人甲状腺乳头状癌高表达基因片段筛选与克隆

人甲状腺乳头状癌高表达基因片段筛选与克隆 人甲状腺乳头状癌高表达基因片段筛选与 克隆 464中华内分泌代谢杂志2004年lo月第2o鲞篁塑!!坐!!!竺!!!!!: 表1Nel_finavir对INS一1细胞活力的影响(n=4,?s) Z . bo 垛 日 鳘 3.Or O Ne1finavir浓度(mo1/L) 注:与0}xmol/L比较,P<0.05.一P<0.01 图1Nelfinavir对INS一1细胞胰岛素释放的影响(,4) 表2Neffinavir对INS一1细胞内胰岛素含量的影响(?s) 注:与0~mol/tNelfinavil'比较,P<005 三,讨论 本实验观察到HIV一1蛋白酶抑制剂Nelfinavir长期治疗可 以降低胰岛素分泌功能,尤其是葡萄糖刺激的胰岛素分泌功 能,而且能够产生降低胰岛素分泌作用的药物有效浓度在患者 血浆药物治疗浓度范围之内J,因此,体外观察到的Nelfinavir 对INS一1细胞系的影响也可能发生在体内.最近的一个临床 研究也证实这一点,Woerle等应用高血糖钳夹技术观察到 Nelfinavir治疗12周可以导致第一时相胰岛素分泌减低.胰岛 素分泌功能对代偿外周胰岛素抵抗,维持血糖水平正常起着重 要作用.Nelfinavir对胰岛功能的影响可能在HIV一1蛋白酶抑 制剂导致糖尿病的发生中起着关键作用. 本实验还观察到Nelfinavir在不影响细胞数目的情况下, 可以降低细胞内胰岛素含量,提示胰岛素合成减少.而胰岛素 合成减少可以加重葡萄糖诱导的胰岛素释放不足.Nelfinavir 只有达到10~mol/L浓度时才有降低胰岛素合成作用,而在低 浓度即可降低胰岛素释放,提示Nelfinavir通过多个作用点影 响胰岛B细胞功能. 总之,Nelfinavir长期治疗可以降低胰岛素释放和胰岛素含 量,损害胰岛B细胞功能,这在HIV一1蛋白酶抑制剂导致糖尿 病的发生,发展中可能起着重要作用. 参考文献 lNolanD.Malla1S.GettingtotheHAARrofinsulinresistance.AIDS. 2001,15:2037-2041. 2AsfaM,JanjicD,MedaP.eta1.Establishmentof2-mercaptoethano1 dependentdifferentiatedinsulin—secretingeel11ines.Endominology. 1992,13O:167—178. 3KurowskiM,KaeserB,SawyerA,eta1.Limitedeffectoffood compositionontheDhan,】acokjl1eticsofnelfinavJ~admi~isteret{,wice daily.EurJMedRes,2o02,7:453-456. 4WoerleHJ,ManuzPR,MeyerC,eta1.Mechanismsfo,the deteriorationinglucosetoleranceassociatedwithHlVproteasenhibito, regimens.Diabetes,2o03.52:918-925. (收稿日期:2003-09-09) 人甲状腺乳头状癌高表达基因片段筛选与克隆 王红卫洪涛刘江华曹仁贤文格坡 【提要】应用抑制性消减杂交技术构建人甲状腺乳头状癌eDNA消减文库,并从 中克隆了3个 cDNA片段,通过测序,同源性分析,表明这些片段与来自恶性肿瘤相关基因片段具 有同源性,提示他们可 能在甲状腺癌的发生发展中起到某种重要作用. 【关键词】甲状腺癌;消减杂交;筛选;克隆 Screeningandcloningofgenefragmentswithhighexpressioninhumanpapillarythyroidcarcinoma WANGHong—wei,HONGTao.LIUJiang—hua,CAORen—xian.WENGe— bo,TheClinicalMedicineInstitute.The FirstHospitalAffiliatedtoNanhuaUniversit~一,Hengyang421001 金项目:国家fI然科学基金资助(39970346) 作并单位:421001衡刖,南华大学附属第一医院临床医学研究所 通讯作者:文格波 糖 料童一葡』 0????????I 出 工?_础一?