(Xenopuslaevis)胚胎或 昆虫体内异源合成的TIR1进行级联实验的结果表 明,在有生长素存在的条件下TIR1能与IAA7的 DomainII结合,从而充分证明了TIR1就是生长 素受体(Kepinski和Leyser2005;Dharmasiri等 2005a).' 由此可以推断出整个生长素信号转导的大概 脉络,即SCFn,Aux/IAA和ARFs(auxinre. sponsefactors)承担从生长素到基因表达的信号转 导作用. 2TIR1的生长素结合位点 上述结果证实生长素能与SCFrm'结合,这种 结合进而促进SCFm'-Aux/IAA的相互作用.但到 目前为止,仍不清楚TIR1是在什么位点,如何 与生长素结合的. 首先应该指出的是,不能排除TIR1和Aux/ LADomainII均为生长素结合所必需的可能性; 其次,在TIR1具体结合位点的问题上,Estelle和 Leyser的研究组都证实F-box蛋白对生长素调控的 SCFrm'_Aux/IAA结合是必需的.缺失F.box蛋白 或其保守区域发生点突变,这种结合作用就大大 削弱甚至消失(Kepms~和1.~yser2005;Dharm~ 等2005a).可能由于TIR1首先必须与微生物中 SKP1(S.phasekinase.associatedprotein1),或拟 南芥中的ASK1(Arabidopsisserine/threoninekinase 1)相互作用后,才能与生长素和底物结合.虽然 已证实这些区域彼此存在着功能上的依赖性,但 仍然不能确定结合位点的具体位置.因此需要进 一 步纯化F.box蛋白后才可以研究这一问题;相 比之下,ABP1的生长素结合位点已经研究得比较 清楚(Woo等2002).目前,人们已对TIR1和ABP1 的序列进行比较,证明它们之间没有相似之处. 3TIR1/AFB基因家族 如果TIR1是唯一的生长素受体,那么功能 缺失突变株应该是致死的,但实际情况并非如 此.拟南芥Aux/IAA基因(如bdl/iaal2)发生功能 获得突变的植株常表现出强烈的生长素反应减弱的 表型,而tirl突变株虽然表现出一定的抗生长素 的表型,但很难与野生型植株区分开来(Ruegger 等1998).这可能是因为拟南芥中存在3个密切相 关蛋白(AFB1,AFB2和AFB3)之故.AFB(auxin. signalingF-boxprotein)不仅与TIR1有高度同源性, 同时也含有亮氨酸重复区域;另外,AFB与IAA7 的互作也是依赖于生长素的.从这些结果来看, AFB蛋白很可能也是生长素受体(Dharmasiri等 2005b). 用突变体进一步研究表明,拟南芥TIR/ AFB基因发生单一突变,其表型很难与野生型相 区分,而三重(如tirl,afb2,afb3)和四重(如 tirl,afbl,afb2,afb3)突变的植株则出现强烈 的表型变化:胚胎出现严重的缺陷,种子萌发受 到抑制;不能生根,只有一片子叶;即使能萌 发成幼苗,但缺少根毛,向地性也较差;成熟 植株叶簇生,数目减少并高度卷曲;花序茎变 短,分支变多等.这些表型同bdl/iaal2或mp/arf5 突变株很相似,因此可以推断三重和四重突变体 中幼苗的致死是由IAA12和IAA13的累积引起的. 事实上,在tirlafb2afb3突变株中,BDL/IAA12 蛋白质的水平确实升高了(Dharmasiri等2005b). 综上所述,TIR1/AFB家族可能是一个生长素 受体组群,它们担当了重复性的受体功能,并且 这种功能的重复性是系统化的,因而某一成员的 突变并不会导致致死表型的出现.因此,需要进 一 步取得这个家族在组织特异性方面的数据. 但是,TIR1/AFB可能不是植物细胞中唯一的 生长素受体.有很多生长素反应,如不可能在转 录水平上实现的生长素反应,则可能不是由 TIR1/AFB介导的. 4ABP1和TIR1亲和活性的比较 据报道,异源表达的拟南芥SCFm'对IAA具 l70植物生理学通讯第43卷第l期,2007年2月 有较高亲和活性,离解常数(dissociationconstant, )为25nmo1.L(Kepinski和Leyser2005)和84 nmo1.L(Dharmasiri等2005a~,而对1一NAA的亲 和活性以微摩为单位,其值小于IAA;与2,4一D 的亲和活性较低;与2-NAA,色氨酸均无亲和活 性(Kepinski和Leyser2005;Dharmasiri等2005a). 