液相芯片技术在人乳头瘤病毒检测和分型中的应用

液相芯片技术在人乳头瘤病毒检测和分型中的应用 ()2007 年 10 月 Oct . 2007 自然科学版四川大学学报 ( ) 第 44 卷第 5 期Jo ur nal of Sichuan U niversity Nat ural Science Editio n Vol . 44 No . 5 () 文章编号 : 049026756 20070521111204 液相芯片技术在人乳头瘤病毒检测 和分型中的应用 刘思瑶 ,丁显平 ,朱一剑 ,魏 萍 ()四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室遗传医学研究所 ,成都 610064 ( ) 摘 要 : 从 50 例疑似感染人乳头瘤病毒 Human Papillo mavirus , HPV 患者的标本中提取 DNA ,运用液相芯片技术对提取的 DNA 进行 7 种低危型和 19 种高危型检测 ,并与反向点杂 交检测结果进行比较. 50 例标本中 ,液相芯片检出阳性 26 例 ,阳性率为 52 % ,其中单一亚型感 染 20 例占 40 % ,多重感染 6 例占 12 % ,比反向点杂交的多重感染阳性检出率高 4 %. 关键词 : 液相芯片 ; HPV ;基因分型 中图分类号 : Q81文献标识码 : A The a ppl icat ion of l iquid chips technol ogy in human pa pill oma virus detect ion an d genotyping L I U S i2y ao , D I N G X i a n2pi n g , Z HU Y i2j i a n , W EI Pi n g ( Key L aboratory of Bio2resources and Eco2enviro nment , Minist ry of Educatio n , Instit ute of Medical Genetics , )College of Science , Sichuan U niversity , Chengdu 610064 ,China Abstract : 50 specimens f ro m t ho se suspected fo r HPV infectio n were detected wit h t he met ho d of liquid chip s ( ) and reverse line blot assay. In all 50 specimens , 26 52 %were detected po sitive fo r HPV DNA wit h t he () ( ) met ho d of liquid chip s , including 20 40 %single infectio n and 6 12 %multiple infectio n . However , t here () were just 4 8 %multiple infectio n wit h t he met ho d of reverse line blot assay. Key words : liquid chip , HPV , genot yping 70 , 72 , 81 等 ,以 HPV6 ,11 最为常见 ,主要引起尖 1 引言 锐湿疣等良性病变 ; 后者包括 HPV16 , 18 , 31 , 33 , 宫颈癌在全世界妇科癌症中居于第二位 ,每年 35 , 39 , 45 , 51 , 52 , 56 , 58 , 59 , 68 , 72 , 82 等 , 以 大约有 470 ,000 新增病例 ,大约 250 ,000 人死于该HPV16 ,18 最 为 常 见 , 常 引 起 恶 性 病 变 , 如 宫 颈12( ) . 而宫颈癌的发生与人乳头瘤病毒 HPV 的 病癌. 由于 HPV 的致病性与其亚型密切相关 , 所 感染密切相关 . 根据基因组的同源性可将其分为多 以对其进行检测和分型对于临床诊断具有重要意 种亚型 ,目前已有 100 多种 HPV 亚型被鉴定 ,其中 义 . 约 40 余种与人类生殖器皮肤黏膜病变有关. 根据 目前对 HPV 的检测及分型有多种方法 ,液相 其对生殖系统的致癌性 ,可将其分为低危型和高危 芯片则是近年才发展起来的新方法. 液相芯片是基 型 ,前者包括 HPV6 , 11 , 40 , 42 , 43 , 44 , 54 , 61 ,于 L uminex TM100 的一个多功能生物芯片的分析 收稿日期 : 2006211224 ; 修回日期 :2007204230 ( ) 作者简介 : 刘思瑶 1982 - , 女 , 硕士 , 从事医学遗传与分子生物学研究. 