基加L一口?j一 . 主堡凼塑堂盘查堡!旦笙鲞箜塑!!!!!!!!!!!!: 【Summary】 eDNAsubtractivelibrarywasconstructedbysuppressionsubtractivehybridizationtechnique andthreeeDNAfragmentswerescreenedandclonedinhumanpapillarythyroidcarcinoma.Theresultsshowedthat threedifferentlyexpressedeDNAfragmentswereofhighhomologywithsomeknownoncogenes,suggestingthat thesegenesmayplayanimportantroleinthepathogenesisofpapillarythyroidcarcinoma. 【Keywords】Thyroidcarcinoma;Subtractivehybridization;Cloning;Screening (ChinJEndocrinolMetab,2004,20:464-466) 甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤之一,其发病机 制尚未明确.本课题应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建了 甲状腺癌eDNA消减文库,为今后进一步研究甲状腺癌发生发 展的分子生物学机制提供实验基础. 一 ,材料和方法 1.组织来源:男性,38岁,癌组织经病理检查证实为"甲状 腺乳头状癌I,?期,被膜浸润",癌旁组织证实为正常. 2.生化试剂:mRNA纯化试剂盒为美国Promega公司的产 品;PCR—SelecteDNASubtraction试剂盒,AdvantagePCRCloning 试剂盒均为美国Clontech公司的产品;PCR扩增仪为Perkin Elmer公司的PE9600. 3.RNA及mRNA的提取分离:Trlzol法提取总RNA,磁珠 分离法分离mRNA. 4.抑制性消减杂交:试剂盒来自美国Clotech公司产品,严 格按照说明书操作. 5.eDNA消减文库的构建及克隆鉴定分析:按文献[1]方 按文献[2]方法制备质粒,酶切鉴定. 法,进行连接反应. 6.序列分析:Sanger法测序. 7.同源性分析:将得到的差异性片段登录GenBank,进行 同源性比较. 8.Northern印迹分析:以CB227637序列合成探针并纯化, 用Tester和Driver的总RNA约30g进行Northern印迹分析, 具体步骤参照试剂盒说明书. 二,结果 1.总RNA及mRNA的提取:癌及癌旁提取的总RNA及 mRNA,其OD值A:6./A:.均大于1.80,表明其纯度良好. 2.两次抑制性PCR扩增:消减PCR产物包含多条分界不 十分清晰的不同大小的条带,说明差异表达的基因片段已成功 扩增. 3.eDNA消减文库消减效率的鉴定:经过两轮消减杂交,像 G3PDH这样与肿瘤发生发展关系不大的看家基因被有效消 减,而与甲状腺癌相关的特异性基因被高效扩增. 4.eDNA消减文库扩增及克隆的序列分析鉴定:挑取白色 克隆,制备质粒,EcoRI酶切分析,确定其内载有100,500bp 大小插入片断. 5.eDNA片段核苷酸序列分析,并在GenBank中进行登录: 将质粒中的eDNA片段进行测序,测序后得到3个差异表达的 eDNA片段,其中1个又有3个相同的拷贝,并分别将它们在 GenBank中登录,其登录号分别为CB227635,CB227636, CB227637. 6.eDNA片段核苷酸序列的同源性比较:结果发现其中一 个序列CB227635与GenBank的EST库中AW266490.1(组织 来源为结肠上皮细胞癌)同源性为100%;另一序列CB227637 465 与BQ073321(组织来源为肺癌)同源性100%,该序列与 S100A13(钙结合蛋白A13)(Hs.14331)基因的82,297bp同 源性为100%.该基因在许多癌组织中有表达,但尚未有在甲 状腺癌中表达的报道.另外,目前已知S100A13在染色体上的 位点为1q21.1—1q21.2. 7.将CB227637序列进行Northern印迹分析结果:将探针 分别与2例甲状腺癌组织和2例正常甲状腺组织进行Northern 印迹杂交.