大豆的ABP1与1-NAA具有较高亲和活性,为 50,-200nmo1.L,;与2.NAA的亲和活性类似于1. NAA;与IAA的亲和活性稍低,为5—10Ixmol?L一; 与2,4.D的亲和活性较低;与色氨酸无亲和活性 (Napier等2002;Vennis和Napier1995).由此可 见,2种蛋白对生长素的选择性是不同的, SCFrm更倾向于与IAA结合,而ABP1则倾向于 与2-NAA和1-NAA结合.但2种蛋白质与色氨酸 均无结合活性,且与2,4.D的亲和活性均较低. 另外,由于内部转运载体的存在,以致2,4.D在 细胞中的浓度较高(Delbarre等1996),并且它能通 过新陈代谢作用而趋向稳定化,所以其作用比生 长素更稳定,更持久(Delbarre等1994).由此看 来,在任何浓度下,虽然亲和活性较低,但仍能 表现出较强的生长素反应. 另外,2种蛋白亲和活性所依赖的pn值是不 同的.大豆的ABP1与1-NAA结合作用的最适pn 值是5.05.5,在pH值为7.0时也有部分亲和活 性,与对应细胞区域的pH值一致(细胞表面prI值 为5.O.0,Napier1995);但拟南芥SCFrml_IAA 级联实验的pn值为7.2(Dharmasiri等2005a)和7.5 (Kepinski和Leyser2005),虽然没有证据证明 SCFTM的亲和活性依赖于pn值,但其具有最高亲 和活性的pn值与对应细胞区域的pn值也是一致的 (细胞核pH值为7.2-7.5). 由以上结果可以看出,SCFrm和ABP1的区 别主要有两方面:一方面是对生长素的选择性不 同;另一方面是亲和活性所依赖的pH值不同. 同时可以发现,SCFrm和ABP1对于生长素 的选择性和亲和活性与其对应的细胞区域是一致 的,因而可以推断ABP1是位于细胞表面的生长素 受体,而SCF11是位于细胞核区域的生长素受 体,由于2种蛋白质所处的区域不同,所以它们 所介导的生长素反应过程必然不同. 5生长素受体体系 目前,在植物生长素受体领域研究得最多的 是ABP1,但至今没有证据表明它与生长素诱导的 基因表达有关.TIR1的研究始于上世纪末期,但 直到2005年才在拟南芥中被确认为生长素受体, 它介导的信号转导模式中,生长素通过与TIR1直 接结合来促进Aux/IAA.SCFn刚的互作,即Aux/ IAA蛋白通过泛素化途径水解.此种模式看似完 美,但过于简单,因为从目前的研究结果来看, TIR1家族并不是唯一的生长素受体.拟南芥在施 加外源生长素l0—15min时出现第一个快速生长 期,30min时达峰值,之后生长速率下降:在 生长素的持续作用下,60min出现第二峰,之后 生长速率趋于恒定(Badescu和Napier2006).由于 蛋白质的水解作用和基因的转录激活需要时间, 于是生长素所诱发的生长素反应遂有一定的反应滞 后期,由此看来,生长素诱导的快速反应不太可 能是由TIR1介导的. 从目前的实验技术来看,要测定植物细胞中 一 种新蛋白质产生需要多少时间是很困难的.早 期的生长素诱导产物可在几分钟内产生(Abel和 Theologis1996),还有一些蛋白质产生的时间范 围是10—15min.即便考虑RNA调节的可能性, 5min之内产生的生长素反应也不可能由TIR1介 导.而滞后期为1015min的生长素反应,其反 应时间与TIR1介导的生长素反应一致,这类反应 可能由TIR1介导. 有一些细胞反应的滞后期为5min,它们大 多数发生在质膜区域,并与生长素诱导的离子运 输和细胞膨胀有关,这些反应由ABP1介导;还 有一些不能与任何已发现的受体体系相联系,如 (mitogen.activatedproteinkinase)的激活 MAP激酶 (Mockaitis和Howell2000). 植物中还有2类生长素反应不可能由TIR1介 导:一类是由胞外受体介导的生长素反应.豌豆 胚芽鞘部位施加外源生长素的实验证实细胞表面的 受体介导了细胞的伸长反应(Vennis等1990);采 用玉米胚芽鞘和拟南芥下胚轴原生质体直接暴露质 膜表面的实验也证实胞外受体与离子跨膜运输和原 生质体膨胀有关(Steffens等2001).