通讯作者 : 丁显平. E2mail : brainding @263 . net ( 平台 , 有 机 地 整 合 了 编 码 微 球 colo r2co ded micro2 盐水或洗脱液全部转移到 1 . 5 mL 微量离心管中 , ) sp here o r bead、激光技术 、应用流体学 、最新的高 13000 r/ min 离心 10 min ,弃去上清 ,保留管底的细 速数字信号处理器和计算机运算法则 ,使其具有高 胞块. 加入 50 mL 细胞裂解液悬浮沉淀 ,100 ?加 3 通量 , 高灵敏度 , 速度快等特点. 本研究中采用热 10 min . 13000 r/ min 离心 10 min , 保留上清待 液相芯片技术可同时达到对 HPV26 种亚型的检 用 . 测 . ( 采 用 GP5 + 5 ’2T T T GT T 2 . 2 . 2 PCR 扩 增 ) AC T GT G GTA GA T AC T AC23’和 5 ’2biotiny2 2 材料和方法 ( lated GP6 + 5’2GAA AAA TAA AC T GTA AA T 材 料 2 . 1 ) ( CA T A T T C23’引物对 HPV DNA 26 种亚型 6 , ( 50 例疑似 HPV 感染门诊患者标本 宫颈脱离11 ,16 ,18 ,26 ,31 ,33 ,35 ,39 ,40 ,42 ,44 ,45 , 51 , 52 , ) 53 ,54 ,55 ,56 , 58 , 59 , 61 , 66 , 68 , 73 , 83进行标本 ) 细胞 ,疣体组织; Taq DNA 聚合酶 、配套的 PCR μDNA 扩增. PCR 反应体系为 : 总体积 20 L , 包括 反应缓冲液 、dN TP 购自 Ta Ka Ra 公司 ; 连接生物 μ约 200 ng 的 模 板 DNA , 800 mol/ L dN TPs , 1 . 5 素的引物及氨基化修饰的探针由 Ta Ka Ra 公司合 2 + mmol/ L Mg,每条引物 5 p mol/ L 以及 1 . 5 U Taq 成 ,探针序列见表 1 ; 表面羧基化的荧光编码微球酶 . PCR 反应条件为 :95 ?预变性 5 min ,95 ? 30 购自 L uminex 公司.s ,55 ?1 min ,72 ?1 min ,循环 40 次 ,72 ?延伸 5 表 1 HPV 亚型探针序列min . Tab. 1 HPV t ype2specific oligop ro bes μ2 . 2 . 3 杂 交 杂交反应体系包括 22 L 寡核苷 HPV 亚型 探针序列 5’?3’ () 酸探针偶联微球 包括 26 种微球的微球杂交液及 TCC GTAAC TACA TC T TCCA 6 μ3L PCR 产物. 将杂交检测混合物混匀 , 99 ?热 11 TC T GT GTC TAAA TC T GC TAC μ变性 5 min ,然后在 48 ?杂交 15 min ; 加入 75 L 16 CA T TA T GT GC T GCCA TA TC SA2P E ,混匀后置于 48 ?孵育 5 min . 最后在 L u2 18 T GC T TC TACACA GTC T minex 100 多功能流式点阵分析仪及 L uminex Data 26 CC T GTACA T TA TC T GCA GCA TC Collecto r Versio n1 . 7 数据收集软件上进行读数检 31 GCAA T T GCAAACA GT GA TAC 测 . 33 T GCACACAA GTAAC TA GT GA 35 C T GC T GT GTC T TC TA GT GA 2 . 2 . 4 上述 50 例标本 DNA 用反向点杂交方法 39 A TA GA GTC T TCCA TACC T TC 采用深圳亚能公司试剂盒检测 23 种 HPV DNA 亚 40 A GTCCCCCACACCAACC (型 6 ,11 , 16 , 18 , 31 , 33 , 35 , 39 , 42 , 43 , 44 , 45 , 51 , 42 T GGT GA TACA TA TACA GC T G ) 52 ,53 ,56 ,58 ,59 ,66 ,68 ,73 , MM4 ,83. 44 TAC TA GT GAACAA TA TAA GCA 45 TAA T T TAACA T TA T GT GCC TC 51 T GC T GC GGT T TCCCCAA 3 结果与分析 52 GAA TACC T TC GTCA T GGC 3 . 1 液相芯片检测结果 53 T GTC TACA TA TAA T TCAAA GC 54 CAC GCA GGA TA GC T T TAA T 在 50 例标本中 ,检测出各种 HPV 亚型的阳性 55 TCA GTC TCCA TC TACAACA T 标本 26 例 , 检 出 率 为 52 % , 包 括 : HPV6 , 11 , 16 , 56 CA GAACA GT TAA GTAAA TA T G 31 ,33 , 39 , 43 , 52 , 58 等 . 