结果表明,CB227637基因全长约为1.4kb,在甲状 腺癌组织中高表达,而在正常甲状腺组织中不表达. 三,讨论 甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤之一.它的生 物学特性多变,发病机制尚未明确.目前关于甲状腺癌的基因 研究多集中于c—myc,H—ras,,Ret等基因的突变或表达异常, 如甲状腺肿瘤c.myc基因表达异常及低甲基化研究,甲状 腺肿瘤P"突变及高甲基化,ki—ras基因研究等,而研究对甲 状腺癌特异诊断,治疗有帮助的甲状腺癌特异基因的报道尚不 多见. Diatchenko等在抑制性PCR的基础上首次发明了抑制 性消减杂交(SSH),并成功地构建了睾丸肿瘤特异性eDNA消 减文库,此后,SSH技术相继应用于乳腺癌肾癌等肿瘤特 异性基因的克隆.较其他方法此方法有诸多优点:(1)假阳性 少,重复性强;(2)所需标本量少:此技术仅需1,2IxgmRNA; (3)具高度灵敏性;(4)提高了克隆的效率;(5)可同时分离上 百个差异表达基因;(6)程序相对简单,操作简便. 本组应用抑制性消减杂交方法,成功地运用甲状腺癌组织 构建了高特异性的人甲状腺癌eDNA消减文库,然后对消减文 库进行了初步筛选并克隆出了3个甲状腺癌高表达基因的 eDNA片段,其中1个eDNA片段含有3个拷贝.对这3个 eDNA序列运用Blastn程序进行同源性检索,结果显示:其中一 个序列CB227635与GenBank的EST库中AW266490.1(组织 来源为结肠上皮细胞癌)同源性为100%;另一序列CB227637 与BQ073321(组织来源为肺癌)同源性100%,该序列与 S100A13(钙结合蛋白A13,Hs.14331)基因的82,297bp同源 性为100%.该基因在许多癌组织中有表达,但尚未有在甲状 腺癌中表达的报道.通过Northern印迹分析,本组发现该EST 序列在甲状腺癌中高表达而在正常甲状腺组织中低表达目 前只知这3个消减产物eDNA片段均与来源于其他恶性肿瘤 的EST片断有高度同源性,但他们所代表的基因尚有待确认. 总之,通过对人甲状腺癌eDNA消减文库构建和基因筛 选,将大大减小了进一步应用Northern印迹.RT—PCR,DNA测 序,RACE(快速扩增eDNA末端技术)等技术筛选鉴定克隆甲 状腺癌特异基因,基因全长获得,基因登录,基因功能研究的盲 目性,提高了特异性,并且有利于克隆出低丰度的稀有基因. 466中华内分泌代埘杂毒堡!旦笠鲞筮塑兰竺!!!!!竺三!!!!!: 参考文献6 1CIarkJM.Novelnon.templatednucleotideadditionleactionscatalyzedby 【JI"can0ticandeticalyoticI)NApolymerases.Nucleic~tcidsRes,1988, 16:9677-9686.7 2Sambl0okJ.FritschEF,ManiatisT,eta1.MonoculalCloning:A LaboratorvManua1.2ndBeijing:SciencePless,1992,l8—34. 3文格波.曹仁贤,向前,等.甲状腺癌P53基凶甲基化的研究.中国8 癌症杂志,1998,8:280. 4文格波,曹仁:贤,刘江华,等甲状腺肿瘤c—myc丛凶转隶及甲基 化研究.美国中华l}fii床医学杂志,1999,1:18-20 5文格波,曹仁贤,刘江华,等甲状腺肿瘤P53和ki-laS基因序列测 定中华内分泌代谢杂志,2000,16:187—189 DiatchenkoL.IYF.CampbellAP,eta1.Suppressionsubtractive hybridization:amethodforgeneratingdifferentiallyregulatedortissue- specificcDNAprobesandlibraries.PmcNat]AcadSciUSA,1996,93: 6025-6030. BustinSA.LiSR,DomdiS.ExpressionoftheCa"-activatedchloride channelgenesCICA1andCLCA2isdownregulatedinhumancolorectal cancer.DNACellBid.200I.20:33l-338 张强,张志文,辛殿旗,等,癌差异表达基因GYIZ—RCC18的伞长 克隆及意义.