在这些例子 中,受体可能为ABP1. 植物生理学通讯第43卷第1期,2007年2月l7l 在豌豆中采用抗ABP1的抗体的实验中,胞 外抗体可阻断1-NAA引起的生长素反应,而IAA 引起的反应没有被阻断(Yamagami等20O4),这暗 示有2条完全不同的信号转导途径:一条由ABP1 介导;另外一条由较低生理浓度的IAA诱导产 生,由TIR1介导. 植物中还有一些反应不能与任何已知受体相 联系,如生长素诱导的生长素极性运输,外输载 体PIN(pinformed)蛋白的作用很大(Geldner等 2003).最新的研究结果表明,微摩尔浓度的 IAA,1-NAA和2,4一D能阻止PIN蛋白和质膜上其 他组成性循环物质的内吞作用(Paciorek等2005). 由于内吞作用的减弱,外输载体即在质膜外表面 累积,生长素外输作用增强,这就为生长素引起 的暂时性极性运输提供了一个合理的解释(Paciorck 等2005).虽然这个论断尚需进一步验证,但如 果真如此,这就是一个新的生长素反应,因而应 进一步分离新的生长素受体. 总之,植物的生长素受体体系是一个错综复 杂的体系,这些受体是一个庞大的组群,它们彼 此共同协调完成不同的生长素反应.就目前在 ABP1和TIR1中所取得的结果来谈受体体系还为 时过早,但不可否认,这些结果将促进植物生长 素受体体系的研究不断深入. 6结语 TIR1作为生长素受体的发现和确证具有里程 碑式的意义,但并不意味着已经找到了所有的生 长素受体,弄清了所有信号转导支路.相反, TIR1的生长素受体功能的确认引发了更多亟待解 决的问题.其中最重要的问题是生长素的具体作 用机制,即生长素如何促进TIR1一Aux/IAA相互作 用,TIR1在什么位点,如何与生长素和底物结 合.这有2种可能:一种可能是生长素与TIR1 结合使其构象发生改变,与底物结合;另一种可 能是生长素只是起使TIR1.Aux/IAA结合稳定化的 作用.这还需要进一步参考其他激素受体结合位 点研究中的已有结果,制定生长素受体研究的可 行性. TIR1/AFB家族是一个生长素受体组群,它们 担当重复性的受体功能,并且这种功能是系统化 的,因此,需要进一步建立转基因株系以获得组 织特异性方面的结果.生长素直接与泛素连接酶 (E3)作用,中间没有信号转导支路,所以依赖于 生长素的Aux/IAA蛋白的降解作用非常迅速,是 否自然界就是利用这种机制调控SCF底物的降解 作用?至少在植物中的回答是肯定的.植物和动 物中有大量F—box蛋白,除了TIR1是生长素受体 之外,最新的研究结果表明F—box蛋白也是茉莉 酸(jasmonicacid,JA)(Devoto等2002;Xu等 2002)和赤霉素(gibberellicacid,GA)(Ueguchi— Tanaka等2005;Fleet和Sun2005)的受体.究竟 它们之中有多少成员直接受小分子激素配体的调 节,值得深入研究. 通过比较ABP1和TIR1的亲和活性,分析植 物生长素受体体系,不难发现ABP1主要介导反应 迅速和定位于质膜区域的生长素反应,这类反应 . 主要包括离子跨膜运输和原生质体膨胀两个方面 而TIR1主要介导由胞内生长素诱导,在转录水平 上实现的生长素反应.但仅是这2种受体还不能 解释所有的生长素反应过程.因此还应进一步研 究生长素的其他反应过程,分离新的生长素受 体,以完善生长素受体体系和信号转导途径. 参考文献 康宗利,杨玉红(2006).生长素受体之谜得到初步破解.植物生理 学通讯,42(1):105一l08 吴蓓,吴建勇,蔡刘体,李运合,黄学林(2005).生长素反应因子. 植物生理学通讯,4l(3):273278 AbelS,TheologisA(1996).Earlygenesandauxinaction.Plant Physio1.1ll:9~17 BadescuGo.NapierRM(2006).Receptorsforauxin:willitall endinTIRs?TrendsPlantSci.1l:2l7-223 ChenJG,UllahH,YoungJC,SussmanMR,JonesAM(2001). 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