其中单一亚型感染 20 例58 TA T GCAC T GAA GTAAC TAA G 占 40 % ,以 HPV16 ,11 ,6 型为主 ;多重感染 6 例占59 TC TAC TAC T GC T TC TA T TCC 12 % , 包 括 HPV6/ 33 , HPV11/ 35 , HPV6/ 16/ 58 , 61 CCCCCCC T GTA TC T GAA T () HPV16/ 33 , HPV16/ 43 , HPV11/ 16/ 52 图 1. 66 A GC TAAAA GCACA T TAAC TAA 68 3 . 2 反向点杂交检测结果C T GAA TCA GC T GTACCAA T 73 ACA GGC TA GTA GC TC TAC T 在 50 例标本中 ,检测出各种 HPV 亚型的阳性 83 TACACA GGC TAA T GAA TACA 标本 26 例 , 阳 性 占 有 率 为 52 %包 括 : HPV6 , 11 , 16 ,31 , 33 , 39 , 43 , 58 等 . 其中单一亚型感染 22 例 方法2 . 2 占 44 % ,以 HPV16 ,11 , 6 型为主 ,多重感染 4 例占 8 % , 包 括 HPV6/ 33 , HPV11/ 16 , HPV11/ 35 ,2 . 2 . 1 标本 DNA 提取 将漂洗过棉拭子的生理 第 5 期 刘思瑶等 :液相芯片技术在人乳头瘤病毒检测和分型中的应用 1113 HPV6/ 16/ 58 . . 反向点杂交检测出的两例 HPV16 的 重感染情况 单 重 感 染 , 在 液 相 芯 片 中 检 出 为 HPV16/ 33 、 3 . 3 两种方法检测结果的比较 HPV16/ 43 多重感染. 反向点杂交检测出 HPV11/ 液相 芯 片 法 检 测 的 50 例 标 本 中 阳 性 率 为 52 % ,与反向点杂交的阳性结果相同 ,但比反向点 16 的双重感染 ,而液相芯片则检出 HPV11/ 16/ 52 杂交具有更高的敏感性 ,能更有效的检测 HPV 多 三重感染. 图 1 HPV11/ 16/ 52 多重感染 Fig. 1 Multiple infectio n for HPV11/ 16/ 52 βNC 为阴性内对照 , PC 为 2glo bin 做阳性内对照 ,信号值 > 200 判定为阳性 进行分析 ,仪器通过两束激光分别识别编码微球和 结语4 检测微球上报告分子的荧光强度 ,分别对待测物进 4 液相芯片是基于 L uminex xMA P System 的技 行定性 、定量检测. 术平台开发的一种临床应用型生物芯片. 其原理是 液相芯片技术具有以下特点 : ?高通量 : 可以 μ把 5 . 6 m 的聚苯乙烯微球用两种荧光染料染色 , 同时对同一标本中多种不同的目的分子进行定性 调节两种荧光染料的比例可获得 100 种不同的微 和定量分析 ; ?高灵敏度 : 每个微球上都可以以共 球 ,每个微球具有特定的光谱地址. 然后将每种颜 价键结合的方式包被上许多抗原 、抗体或核酸. 因 色的微球经共价结合携带一种针对相应待测物的 ( ) ( 生物探针 如 : 抗原 、抗体 、核酸 、配体 、酶等. 图 为探针密度高 ,产生的信号强 ,加上使用荧光检测 , ) 2由于每种微球都有其特定的光谱地址 ,所以可在 所以敏感性大大提高 ; ?灵活性好 : 适用于各种蛋 一个反应管内同时完成多达 100 种不同的生物学 白质 、核酸分析 ,可以根据不同待测项目自行组合 ; 反应. 第三种荧光染料与报告分子结合可以量化发 ?反应快速 :由于杂交在悬浮的液相中进行 ,所以 生在微球表面的生物学反应. 最后用 L uminex100 反应需要时间短 ; 杂交后无需清洗可直接读数 ,能 5 大量节省时间 ; ?操作简便. 人乳头瘤病毒是一种小分子 DNA 双链病毒 , 具有强烈嗜上皮性 ,高度组织和宿主特异性 ,可致 人类 皮 肤 和 黏 膜 异 常 增 生 , 引 起 多 种 良 、恶 性 病 6 变. 由于 HPV 感染的潜伏期长 , 常见亚临床感 图 2 L uminex 检测原理 染 ,因此对 HPV 的快速准确和早期诊断对于预警 Fig. 2 The detectio n p rinciple of L uminex 癌变倾向 ,及时发现和预防 、治疗早期癌变具有重 要意义. 随着 HPV 的相关研究越来越深入 , 现在 HPV 疫苗的研究提供可靠的资料 ,具有重 调查及 已经有了很多用于 HPV 检测的方法 : ?直接探针 要的临床意义 . 