中华外科杂志,2000,38:935-938. (收稿H期:2003-02-27) 胰岛素,葡萄糖对3T3一L1脂肪细胞脂肪水孔蛋白表达的调节 周红文段宇陈家伟 【提要】利用半定量RT.PCR技术及Western印迹法研究胰岛素,葡萄糖对成熟脂 肪细胞脂肪水孔 蛋白(AQPap)基因表达的影响.结果表明,胰岛素对AQPap的表达具有抑制作用; 而高浓度葡萄糖则对 AQPap的表达具有促进作用. 【关键词】水孑L蛋白类;3T3一L1细胞;胰岛素;葡萄糖 RegulatoryeffectsofinsulinandglucoseOilaquaporinadiposeexpressionin3T3-L1adipoc ytesZHOU Hong— wen,DUANYu,CHENJia-wei.DepartmentofEndocrinolog),theFirstAffiliatedHospitalo fNang MedicalUniversit),Nanjing210029 【Summary】 Aquaporinadipose(AQPap)isthephysiologicalglycerolchannelspecifictoadipocytesBy meansofsemiquantitiveRT— PCRandWesternblotting,thisstudyshowedthatinsulinWaSanegativeregulatorof AQPapexpression,whilehighconcentrationofglucosecouldincreaseAQPapexpression. 【Keywords】Aquaporins;3T3一L1cells;Insulin;Glucose (ChinJEndocrinolMetab,2004,20:466-467) 脂肪水孔蛋白(AQPap)是脂肪组织特异表达的甘油水孔 它负责在脂肪分解时将脂肪细胞内的甘油转运至细胞 蛋白, 外.参与能量供应.胰岛素对3T3.L1脂肪细胞AQPap mRNA表达具有抑制作用,呈剂量依赖及时间依赖性.葡萄 糖与胰岛素是反映机体能量状况的重要信号分子.脂肪组织 特异表达的一些与糖脂代谢有关的基因可能会受葡萄糖的影 响.正常情况下,AQPap基因表达强弱适应着血浆营养的变 化以便于给机体提供足够能量,这得益于胰岛素对AQPap基因 表达的负调节作用.而在胰岛素抵抗状态下,这种调节作用受 损,出现高甘油血症.高甘油输出率导致肝糖输出增加,造成 高血糖.因此,AQPap表达异常与胰岛素抵抗及糖尿病的发 生有着极为密切的关系.本研究利用RT.PCR及Western印迹 方法探讨胰岛素及高浓度葡萄糖对3T3.L1细胞AQPapmRNA 及蛋白质表达水平的影响. 一 ,材料与方法 1.实验仪器与主要试剂:3T3.L1脂肪前体细胞株(日本 作者单位:210029南京医科大学第一附腻医院内分泌科 JCRB细胞库);DMEM细胞培养粉(GIBCO公司);兔抗人 AQPap特异性多克隆抗体(AB3093,Chemieon公司)羊抗兔IgG 二抗(4050-05.晶美公司);RT.PCR试剂盒(美国Promega公 司). CO,培养箱(TYPE4,德国Heraeus公司);低温离心机(上 海安亭科学仪器厂);超速低温离心机(BeckmanL8—80M.美 国);PCR仪(美国GeneAmpPCRSystem2400) 2.方法:(1)3T3.L1脂肪前体细胞的培养及诱导分化2.51: 按照常规诱导分化对3T3.L1脂肪前体细胞进行诱导分 化,一般到诱导分化第9天,95%以上细胞分化为成熟脂肪细 胞后,便可进行实验.(2)胰岛素,葡萄糖对3T3.L1脂肪细胞 AQPapmRNA表达的影响:?胰岛素对3T3.LI细胞表达AQPap 的调节:3T3?L1细胞诱导分化第9天,换用含0.5%牛血清蛋 白(BSA)的无血清DMEM(葡萄糖浓度为5.6mmol/L)培养液 孵育12h,PBS洗2次;用无血清培养基配制刺激液,胰岛素浓 度分别为10,,10,,10,,10一mol/L,用不同浓度的胰岛素刺 激细胞6h,每种浓度的实验重复3次,6h后提取细胞总RNA. ?不同浓度葡萄糖对3T3-L1细胞AQPap表达的影响:普通培 养基葡萄糖浓度为5.6mmol/L,用普通培养基配制成葡萄糖浓