法 ,如 : So ut her n 杂交和原位杂交 ; ?信号扩大法 , 参考文献 : ( ) 如 :第二代杂交捕获法 HC2检测 ; ?各种以 PCR 1 Par kin D M , Bray F I , Devesa S S. Cancer burden in 为基础的技术来进行目标扩增 ,再用直接测序 、限 7 t he year . The global pict ure J . Eur J Cancer , 2001 , 制性酶切分析或反向点杂交来进行分型. 然而 , ( ) 37 Suppl . 8: S4 . So ut her n 杂交法因不能达到临床检测所需的灵敏 U gozzoli L A. Multiplex assays wit h fluorescent mi2 2 度 ,操作麻烦 ,不易大规模临床使用. 原位杂交由于 crobead readout : a powerf ul tool for mutatio n detectio n 在杂交时的稳定性不高 ,使杂交率降低 ,影响 HPV J . Clin Chem , 2004 ,11 :1963 . 的检出率. HC2 的灵敏度和特异性均较好 ,但存在 3 Munoz N , Bosch F X , de Sanjose S , et al . Epidemio2 交叉污染 、费用昂贵等.logic classificatio n of human papillo mavirus types associ2 反向点杂交虽然也能在一个反应中同时检测 ated wit h cervical cancer J . N Engl J Med , 2003 , 不同 HPV 亚型 ,但它的敏感性不高. 另外 ,反向点 348 :518 . Dunbar S A. Applicatio ns of L uminex xMA P technolo2 4 杂交只能提供半定量结果 ,因为它是通过人为的观 8 gy for rapid , high2t hroughp ut multiplexed nucleic acid 察来判定结果. 而液相芯片技术是一个高通量 detectio n J . Clin Chim Acta , 2006 :363 . 的检测方法 ,能快速 、简便的对所有生殖道致病的 Martins T B , Burlingame R , vo n Muhlen C A , et al . 5 HPV 亚型进行分型 ,并得到定量结果. 它能一次检 Evaluatio n of multiplexed fluorescent microsp here im2 测 26 种 HPV 的亚型 , 具有高度的敏感性和特异 munoassay for detectio n of autoantibodies to nuclear 性 ,并且还能节约检测成本和检测时间 . 液相芯片 ( ) antigens J . Clin Diagn L ab Immun , 2004 , 11 6 : 对 HPV 分型检测的定量数据可以使研究人员估 1054 . 算 PCR 扩增产物的数量. 并能够在 2 . 5 h 内快速 、 Heley S. Human papillo mavirus : beware t he infectio n 6 () you can’t see J . Aust Fam Physician , 2003 , 32 5: 简便且具有高重复性的分析近 100 份临床标本的 311 . PCR 产物. 对大量标本进行流行病学及 HPV 疫苗 Schmit t M , Bravo I G , Snijders P J F , et al . Bead2 7 的研究都能在短时间内完成. 这个技术的另一优点 based multiplex genot yping of human papillo maviruses 在于从 DNA 样品的制备到 PCR 扩增 ,杂交及最后 () J . J Clin Microbiol , 2006 ,44 2:504 . 的检测都是自动化的. 而且检测成本和费用也相对 van den Brule A J , Pol R , Fransen2Daalmeijer N , et 8 便宜. al . GP5 + / 6 + PCR followed by reverse line blot analy2 综上所述 , 液相芯片 用 于 HPV 分 型 检 测 , 在 sis enables rapid and high2t hroughp ut identificatio n of 检出率和特异性方面均显著高于传统的检测方法 . human papillo mavirus genot ypes J . J Clin Microbiol , 它不仅可以进行临床筛查 ,还对大范围的流行病学 () 2002 ,40 3:779 .